低聚壳聚糖对小鼠的辐射损伤防护作用探讨

探讨低聚壳聚糖对受γ射线照射小鼠辐射损伤防护作用。采用γ射线照射小鼠,检测骨髓有核细胞数、淋巴细胞凋亡数、脾脏脏器系数、细胞凋亡相关基因和P53蛋白、GADD45蛋白变化。流式细胞仪检测细胞凋亡,RT-PCR技术检测凋亡基因,Western blot方法检测蛋白表达。结果表明,与单纯照射组相比,低聚壳聚糖能提高受照小鼠的存活率;提高骨髓有核细胞数,降低骨髓淋巴细胞凋亡细胞数量;下调脾脏凋亡相关基因Bax、caspas-3,上调Bc1-2,Bcl-2/Bax比值升高;抑制P53蛋白、GADD45蛋白表达。结果提示,低聚壳聚糖可能通过抑制P53蛋白、GADD45蛋白表达,影响凋亡相关基因表达,抑制凋亡细胞的产生,促进造血功能恢复,从而起到保护受照损伤小鼠作用。     

电离辐射诱导小鼠骨髓树突状免疫细胞急性凋亡的研究

观察X射线辐射对小鼠骨髓树突状免疫细胞(Dendritic Cells,DCs)的影响。利用X射线对小鼠骨髓树突状免疫细胞进行不同剂量的照射,流式细胞术检测小鼠骨髓DCs的凋亡比例、CCK-8方法检测DCs免疫能力的变化情况,利用蛋白抑制剂对JAK2/STAT3信号转导通路进行抑制,探讨可能的分子机理。与未照射组比较,X射线照射0.5 Gy能够诱导小鼠骨髓DCs抗原递呈和抑制肿瘤细胞活性能力下降,凋亡比例增加,JAK2、STAT和Caspase-3蛋白表达显著增加。X射线能够诱导小鼠骨髓DCs凋亡增加,从而导致细胞免疫能力下降,JAK2/STAT3/Caspase-3通路可能是参与X射线诱导DCs凋亡的机制之一。     

低聚壳聚糖对辐射损伤小鼠细胞凋亡的影响

从细胞凋亡角度探讨低聚壳聚糖提高辐射损伤动物存活率的机理。小鼠受到5 Gyγ射线照射后,检测骨髓淋巴细胞凋亡数、脾脏细胞凋亡相关基因和P53蛋白的变化。流式细胞仪检测细胞凋亡,RT-PCR技术检测凋亡基因,Western方法检测蛋白表达。与单纯照射组相比,低聚壳聚糖提高受照小鼠的存活率,降低骨髓淋巴细胞的凋亡细胞数量;下调凋亡相关基因Bax、caspas-3,上调Bc1-2,Bcl-2/Bax比值升高;抑制P53蛋白表达。低聚壳聚糖可能通过抑制P53蛋白表达,影响凋亡相关基因表达,从而抑制凋亡细胞的产生,有效提高受照小鼠存活率。     

60Co γ射线照射对培养小鼠骨髓基质细胞IL-6表达的影响及机制研究

观察了^60Coγ射线照射对培养小鼠骨髓基质细胞（BMSCs)的白细胞介素－6（IL－6）mRNA及蛋白表达的影响。采用Dexter方法体外培养小鼠BMSCs,8.0Gy^60Coγ射线照射后用放射免疫法测定培养上清液中IL－6的浓度,应用逆转录聚合酶链式反应（RT－PCR）的方法检测IL－6的mRNA表达,同时与NF－KB抑制剂PDTC或地塞米松预处理的BMSCs相比较。结果表明,培养小鼠BMSCs在正常情况下低表达IL－6,辐射后2h时其mRNA水平表达升高,4h时达峰值,之后开始下降;其蛋白表达在2h时开始升高,8－12h时达峰值,24h时基本恢复正至正常水平;而BMSCs在受照射前2h用PDTC或地塞米松预处理后,辐射并不引起IL－6mRNA表达的改变。结果显示,^60Coγ射线照射能够激活培养小鼠BMSCs细胞IL－6基因的转录,使细胞分泌IL－6增多,其机制可能与照射引起的NF－KB活化有关。     

辐射对小鼠骨髓基质细胞分泌血管内皮生长因子的影响

摘要为研究γ射线对小鼠骨髓基质细胞中血管内皮细胞生长因子（Vascular endothclia growth factor,VEGF）的影响,使用不同剂量（0、2．5、5、10Gy）的γ射线全身照射C57BL／6J小鼠。分别用逆转录多聚酶链反应（Reverse transfer polymcrasc chain reaction,RT-PCR）和酶联免疫吸附法（Enzyme linked immunosorbcnt assay,ELISA）法研究了照射后体外培养3、6、10d的骨髓基质细胞中mRNA和培养上清中的VEGF水平。结果发现,对非照射组,随着骨髓基质细胞体外培养时间的延长,其VEGF在基因和蛋白水平都显著升高。受到5Gy或10Gy射线照射后,VEGF随时间变化的总趋势与非照射组相同。在各时间点照射组的VEGF基因表达均高于同时点的非照射组。照射组培养6d上清液中VEGF含量高于同时点的非照射组;而在第10d时,却显著低于同时点的非照射组。分析其原因是因为受到照射后培养10d的骨髓基质细胞数已显著低于非照射同时点的细胞数,其培养上清中VEGF的减少与分泌VEGF的总细胞数减少有关。结果说明,5Gy或10Gy射线会引起骨髓基质细胞VEGF的表达增强。这一现象提示VEGF的表达升高可能是机体的一种代偿性反应,有利于机体造血的重建。辐射后,小鼠骨髓中VEGF的改变与骨髓基质的损伤、造血恢复的关系值得进一步研究。     

中子和γ射线照射对小鼠骨髓造血细胞死亡方式的探讨

为探讨中子和γ射线照射后小鼠骨髓造血细胞的死亡方式及其意义,采用不同剂量中子和60Co γ射线全身照射350只BALB/c小鼠,通过光镜、电镜、流式细胞术、原位末端标记和DNA凝胶电泳等观察造血细胞凋亡与坏死情况.研究发现,中子照射后小鼠骨髓中坏死和凋亡的造血细胞均明显增多,5.5Gy组以坏死为主,而γ射线照射后则以凋亡为主,且呈剂量相关性.凋亡的细胞表现为核染色质浓缩、边移,呈半月型、环状或不规则状,凋亡小体形成,电泳下见DNA梯状图谱.坏死的细胞表现为核肿胀、溶解,线粒体膜、核膜等膜性结构破坏.2.5-5.5Gy中子及5.5-12Gyγ射线照射可使骨髓造血细胞死亡方式不同:中子照射以凋亡与坏死并存,5.5Gy组以坏死为主;而γ射线照射则以凋亡为主.     

Vam3对小鼠体外胸腺细胞的辐射防护效应

探讨白藜芦醇二聚体(Amurensis H,Vam3)对辐射致小鼠胸腺细胞损伤的保护作用。体外无菌分离小鼠胸腺细胞,实验分为6组:对照组(Control)、白藜芦醇组(Resveratrol,Res)、Vam3组、照射组(Irradiation,IR)、照射+Res组和照射+Vam3组。照射+Res组和照射+Vam3组于照射前30 min给予Vam3和Res孵育,对照组、Res组、Vam3组以及照射组加等量RPMI-1640培养基或对应药物处理,除对照组、Res组和Vam3组外,其余3组均给予4 Gy ~(137)Cs γ-射线单次照射。照射后分别用生物发光法检测小鼠胸腺细胞活力,活性氧探针(DCFH-DA)检测细胞内活性氧(Reactive oxygen species,ROS)水平,荧光抗体标记检测γ-H2AX表达水平以及FITC-Annexin V和PI双染标记法检测细胞早期凋亡率。结果显示,与对照组比较,照射组细胞活力显著下降,细胞内ROS和γ-H2AX水平明显升高,同时细胞早期凋亡数目增加;而照射+Vam3组与照射+Res组比较显示,Vam3在提升细胞活力,降低细胞内ROS和γ-H2AX水平以及抑制细胞凋亡方面的作用比Res更加明显。研究结果表明,Vam3对辐射引起的小鼠胸腺细胞急性损伤有一定保护作用,且保护作用优于白藜芦醇。     

小剂量照射的脾细胞外液对较大剂量照射小鼠胸腺细胞凋亡的影响

75mGyX射线全身照射后24h，小鼠脾细胞经ConA刺激48h，其细胞外液使2GyX射线全身照射小鼠后体外培养的胸腺细胞凋亡降低，尤其在培养后72h降低明显（P＜0．05）。与此同时，脾细胞CD25表达（P＜0．01）及IFN－γ分泌（P〈0．05）明显增高。上述结果提示，小剂量辐射改变了免疫器官的微环境及其信息传递过程，使免疫功能增强，细胞成熟和分化加速，凋亡降低。     

CD28和Fas在辐射所致T细胞凋亡中作用的研究

采用双标记直接免疫荧光－流式细胞仪分析技术,测定了不同剂量γ射线照射后T细胞CD28分子和Fas受体（CD95）表达的变化。用乙醇抽提法－流式细胞仪分析技术和JAM检测技术,研究了不同剂量γ射线照射、CD28单抗和IL－18处理后T细胞凋亡的情况。结果显示,正常人淋巴细胞用不同剂量γ射线照射后,CD3^ T细胞中CD28的表达随着剂量的增加而下降,T细胞凋亡的增加并与Fas表达上升有关。照射前用CD28单抗和IL－18处理细胞后,Fas表达下调,细胞DNA断裂明显减小。表明γ射线可影响T细胞CD28受体分子的表达及其信号转导,加速T细胞凋亡的进程,而CD28单抗和IL－18对辐射所致T细胞凋亡有一定的拮抗作用。     

电离辐射所致肾损伤引起的骨代谢异常的机制探讨

研究了大剂量γ射线照射大鼠肾脏后诱发骨代谢异常的细胞分子机制。以15Gyγ射线照射大鼠肾脏,3个月后分析骨骼的病理形态、相关基因mRNA和蛋白质表达量的改变。肾辐射致骨小梁体积、骨小梁宽度、骨小梁数目分别降低13．2％、18．3％（p〈0．05）和20．1％（p〈0．05）,骨小梁间距增加34．8％（p〈0．05）,骨吸收表面提高20．2％（p〈0．05）。骨骼RANKL／OPG（细胞核因子κB受体活化因子配基,Receptor activator of nuclear factor-kappaB ligand,RANKL;骨保护蛋白,Osteoprotegerin,OPG）mRNA比值提高52．2％（p〈0．05）。TGF—β（转移生长因子β,Transforming growth factor-β）、IGF-Ⅰ（胰岛素样生长因子Ⅰ,Insulin—like growth factor Ⅰ,）、OPN（骨桥蛋白,Osteopontin）mRNA和蛋白质表达量明显升高。结果表明：大剂量γ射线照射大鼠肾脏可导致明显骨代谢异常,其发生机制主要与肾1α羟化酶活性降低致活性维生素D减少及PTH升高,成骨细胞表达的RANKL／OPG比例失调,以及TGF—β、IGF—Ⅰ、OPN表达明显升高有关。     

热休克蛋白70过表达对V79细胞辐射损伤的保护作用

采用Western blot方法检测进行热休克处理后恢复不同时间的V79细胞中热休克蛋白70（HSP70）的表达情况,采用克隆形成法观察经过热休克预处理的V79细胞经γ射线照射后细胞存活率的变化。实验结果显示：1）V79细胞经42℃热休克预处理恢复1小时后,热休克蛋白70即有明显增加,4小时开始达到高峰,可持续24小时;2）热休克预处理可以提高γ射线照射后V79细胞的存活分数（当照射剂量小于6 Gy时）,说明热休克蛋白70对受辐射损伤的V79细胞具有保护作用。     

辐射对骨髓间充质干细胞增殖分化及相关基因表达的影响

为观察大鼠局部大剂量辐射后，骨髓间充质干细胞增殖分化及相关基因的表达，以^137Csγ射线对大鼠股骨头部位局部照射，吸收剂量为30Gy，剂量率为0．83Gy／min，照后两周取股骨头进行骨髓间充质干细胞（BMSCs）培养，四甲基偶氮唑盐比色法（MTT）绘制生长曲线及进行集落计数，RT-PCR检测Cbf-α1，PPAR-γ，VEGF—a和KDR的表达。骨髓间充质干细胞大剂量辐射后细胞增殖能力明显降低，集落形成数目减少；Cbf-α1，PPAR-γ，VEGF—a和KDR的表达均降低，其中Cbf-α1，PPAR-γ，VEGF—a表达降低幅度分别达18．98％，9．46％和57．34％，与对照组相比差异显著（p〈0．05）。故体外大剂量局部辐射明显损伤骨髓间充质干细胞，使其增殖分化及相关基因的表达降低。     

重组人IL-11对中子照射小鼠骨髓损伤防治作用及机制研究

探讨了致死性中子辐射后重组人白介素11（Recombinant human interleukin-11,rhIL-11）对小鼠骨髓损伤的防治作用及其机制。采用二级雄性BALB／c小鼠96只,分别于4．0Gy中子全身照射前3d或后3d皮下注射rhIL-11,于照射后6h、1d和2d活杀取材,计数外周血和骨髓有核细胞。采用核仁组成区嗜银蛋白（Argyrophilic of Nucleaolar organizer regins,AgNOR）染色检测骨髓细胞核嗜银蛋白含量、流式细胞术和DNA凝胶电泳检测骨髓细胞凋亡、免疫组化染色检测IL-11受体α及gP130的表达。结果表明,照射前应用IL—11对4．0Gy中子,照射后小鼠外周血白细胞和血小板降低有一定抑制作用,而照射后应用IL—11则对白细胞、红细胞、血小板以及骨髓有核细胞降低均有一定抑制作用;照射前及照射后用药组对细胞凋亡未见明显影响,而与单纯对照组比较,用药组、AgNOR含量增多,IL-11Rα及gp130表达均明显增强。说明IL-11可能通过受体α及gp130信号通路,促进损伤后造血功能恢复,从而发挥其对骨髓辐射损伤的防治作用。     

低剂量微波辐射减轻γ射线对小鼠造血系统的损伤

为探讨低剂量微波与γ射线复合照射对小鼠造血系统的影响,将雄性昆明小鼠随机分为对照组、微波照射组、γ射线照射组及微波与γ射线复合照射组.微波组与复合组小鼠先接受功率密度为120μW/cm2的微波照射,1h/d,持续14 d,第15天给予γ射线照射组和复合组5.0 Gy60Coγ射线一次性全身照射.于照射后3d、6d、9d、12d处死动物,取胸骨及脾脏,对各组病理形态变化进行定量检测和分级.结果显示,单独γ射线与复合照射均可导致骨髓组织经历典型的凋亡坏死、空虚、再生修复和恢复4个阶段的病理改变,但复合组的病变轻于电离照射组,恢复也更快.脾脏系数结果显示,照后9 d、12 d复合组脾脏系数显著高于电离照射组(p<0.05).脾脏病理显示,脾损伤病变过程与骨髓造血组织基本相似,复合组病变轻于电离照射组.本实验表明预先低剂量的微波辐射可减轻γ射线对小鼠造血系统的严重损伤.     

p53和Bcl—2／Bax在辐射诱导胸腺细胞凋亡中的作用

采用流式细胞术对昆明小鼠接受７５ｍＧｙ和２ＧｙＸ射线全身照射后，胸腺细胞内细胞凋亡相关基因ｐ５３，Ｂｃｌ－２和Ｂａｘ蛋白的表达进行了比较研究。结果表明，７５ｍＧｙＸ射线全身照射后２４ｈ，ｐ５３基因蛋白产物的表达显著降低，而２ＧｙＸ射线全身照射后２４ｈ，ｐ５３基因蛋白表达则显著增高。     

小鼠脾淋巴细胞辐射死亡与凋记之间的关系

探讨细胞凋亡在小鼠脾脏辐射损伤与重建中的作用及其机制,为急性放射病的防治提供依据。用原位末端标记、ＤＮＡ电泳和免疫组化技术观察经２￣８Ｇｙ不同剂量γ射线整体照射后,小鼠脾脏淋巴细胞凋亡的动态变化过程和Ｂａｘ、Ｂｃｌ－２蛋白在其中的作用。结果表明,（１）照射后早期淋巴细胞凋亡率迅速增加,如６Ｇｙ照射后４ｈ和１ｄ凋亡率分别为对照值的４．９和９．７倍;凋亡率还随照射剂量的增加而迅速升高;照射后８ｈ当照射     

致死剂量γ射线照射小鼠淋巴结淋巴细胞凋亡动力学及其与相关蛋白表达的关系

用原位末端标记、原位杂交和碱磷酶免疫组化技术,观察致死剂量γ射线照射小鼠淋巴结淋巴细胞的凋亡动力学变化,及其与Bax、Bcl-2和Bcl-XL表达的关系。结果表明,照射后24h淋巴结淋巴细胞凋亡指数迅速升高,在6—12Gy范围内与照射剂量呈正比,≥15Gy照射后变化不明显。6Gy照射后24h,淋巴细胞凋亡达高峰,尔后开始降低;然而直至照射后6个月和12个月,凋亡指数仍明显高于对照组。6Gy照射后24h,淋巴细胞Bax蛋白表达即出现升高,当剂量为12Gy时达到峰值,15Gy和20Gy照射后未观察到这种剂量效应关系。而Bcl-2和Bcl-XL蛋白表达在照射后24h明显下降。bax和bcl-2mRNA的表达显示出相似趋势。以上结果显示,≤12Gy照射后细胞凋亡是淋巴细胞的重要死亡方式。照射后Bax的上调及Bcl-XL的下调在致死剂量照射引起的淋巴细胞凋亡调控中起重要作用。     

抗辐射菌lexA基因对受γ射线照射和MMC作用的大肠杆菌敏感性的影响

研究抗辐射菌lexA基因在大肠杆菌细胞中的表达对其γ射线辐射抗性和丝裂霉素(MMC)敏感性的影响。应用电穿孔技术将携带有抗辐射菌lexA基因的重组质粒PZA172转入大肠杆菌JM109，其启动子为lacZ，用异丙基-硫代-β—D半乳糖苷(IPTG)诱导，(十二烷基磺酸纳)聚炳烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)凝胶电泳检测LexA蛋白的表达。经受不同剂量γ射线照射和不同浓度的MMC作用，平板菌落计数，绘制存活曲线。抗辐射菌lexA基因在大肠杆菌细胞中，经IPTG诱导能稳定地表达，lexA基因的显著表达降低了大肠杆菌经γ射线照射和MMC作用后的存活率。抗辐射菌lexA基因在大肠杆菌中的显著表达降低了大肠杆菌对γ射线和MMC的抗性，其作用机理还有待于进一步的研究。     

小鼠脾淋巴细胞辐射死亡与凋亡之间的关系

探讨细胞凋亡在小鼠脾脏辐射损伤与重建中的作用及其机制,为急性放射病的防治提供依据.用原位末端标记、DNA电泳和免疫组化技术观察经2～8Gy不同剂量γ射线整体照射后,小鼠脾脏淋巴细胞凋亡的动态变化过程和Bax、Bcl-2蛋白在其中的作用.结果表明,(1)照射后早期淋巴细胞凋亡率迅速增加,如6Gy照射后4h和1d凋亡率分别为对照值的4.9和9.7倍;凋亡率还随照射剂量的增加而迅速升高,照射后8h当照射剂量为2、4、6、8Gy时,凋亡率分别为对照值的3.7、5.4、6.2和8.3倍.(2)透射电镜观察表明,6Gyγ-线照射后,小鼠脾脏淋巴细胞出现早、中、晚期典型凋亡细胞的形态学特征.DNA凝胶电泳显示6Gy照射后4和6h,脾脏淋巴细胞出现特征的DNA梯形谱;末端标记法显示6Gy照射后4h凋亡率约为照前值的3.4倍.(3)照射后Bax、Bcl-2蛋白的异常表达证实两者在淋巴细胞凋亡的调控中起重要作用.细胞凋亡参与了小鼠脾脏辐射损伤与修复的全过程,Bax和Bcl-2蛋白对淋巴细胞凋亡的调控起重要作用.     

不同剂量X射线照射对小鼠胸腺、脾脏、肝脏细胞凋亡及p53基因表达的影响

采用X射线全身照射小鼠，在普通光镜及流式细胞仪（FCM）下检测细胞凋亡，用免疫组织化学方法检测p53蛋白的表达。结果表明，照射剂量在2-8Gy范围内，脾脏、胸腺细胞凋亡率随照射剂量的增加而升高，细胞周期阻滞于G1期，凋亡率最高在照后8-12小时。肝脏细胞凋亡率最高峰出现在照后24小时，S期和G2／M期细胞阻滞增多。脾脏、胸腺细胞中p53蛋白表达阳性，肝脏细胞中p53蛋白表达阴性。