高灵敏黄曲霉毒素B1免疫层析定量检测法的建立

以胶体金为标记物,借助于胶体金读取仪,建立了高灵敏的定量检测黄曲霉毒素B_1的胶体金免疫层析方法。试纸条制备时,当标记溶液pH为6.0,检测线全抗原的使用浓度为1.5mg/mL,金标抗体浓度为4μg/mL、用量为1.2μL时,所建立方法的灵敏度为5.7ng/L。通过加速保存试验,结果显示该试纸条的保存期大于1年。该试纸条应用于实际谷物及酱油加标样本检测,证明该方法可满足食品快速检测的需要。     

呋喃它酮代谢物5-甲基吗啉-3-氨基-2-恶唑烷酮单克隆抗体的制备、鉴定与胶体金免疫层析试纸条的研制

目的:制备5-甲基吗啉-3-氨基-2-恶唑烷酮(AMOZ)单克隆抗体,并建立AMOZ胶体金试纸条检测方法.方法:AMOZ与对醛基苯甲酸反应生成半抗原CP-AMOZ,将CP-AMOZ与BSA、OVA偶联制备完全抗原.免疫小鼠后制备腹水型抗体,ELISA检测抗体效价与其对CP-AMOZ半抑制浓度(IC50)和最低检测限(LOD),并检测抗体的特异性.胶体金与单抗偶联,同时在NC膜上包被完全抗原、兔抗鼠多抗分别作为检测线和质控线,制备免疫层析试纸条,测定试纸条的灵敏度与特异性.结果:成功制备CP-AMOZ-BSA、CP-AMOZ-OVA完全抗原及抗CP-AMOZ的单抗,抗体效价为1∶1.6×105,对CP-AMOZ IC50为0.86μg/L,LOD 0.07 μg/L,与其他硝基呋喃类药物代谢物及其衍生物均无交叉反应.制备的胶体金试纸条灵敏度5 μg/L.结论:成功合成了CP-AMOZ的完全抗原,免疫小鼠后制备了特异性强的单抗,并以此为基础研制出敏感、特异的胶体金快速检测试纸条.     

胶体金试纸条法快速筛查小麦和玉米中脱氧雪腐镰刀菌烯醇的研究

以抗脱氧雪腐镰刀菌烯醇(Deoxynivalenol,DON)单克隆抗体为基础,建立了胶体金免疫层析试纸条检测方法,用于小麦和玉米中DON的快速检测。采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金,标记抗DON单抗并喷于玻璃纤维垫上,DON-BSA和驴抗鼠二抗均匀划于NC膜上检测线和质控线位置,依次将样本垫、结合垫、NC膜和吸水纸组装切割成试纸条并装入检测卡中。测试结果表明:该胶体金试纸条对纯标准品和人工污染样品的检测灵敏度分别为100μg/kg和500μg/kg,与除15-乙酰脱氧雪腐镰刀菌烯醇外的21种生物毒素均无交叉反应,重复性和稳定性均良好,对实际样品的检测结果与液相色谱串联三重四级杆质谱(LC-MS/MS)比对结果相符。该检测方法非常适合用于现场的快速筛查,具有良好的应用前景。     

莱克多巴胺荧光微球免疫层析检测方法的建立

以荧光微球作为新型标记物,采用EDC法进行偶联,制备莱克多巴胺抗体荧光微球复合物,复合物粒度均一、性质稳定,并以之为探针建立莱克多巴胺荧光微球免疫层析检测方法,检测限为2.5ng/mL,且特异性强、检测范围宽。与胶体金免疫层析方法相比,荧光微球免疫层析方法的灵敏度更高,新型的荧光微球可以提高免疫层析方法的灵敏度。     

基于单克隆抗体的胶体金免疫层析法快速检测丁香酚

目的 采用免疫层析技术对丁香酚残留的胶体金免疫层析快速检测试纸条的制备开展研究。方法 用柠檬酸三钠还原法制备胶体金纳米颗粒, 标记丁香酚单克隆抗体得到胶体金-丁香酚单克隆抗体复合物。以硝化纤维素膜为固相载体, 包被丁香酚-BSA偶联物为检测带(T带), 羊抗鼠IgG为质控带(C带), 建立了丁香酚的胶体金免疫层析快速检测试纸条。结果 胶体金免疫层析试纸条具有较高的灵敏度和特异性, 检出限为2.0 mg/L。结论 本研究所开发的胶体金免疫层析试纸条可作为快速测定丁香酚的可靠、低成本的方法。     

同时检测伏马菌素B1和呕吐毒素的通用探针免疫层析卡研究

摘要 ：目的：研发同时检测伏马菌素B1(fumonisin B1, FB1)和呕吐毒素(deoxynivalenol, DON)的通用探针免疫层析卡。方法：通过标记物修饰在融合真菌毒素模拟表位的甘露糖结合蛋白(mannose binding protein, MBP)制备双功能抗原,引导针对标记物抗体的量子点微球通用探针,与检测线上的毒素抗体形成“夹心免疫复合物”,从而产生检测信号。 结果 标记物对MBP的反应摩尔比3.0/1.0,所制备的2种双功能抗原具有最优的双抗体结合活性。“毒素抗体/双功能抗原/通用探针”免疫复合物在2条检测线（T线）都形成荧光信号;只需调整2种毒素抗体的点阵浓度,FB1和DON的T线完全抑制的阈值统一优化为 预定的5.0 ng/mL。结论：基于双功能抗原引导的通用探针的免疫层析卡, 避免了分别制备单一特异性探针的繁琐,各T线检测阈值优化过程简便, 适合真菌毒素多残留检测免疫层析试剂的标准化制备。     

铅胶体金免疫层析试纸条研制及其在小龙虾中的应用

目的 利用胶体金免疫层析技术对重金属铅检测试纸条进行研制,并探究其在小龙虾样品中的应用。方法 使用胶体金和重金属铅单克隆抗体制备免疫探针。优化反应体系,构建重金属铅免疫层析检测试纸条。验证该试纸条的检测限、特异性、准确性和稳定性,并对小龙虾样品进行检测。结果 所研制的重金属铅胶体金免疫层析试纸条的检测限为6 ng/mL,检测时间为15 min。该试纸条可特异性识别铅,而对其他常见重金属无交叉反应。结论 本实验研制的试纸条性能良好,能够准确判定小龙虾中重金属铅是否超标。     

荧光免疫层析法结合免疫磁珠分离技术快速检测单增李斯特菌

为建立单增李斯特菌简单快速、灵敏度高和特异性强的检测方法,本研究以抗单增李斯特菌单克隆抗体偶联磁珠制备免疫磁珠;以羧基荧光微球标记的抗单增李斯特菌多克隆抗体及鼠IgG为标记抗体,抗单增李斯特菌多克隆抗体和羊抗鼠二抗分别作为检测线和质控线制备荧光免疫层析试纸条。将免疫磁珠分离与荧光免疫层析法相结合应用于单增李斯特菌的现场快速检测中。结果表明:荧光免疫层析试纸条对纯培养单增李斯特菌的检测限为4×105CFU/mL,联合检测方法10倍、100倍浓缩时,检测限分别为4×104CFU/mL和1×104CFU/mL。联合检测体系特异性较好,与实验室保存的10株细菌无交叉反应。人工污染样本检测限为1×104CFU/mL,同纯培养物相比检测灵敏度并没有降低。本方法的建立对于食品中单增李斯特菌的现场快速检测具有重要意义。     

苯甲酸免疫胶体金快速检测试纸条的研制

应用胶体金免疫层析技术,制备苯甲酸胶体金免疫层析快速检测试纸条,采用柠檬酸三钠还原法制备颗粒直径为17nm的胶体金,将苯甲酸金标抗体喷涂在玻璃纤维垫上制成胶体金结合垫,将包被抗原和二抗羊抗兔分别结合于硝酸纤维膜作为检测线(T线)和质控线(C线),组装成胶体金免疫层析试纸条并进行灵敏度测试.结果显示,胶体金试纸条检测限为100μg/L,可在5～7min内完成测试,与苯酚、甲苯、苯乙酸、苯丙氨酸等药物均无交叉反应,检测结果与酶联免疫吸附法完全一致.该方法具有操作简便、快速、特异性强、灵敏度高等特点,适用于现场快速检测和筛选工作,具有广泛的商业开发应用前景.     

雌二醇单克隆抗体制备及胶体金侧流层析免疫分析方法的建立

目的 建立一种牛奶中雌二醇(17β-estradiol, E2)胶体金(colloidal gold, CG)试纸条快速检测方法。方法 从E2的3号位羟基和17号位羟基引入活性基团制备半抗原H1和H2, 偶联载体蛋白制备完全抗原, 经过动物免疫和细胞融合筛选, 制备单克隆抗体, 采用间接竞争酶联免疫吸附实验(indirect competitive enzyme-linked immunosorbent assay, icELISA)对单克隆抗体性能进行评估, 筛选出灵敏度最高的单克隆抗体, 最后采用静电吸附法将胶体金标记抗体为探针, 构建牛奶中E2的胶体金试纸条检测方法。结果 制备了H1-7B7、H1-9C7、H2-4A10、H2-2E2 4种单克隆抗体, 经过评估, 选取H1-9C7和H2-OVA作为最优抗体及抗原, 建立的胶体金试纸条消线(cut-off)值为6.00 ng/mL, 半数抑制浓度(half maximal inhibitory concentration, IC50)为1.54 ng/mL, 与苯甲酸雌二醇和雌三醇的交叉反应率分别为101.31%和2.43%。结论 本研究建立的试纸条具有操作简单、灵敏度高等特点, 能够基本满足牛奶中E2快速检测要求。     

牛奶样品中志贺氏菌胶体金免疫试纸条检测方法的建立

通过用超声波破碎的宋内氏志贺氏菌和福氏志贺氏菌的菌体碎片为免疫原免疫BALB/c小鼠,获得4株能稳定分泌抗志贺氏菌单克隆抗体的杂交瘤细胞株,选取其中一株制备单抗,并用胶体金标记。同时抗志贺氏菌的兔多抗和驴抗鼠抗体(二抗)分别喷涂于硝酸纤维素膜作为检测线(T线)和质控线(C线),研制了志贺氏菌胶体金快速检测试纸条。结果显示试纸条的灵敏度为105mL-1,并只与两株志贺氏菌有阳性反应外,而与其它23株常见的细菌无交叉反应。同时在检测添加有阪崎肠杆菌和长双歧杆菌的牛奶样品中,结果显示试纸条的灵敏度为106mL-1。志贺氏菌免疫胶体金试纸条的建立,为加强食品中志贺氏菌的检测工作,建立一种快速、简便的筛查方法具有重要的意义。     

基于噬菌体展示纳米抗体的绿色免疫PCR检测脱氧雪腐镰刀菌烯醇

目的：在获得脱氧雪腐镰刀菌烯醇（deoxynivalenol,DON）抗独特型纳米抗体的前期基础上,将纳米抗体作为酶标抗原的替代物,应用于荧光定量免疫聚合酶链式反应（polymerase chain reaction,PCR）体系,实现DON的高灵敏、绿色免疫分析。方法：将特异性结合DON抗体的噬菌体展示纳米抗体（P-28）作为竞争抗原,以编码P-28纳米抗体的DNA为靶标,设计特异性PCR扩增引物,优化荧光定量免疫PCR退火温度、抗DON抗体浓度、P-28投入量等参数,建立基于间接竞争模式的荧光定量免疫PCR检测DON的方法。结果：本研究建立的荧光定量免疫PCR方法线性检测范围为0.1～1 000 ng/mL,IC50值为（3.96±2.21）ng/mL,最低检出限为0.048 ng/mL,并与其他真菌毒素无交叉反应。结论：该方法直接使用噬菌体展示纳米抗体作为竞争抗原的替代物,应用于免疫PCR体系,避免了使用传统的化学合成酶标抗原所带来的环境污染、操作毒性等缺陷,并具有良好的特异性及灵敏度。     

除草剂扑草净胶体金免疫层析检测试纸条的研制

制备了扑草净胶体金免疫层析检测试纸条,建立了水样中扑草净的快速检测方法.采用柠檬酸三钠还原氯金酸法制备胶体金,对胶体金免疫层析方法的工作条件(NC膜的封闭条件、金标垫的处理方法)进行优化.最终建立的方法检出限为5 ng/mL,5min内可以通过目测进行结果判断.河水样品不需要任何处理可以直接进行检测,检出限为5 ng/mL.本研究建立的快速免疫检测方法适用于水中扑草净残留的现场检测.     

胶体金免疫层析法快速检测果蔬中的三唑酮及其代谢物残留

目的 建立胶体金免疫层析法快速检测蔬菜水果中三唑酮及其代谢物农药残留的分析方法。方法 采用胶体金标记三唑酮单克隆抗体, 利用胶体金的可视化及抗体与抗原的特异性结合, 实现对果蔬中三唑酮农药残留的定性和半定量检测。结果 本方法对黄瓜和香蕉中三唑酮及其代谢物的总残留量检出限分别为0.05和0.85 mg/kg, 均低于国家标准食品中三唑酮农药最大残留限量(0.1~1 mg/kg), 该试纸条对其他农药无交叉反应, 重复性良好。结论 该方法具有高灵敏度、高特异性, 可快速准确的检测大批量样品中的三唑酮及其代谢物农药残留, 能够满足应急超标事件的现场检测需求。     

玉米赤霉烯酮时间分辨荧光试纸条的制备及特性研究（网络首发、推荐阅读）

研究制备一种基于时间分辨荧光免疫层析法的玉米赤霉烯酮（ZEN）快速定量检测试纸条。采用铕纳米微球作为荧光探针,标记抗ZEN的单克隆抗体,应用竞争抑制原理建立免疫层析定量方法并对其进行方法学考核。结果表明：ZEN荧光试纸条的灵敏度为0.1 ng/mL,线性范围为0.1~5.0 ng/mL,玉米、小麦阴性样品的加标回收率在93.45%~112.20%之间,对于同一个样品5次重复测定的变异系数小于15%。ZEN快速定量检测试纸条具有灵敏度高、反应时间短、准确定量、稳定性好等技术特点,适用于谷物及制品中玉米赤霉烯酮的快速定量检测。     

时间分辨荧光免疫层析法定量检测谷物中黄曲霉毒素B1和玉米赤霉烯酮残留

建立了一种快速定量检测谷物产品中黄曲霉毒素(Aflatoxin B1,AFB1)和玉米赤霉烯酮(Zearalenone,ZEN)的时间分辨荧光免疫层析方法。采用时间分辨荧光微球标记黄曲霉毒素B1抗体和玉米赤霉烯酮抗体,研究了如p H值、标记抗体浓度、荧光探针使用量、检测T线包被原浓度、质控C线羊抗鼠Ig G浓度、样品前处理方法等因素对时间分辨荧光免疫层析方法灵敏度的影响。结果表明:AFB1的检出限为0.80 ng/mL,线性范围(IC20~IC80)为0.81~5.67 ng/mL,半抑制浓度(IC50)为2.15 ng/mL。在ZEN检出限为4.58 ng/mL,线性范围(IC20~IC80)为4.76~85.60 ng/mL,半抑制浓度(IC50)为20.19 ng/mL。方法特异性良好,与T-2毒素、脱氧雪腐镰刀菌烯醇、伏马毒素、赭曲霉毒素A多种真菌毒素交叉率小于10%。通过选择玉米、麦麸、大豆、小麦进行添加回收试验,AFB1的添加回收率在97.1%~108.7%之间,ZEN的添加回收率在92.8%~109.1%之间,相对标准偏差小于15%。选取经HPLC-MS/MS检测过的FAPAS标准质控样本进行测试,检测结果与其结果一致。在实际产品检测对比中,与市售胶体金免疫层析卡,ELISA试剂盒的检测结果基本一致。本方法操作简单快速、可定量,检测过程约25 min,适用于谷物样品中黄曲霉毒素B1和玉米赤霉烯酮的现场快速筛。     

胶体金免疫层析试纸条快速检测水和玉米中阿特拉津的残留

本文以胶体金作为抗体标记物,建立了一种检测阿特拉津残留的免疫层析试纸条快速检测方法.该方法的检出限为2ng/mL,10min内可以得到检测结果.本文以自来水和玉米作为样品进行了添加回收实验,水样不需要任何前处理直接检测,水样的检出限为2 ng/mL;玉米样品经简单前处理后检测,玉米样品的检出限为40 ng/g,且该方法的检测结果与间接竞争ELISA方法的结果一致.该方法具有成本低、操作简单、灵敏度高、检测快速,结果易于判定等优点,适用于大量样品的现场筛选.     

呕吐毒素时间分辨荧光免疫层析法的建立与评价

构建并评价了呕吐毒素(Deoxynivalenol,DON)时间分辨荧光免疫层析法(TRFIA)。以Eu3+螯合物的纳米微球为荧光探针标记抗DON单抗,采用竞争抑制建立免疫层析定量方法,优化了微球与抗体标记量,检测的环境温度、反应时间、加样体积及缓冲体系;研究了方法的灵敏度、精密度及准确度。结果表明,每100 μL荧光微球结合纯单抗50 μg,最佳划膜浓度为1.0 mg/mL,最佳测定条件为室温(25±2)℃,10 min,加样体积100 μL,PBS (0.01 mol/L,pH7.2)的缓冲体系,方法的灵敏度为0.25 ng/mL,线性范围为0.5~25.0 ng/mL,玉米、小麦阴性样本(加标浓度200、500、1000、2000 μg/kg)平均加标回收率为91.4%~109.3%,6种典型样本经TRFIA与免疫亲和净化-高效液相色谱法(IAC-HPLC)同时测定DON含量,相关系数r达0.9754。TRFIA具有灵敏度高、速度快、定量准等技术特点,适用于谷物及制品中DON的快速定量。     

Advantage of Eu3+‐Doped Polystyrene Microspheres Compared with Colloidal Gold Used in Immunochromatographic Assays for the Detection of Melamine in Milk

Colloidal gold and Eu³⁺‐doped fluorescent microspheres were applied as labels to develop the immunochromatographic strips for detecting melamine in milk. Under the optimized condition, the visual detection limit of colloidal gold‐immunochromatographic test strip (ICTS) was 150 μg/L of melamine in phosphate‐buffered saline (PBS), although the visual detection limit of fluorescent nanoparticles (FN)‐ICTS was 75 μg/L in PBS. As thermal acceleration test, FN‐ICTS could be stored at 37 °C for at least 11 d before sample testing, but the color of the lines on colloidal gold‐ICTS faded away after 7‐d storage. The visual result of FN‐ICTS was more stable than that of colloidal gold‐ICTS, and the fluorescence intensity of the line on FN‐ICTS could be maintained up to 30 d at 22 °C after sample testing. Once the immunochromatographic strips were used to detect melamine in milk, no negative effect of milk components on the performance of FN‐ICTS was identified, whereas the performance of colloidal gold‐ICTS was significantly influenced by milk matrix.     

胶体金试纸条同时检测鲤鱼中7种苯并咪唑类药物的残留

为检测鲤鱼中苯并咪唑类药物残留,降低其对人体造成的危害,本文基于单克隆抗体之上建立胶体金试纸条检测方法。首先以2-甲氧基羰基氨基-3H-苯并咪唑-5-羧酸为半抗原,用活化酯法偶联蛋白质制备免疫原,免疫小鼠,进行细胞融合制备单克隆抗体,而后用合成的胶体金标记单克隆抗体制备胶体金试纸条。通过间接竞争ELSIA法(ic-ELISA)测得阿苯达唑、甲苯咪唑、阿苯达唑亚砜、阿苯达唑砜、芬苯达唑、氟苯咪唑、奥芬达唑的半抑制浓度(IC50)分别为0.44、0.16、3.47、5.62、0.62、0.10、5.77 ng/mL。胶体金试纸条在鲤鱼中的阿苯达唑、甲苯咪唑、阿苯达唑亚砜、阿苯达唑砜、芬苯达唑、氟苯咪唑、奥芬达唑的检测限分别为4、2、50、100、10、1、100 ng/g,检测时间为15 min。因此,该方法灵敏度高、成本低、速度快且无需仪器辅助,适宜现场大量鲤鱼样本的快速检测。