酸性蛋白酶基因Asp在红曲霉中的同源表达及序列分析

从红曲霉基因组中扩增出酸性蛋白酶基因Asp的编码区,构建其同源表达载体p BC-Hygro-Asp并导入到农杆菌GV3101备用。利用根癌农杆菌介导法将重组质粒导入红曲霉,并筛选获得Asp基因同源重组转化子,实现了酸性蛋白酶基因在红曲霉中的同源表达。转化子中酸性蛋白酶基因表达量是野生型菌株的3.30倍,能达到高产酸性蛋白酶的目的。对红曲霉酸性蛋白酶基因序列进行分析,结果显示该基因产物有两个天冬氨酸蛋白酶活性位点,为亲水性分泌蛋白,不参与信号转导,且与赤曲霉酸性蛋白酶有相同进化速率。     

Bacillus sphaericus DS11蛋白酶基因osp在Bacillus subtilis的异源表达及酶学性质研究

将Bacillus sphaericus 2297蛋白酶基因osp在Bacillus subtilis WB800异源表达,并进行纯化和酶学性质研究。以Bacillus sphaericus DS11基因组DNA为模板,扩增osp基因,构建重组质粒pMA0911-His_6-osp,重组质粒转化Bacillus subtilis WB800获得重组表达菌株Bacillus subtilis WB800-pMA0911-His_6-osp。利用镍离子柱亲和层析纯化重组酶至电泳纯。重组酶最适催化温度和pH值分别为40℃和pH 8.0,在20℃～30℃下保温10 h保持80%以上酶活力,在pH 7.0～9.0处理24 h保持60%以上酶活力;Sr~(2+)、K~+、Mg~(2+)对酶活有促进作用,Fe~(3+)、Ba~(2+)、Ca~(2+)对酶活有抑制作用;重组蛋白酶在极性常数为0.8～3.1的有机溶剂中孵育6 d后保持53%以上的酶活力。     

葡萄糖氧化酶基因在黑曲霉中的分泌表达

通过PCR扩增从一株葡萄糖氧化酶生产菌黑曲霉中克隆得到1818bp葡萄糖氧化酶基因GOD,将GOD基因与糖化酶基因的5’同源臂、3’同源臂进行重叠延伸,构建葡萄糖氧化酶基因的表达框。将此表达框插入载体pSZH中,构建黑曲霉同源重组表达载体pSZH-GOD。将载体pSZH-GOD通过冻融法转化农杆菌AGL1,进而通过农杆菌介导法转化高产糖化酶的黑曲霉。经潮霉素筛选和PCR鉴定获得8株重组菌株。对8株重组菌株的发酵液上清液进行酶活测定,结果表明葡萄糖氧化酶基因在高产糖化酶的黑曲霉中得到了分泌表达,静置培养6d后其分泌表达的葡萄糖氧化酶酶活最高可达1.166U/mL,而在出发菌株中检测不到葡萄糖氧化酶的分泌表达。同时,重组菌株胞内表达的葡萄糖氧化酶最高酶活可达11.45U/mL,是出发菌株的266倍。此研究结果为简化葡萄糖氧化酶发酵生产工艺、提高酶产量提供了新的途径。     

黑曲霉SH-2基因组中注释的7个α-葡萄糖苷酶基因的鉴定与表达分析

已公布的黑曲霉CBS513.88基因组中注释了7个α-葡萄糖苷酶基因信息,但其中主要高活性基因一直未报道。本文通过同源重组构建了黑曲霉SH-2菌株7个α-葡萄糖苷酶基因的系列多重敲除株。α-葡萄糖苷酶活性测定结果显示仅agdB敲除株的酶活相较于野生株SH-2降低36%,而其余多重敲除株菌株酶活影响较小。以敲除糖化酶、淀粉酶背景的黑曲霉SH-2-3菌株为宿主,分别敲除和过量表达基因agdB及与已报道的黑曲霉α-葡萄糖苷酶基因序列相似度最高的基因agdA,结果显示agdB敲除株生长速度在不含葡萄糖的培养条件下最慢,并随着葡萄糖添加量增加;agdB过量表达株酶活提高到野生型的10倍。本研究结果说明目前黑曲霉SH-2基因组中所注释的7个α-葡萄糖苷酶基因中仅agdB为主要高活性α-葡萄糖苷酶基因（占总体酶活36%）,黑曲霉SH-2中α-葡萄糖苷酶基因仍需进一步探索。     

清香型小曲白酒生产中红曲霉的分离及发酵特性研究

研究采用培养组学首次从清香型小曲白酒绿衣观音土曲和酒醅中分离出9株红曲霉,经形态学和分子生物学分析鉴定为7株紫色红曲霉和2株红色红曲霉。进一步通过耐受性实验发现,该批红曲霉最适pH值为4～5,最低可耐受p H值为3,最高可耐受乙醇浓度为25%vol,以及最适温度为30～35℃。同时,对9株红曲霉制成的红曲米糖化酶活、蛋白酶活和酯化力进行了检测,结果发现红曲T4蛋白酶活最高,红曲M2糖化酶活最高,红曲T2的酯化力最高。本研究阐明了清香型小曲白酒生产中红曲霉种类及发酵特性信息,为下步红曲霉的应用提供了理论依据。     

黑曲霉酸性蛋白酶EXPA的克隆表达与酶学性质解析

酸性蛋白酶在食品、酿造、饲料和皮革等行业具有重要的应用价值。然而,现有的酸性蛋白酶在50℃以上或pH 3. 0时不稳定,限制了其应用范围。该研究通过分子克隆技术将黑曲霉CICIM F0510的酸性蛋白酶基因exp A在毕赤酵母中进行了克隆表达,构建获得了重组菌GS115 (p PIC-expA)。摇瓶发酵条件下,重组酶EXPA的酶活为257 380 RFU/h。生物信息学分析的结果显示,该酶属于天冬氨酸蛋白酶A1A家族。酶学性质的研究表明,该重组酶的最适反应温度和pH分别为50℃和3. 0;分别在40～50℃或pH 2. 5～3. 5孵育1 h后,仍能保留80%左右的活力。Zn~(2+)、Ca~(2+)、Fe~(2+)和Mn~(2+)对其活性有一定的促进作用;而Cu~(2+)、Co~(2+)、Fe~(3+)、EDTA和SDS则对其活性有显著的抑制作用。此外,重组酶EXPA对大豆分离蛋白、水溶性玉米蛋白和小麦水解蛋白均具有较好的水解作用。较好的耐热性和pH稳定性为EXPA在食品、饲料等领域的应用奠定了基础。     

黄曲霉寡聚-1,6-葡萄糖苷酶基因的克隆及其在工业酿酒酵母CICC1346中的表达

通过重叠延伸PCR(gene splicing by overlap extension,SOE-PCR)扩增黄曲霉寡聚-1,6-葡萄糖苷酶基因和酿酒酵母α-信号肽序列,定向重组到整合型表达载体pδRCMB中,并在CICC1346中实现分泌表达;然后通过同源建模、利用分子模拟软件Discovery Studio 4.1分析其蛋白结构,以对硝基苯-α-D-葡萄糖吡喃苷(pNPG)为底物,建立并确定酶活反应条件,并进行纯化、酶学性质分析;将密码子优化后序列在CICC1346中实现分泌表达,利用淀粉进行共发酵实验。结果显示:重组酶突变后相对野生型蛋白结构无影响。SDS-PAGE分析重组重组酶大小约为70 kDa;优化后最高酶活达到0.69 U/m L,重组酶最适pH为6.5,在pH4.5.0~7.0维持90%以上的酶活;最适温度为40℃,在30~40℃维持接近100%的酶活;受Cu~(2+)和Mn~(2+)严格抑制;寡聚-1,6-葡萄糖苷酶与α-淀粉酶及糖化酶协同利用淀粉产乙醇,提高淀粉水解效率。这是首次报道黄曲霉的寡聚-1,6-葡萄糖苷酶基因在酿酒酵母整合型分泌表达。     

根癌农杆菌介导酸性蛋白酶在泡盛曲霉中表达的研究

利用Gateway克隆技术快速构建丝状真菌表达载体,以米曲霉α-淀粉酶A启动子(amyB)、α-糖苷酶终止子(agdA)及黑曲霉酸性蛋白酶基因(pepA)分别构建入门载体,以带有潮霉素抗性标记(hygB)的农杆菌双元载体pHGW为目的载体,通过LR连接反应,构建根癌农杆菌介导丝状真菌重组表达载体pHGW-apA。转化泡盛曲霉宿主菌,筛选的转化子经传代培养确定其遗传稳定性,PCR及测序分析表明,hygB和目的基因pepA整合到了泡盛曲霉基因组。转录水平上的RealTime-PCR定量分析、表达水平上的Western Blotting分析以及培养液酶活分析表明酸性蛋白酶基因pepA在泡盛曲霉中得到正确表达。为丝状真菌表达载体快速构建与外源基因在丝状真菌中快速表达提供了可行的方法。     

不同菌种制备酱油大曲生产酶系特性及其耐盐性的比较

采用4株米曲霉菌种(j2、y2、x42、x72)与对照米曲霉菌株(沪酿3.042)制备大曲,探究其所产中性蛋白酶、酸性蛋白酶、α-淀粉酶以及糖化酶在盐浓度为0%、5%、10%、15%、20%下酶活力变化。实验结果表明,5株菌株所产酶系中,中性蛋白酶活随盐水浓度的增加显著(P<0.05)下降,酸性蛋白酶和糖化酶在5%盐浓度下活力显著下降(P<0.05),随后酶活力下降速率减慢,α-淀粉酶在5%的盐浓度下无显著下降(P>0.05),随后下降速率加快。此外,相同盐浓度下淀粉酶比蛋白酶更稳定,5株米曲霉菌株的α-淀粉酶和糖化酶在20%的盐浓度下残留率均达到50%。菌株y2、j2所产中性蛋白酶和菌株x72所产酸性蛋白酶的耐盐性优于对照菌株。     

几株米曲霉成曲胞外蛋白鉴定及发酵结果分析

采用SDS-PAGE电泳和MALDI-TOF-MS技术,鉴定4株米曲霉成曲胞外蛋白表达量最高的4种蛋白,其中2种确定为淀粉酶和碱性蛋白酶,这2种酶在4株米曲霉成曲胞外蛋白中的表达量和都超过胞外蛋白总量的50%,但不同菌株间淀粉酶与碱性蛋白酶表达量比例不同。同时分析蛋白电泳凝胶酶蛋白表达量、酶活与发酵结果的关系,结果表明酶蛋白表达量与酶活力具有较好的一致性。蛋白酶活力低的菌株发酵氨基酸态氮水平并不低,淀粉酶高的菌株发酵生成还原糖较低。     

米曲霉和乳酸菌混合制曲对小麦大曲制曲效果的影响

本文研究了米曲霉和乳酸菌混合制曲(KR)及米曲霉单独制曲(KP)条件下,小麦大曲中菌落总数、中性蛋白酶活力、酸性蛋白酶活力、总酸以及发酵液品质,探讨了多菌种制曲的可行性,以期为高品质小麦基调味料的生产提供理论指导。研究结果表明:KR工艺中小麦大曲的乳酸菌和霉菌均繁殖良好,12 h时乳酸菌达到了4.15×108 cfu/g,乳酸菌的繁殖对霉菌的生长有一定的抑制效果;米曲霉和乳酸菌混合制曲比米曲霉单独接种制曲效果好,制曲48 h时,KR工艺所得到的大曲中性和酸性蛋白酶与米曲霉纯种制曲相比,分别提高了22.79%和22.26%;KR大曲发酵液的全氮含量、氨基酸态氮含量均高于KP工艺,发酵60 d时KR发酵液的游离氨基酸含量高于KP,其中谷氨酸含量明显提高,对比KP工艺提高了24.21%,具有更明显的鲜味口感。     

黑曲霉糖化酶基因在荧光假单胞菌中的表达

黑曲霉糖化酶基因cDNA按正确的读码框架克隆到广宿主表达载体pBBR1MCS-2,构建出含黑曲霉糖化酶基因的表达载体pBBR1MCS-2GA,用三亲和接合转化法将重组质粒导入2-酮基-D-葡萄糖酸高产菌株荧光假单胞菌AR4。得到重组菌ARW4,经SDS-PAGE凝胶电泳和Westernblot分析显示,黑曲霉糖化酶基因在ARW4中得到表达,表达产物主要以不溶性包涵体形式存在。     

从自然发酵小麦酱中筛选曲霉及制曲工艺研究

从自然发酵的小麦酱中分离得到4株黄曲霉（Aspergillus flavus）和2株黑曲霉（Aspergillus niger）,对其进行生理效价分析,结果表明,黄曲霉4号产糖化型淀粉酶和蛋白酶能力最强,且具有较强的产α-淀粉酶和酯化酶的能力,适合作为小麦酱制曲的发酵菌株。对其制曲工艺进行优化,结果表明,在接种量为4%,制曲温度为32 ℃,制曲时间为70 h的条件下,小麦曲的蛋白酶酶活力为549 U/g,较自然发酵制曲的481 U/g有较大提高。     

米曲霉液态发酵香菇残次品产蛋白酶条件优化

为了充分综合利用香菇资源，该研究以米曲霉（Aspergillus oryzae）为发酵菌种，对香菇残次品进行液态发酵，以蛋白酶活为响应值，采用单因素试验和响应面法优化米曲霉产蛋白酶发酵条件。结果表明，米曲霉产蛋白酶的最优发酵条件为发酵时间3 d、料液比1∶10（g∶mL）、初始pH值6.5、转速175 r/min，在此优化条件下，蛋白酶活力为1 182.48 U/mL。     

高产高纯度脯氨酰内肽酶黑曲霉工程菌的构建

利用基因工程技术,构建过表达黑曲霉来源带有自身信号肽的脯氨酰内肽酶黑曲霉重组菌株TH2-protAS和过表达以黑曲霉内源高效分泌的葡糖淀粉酶信号肽以及α-淀粉酶信号肽代替自身信号肽的脯氨酰内肽酶黑曲霉重组菌株TH2-SglaA-protA和TH2-SamyA-protA。SDS-PAGE结果显示,脯氨酰内肽酶在重组菌株中分泌表达,但是存在不同程度的糖基化。酶活检测结果表明,重组菌株TH2-protAS、TH2-SglaA-protA和TH2-SamyA-protA的最高酶活分别为1.70、2.19、1.91 U/mL。在重组菌株TH2-SglaA-protA的基础上,利用基因敲除技术,敲除了主要的背景蛋白酸稳定的α-淀粉酶,结合发酵条件优化,获得了高纯度的脯氨酰内肽酶。综合上述结果可得出结论:可在黑曲霉中同源高效分泌表达脯氨酰内肽酶;glaA信号肽和amyA信号肽明显增加黑曲霉中脯氨酰内肽酶的分泌表达量,且glaA信号肽的效果优于amyA信号肽;将基因敲除和发酵调控相结合,可以有效去除分泌的背景蛋白,获得高产高纯度脯氨酰内肽酶的菌株,该重组菌株具有明确的工业应用潜力。     

多聚半乳糖醛酸酶在黑曲霉中的超量表达及其酶学性质研究

运用基因工程手段,构建高效表达多聚半乳糖醛酸酶的黑曲霉重组菌株,并对重组酶活性及酶学性质进行研究,以期更好的实现多聚半乳糖醛酸酶在食品加工、饲料生产及废水处理中的重要作用。从果胶酶生产菌黑曲霉GJ-1中扩增得到多聚半乳糖醛酸酶基因pgaB的成熟肽编码序列(1232 bp),集成glaA多拷贝强启动子和信号肽,构建其黑曲霉表达载体pSZHG6RS-pgaB,通过农杆菌介导法转化黑曲霉,获得多聚半乳糖醛酸酶黑曲霉重组菌株。聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)检测结果表明,目的蛋白大小约为38 kDa;在发酵第10 d时酶活最高达到4617.8 U·mL-1。酶学性质研究表明,最适温度为50℃,高温时热稳定性较差;最适pH为5.0,碱性耐受能力较强;Ca2+、Fe3+、Fe2+均对重组酶有一定激活作用;重组酶对不同底物的催化能力不同,甲酯化程度越高酶对其降解能力越弱,其中对无甲酯化的多聚半乳糖醛酸催化能力最强,DE值为33.04%。重组菌株产酶活性较高,具有明确的产业化前景。     

黑曲霉糖化酶基因在毕赤酵母中的克隆和表达

从高产糖化酶的黑曲霉的cDNA文库中筛选出糖化酶基因,并研究在毕赤酵母中的表达情况。运用RT-PCR从黑曲霉cDNA文库中克隆糖化酶基因的cDNA片段与载体pPIC9K相连,构建重组载体,电转化毕赤酵母GS115,筛选阳性克隆并进行研究。阳性克隆在MM培养基中发酵72 h和1%的甲醇的诱导的情况下,重组毕赤酵母产生的糖化酶酶活最大为15.6 U/mL。测定结果显示,其糖化酶大小为1 908 bp,编码636个氨基酸残基组成的蛋白质。经柱分离纯化其发酵上清液后,用SDS-PAGE电泳方法,测得分子质量大约为80 ku。黑曲霉糖化酶基因在毕赤酵母GS115中成功得到了表达。     

米曲霉giF-10内切葡聚糖酶基因的克隆表达及酶学性质分析

根据NCBI(GenBank Accession No.:D83732.1)中注册的米曲霉内切葡聚糖酶CelB基因序列设计引物,以本实验室自行筛选的天然米曲霉基因组DNA为模板,PCR高保真扩增出内切葡聚糖酶基因eg,将其定向插入到酵母表达载体pPICZαA上,转化酵母宿主菌X33,刚果红水解圈筛选结果表明已成功表达。SDS-PAGE分析表明,表达产物分子量约为65 ku。对酵母表达工程菌X33-eg进行发酵条件优化,结果显示最适甲醇诱导浓度为0.75%,用1 L三角瓶诱导培养5天达到最高酶活120 U/mL。对重组酶的酶学性质分析表明,其最适反应pH值和温度分别为pH4.0和45℃,在30～45℃和pH3.4～pH6.9范围内可保持内切葡聚糖酶最高酶活力70%以上。     

南极假丝酵母脂肪酶B在黑曲霉中的分泌表达及其硅藻土固定化应用

为提高南极假丝酵母脂肪酶B（Candida antarctica lipase B,CALB）表达量,根据黑曲霉（Aspergillus niger）密码子偏好性设计合成CALB基因,以PnaII/tpi为启动子构建CALB表达载体并转化到黑曲霉HL-1中表达,摇瓶发酵120 h后上清液中重组CALB活力为171 U/mL。研究重组CALB的酶学性质,最适反应温度和pH值分别为50 ℃和8.0,在pH 6.0～9.0和45 ℃以下具有较高的稳定性,10 mmol/L Cu2＋、Zn2＋和0.1 g/100 mL十二烷基硫酸钠强烈抑制酶活力,而1 mmol/L Ca2＋、0.1 g/100 mL山梨醇对酶活力具有非常明显的激活作用。此外,以硅藻土为载体固定CALB,固定化酶活力为187 U/g。将制备的硅藻土-CALB固定化酶用于生物合成己酸乙酯,经反应条件优化后在无溶剂体系中己酸乙酯产率达91%。     

酱油生产中应用米曲霉和黑曲霉混合制曲的探索

该文考察了米曲霉和黑曲霉在单独制曲及混合制曲条件下,成曲的中性蛋白酶、酸性蛋白酶、糖化酶及孢子数,探讨了酱油多菌种制曲的可行性.实验以豆粕、麸皮为原料,以AS3.042米曲霉、AS3.350黑曲霉为菌种,探讨了2种制曲方式及不同配比制曲效果的影响.结果表明,米、黑曲霉分开制曲比混合接种制曲所得成曲效果好,米、黑曲霉分别以33℃制曲42h、48h得成品曲,再以2∶1混合所得成曲可获得较佳的酶活力,曲料总蛋白酶活力2748U/g与对照值相当,而酸性蛋白酶及糖化酶活力分别达712U/g、1090U/g,较对照分别提高55.8％、25.4％.