α-半乳糖苷酶基因在大肠杆菌中的表达及酶学性质研究

利用大肠杆菌（Escherichia coli）表达系统,经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导,成功异源表达了一株链球菌（Streptococcus）S1的α-半乳糖苷酶基因,重组α-半乳糖苷酶经镍柱纯化后,测定其酶学性质。重组α-半乳糖苷酶最适pH值为6.5,最适温度为50 ℃,在碱性环境中（pH 7.5～10.0）及在40 ℃以下温度条件下该酶较为稳定;酶催化动力学结果显示,该酶在最适条件下水解硝基苯-α-D-半乳糖苷（pNPG）的最大水解速率（Vmax）为508.38 μmol/（min·mg）,米氏常数（Km）值为1.2 mmol/L;通过薄层层析（TLC）法检测到该重组α-半乳糖苷酶可以高效地水解天然底物蜜二糖、棉籽糖和水苏糖中的α-半乳糖苷键。     

高产β-半乳糖苷酶植物乳杆菌的筛选及其酶学性质研究

β-半乳糖苷酶不仅能通过分解乳制品中乳糖解决乳糖不耐症问题,同时能通过转糖苷作用合成具有益生功能的低聚半乳糖。从8株植物乳杆菌中筛选出高产β-半乳糖苷酶菌株K2,比活力高达6620 U/g,并对β-半乳糖苷酶酶学性质进行研究。结果表明:β-半乳糖苷酶最适和最稳定的pH值为6.5,最适温度为60℃,而在40℃稳定性最强。Mg2+对β-半乳糖苷酶活力有明显促进作用,而Cu2+有强烈抑制作用,通过推导求得米氏常数Km,oNPG=1.15 mmol/L,最大反应速率Vmax,oNP=6.34μmol/(min.mg)。研究结果为具有解决乳糖不耐受症的植物乳杆菌微生态制剂的开发奠定了基础。     

一种来源于青霉的β-半乳糖苷酶酶学性质研究

从土壤里筛选到20株产β-半乳糖苷酶的菌株,其中β-半乳糖苷酶活力最高的是菌株L7,通过形态学观察和18SrDNA序列分析,得出该菌株为斜卧青霉;并研究了其β-半乳糖苷酶的酶学性质。结果表明:β-半乳糖苷酶最适作用温度为60℃,最适pH为6.0,在60℃以下和pH3.0 7.0有较高的稳定性;Mg2+、Mn2+对β-半乳糖苷酶活性有显著的激活作用,Cu2+、Fe2+、和Zn+对酶活有较强的抑制作用;以ONPG为底物采用双倒数做图法测得Km为6.25mmol/L;经过聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定,该酶蛋白的分子量约为110kDa。     

来源于热泉宏基因组的β-半乳糖苷酶及其特征

研究了在大肠杆菌中克隆和表达来自热泉宏基因组的一个β-半乳糖苷酶基因以及该β-半乳糖苷酶在动物营养中的初步应用。以大理洱源一个65℃热泉微生物宏基因组DNA为模板,克隆得到该基因全序列。根据同源性分析,该β-半乳糖苷酶与Thermotoga lettingae TMO来源的糖苷水解酶(Sequence ID:YP_001471199.1)同源性最高,为71%。重组转化子经诱导所得酶最适反应温度为55℃,最适pH值为7.5,酶液经58℃热处理30min,酶活残留65%以上,该酶能将乳糖或豆粕中的乳糖水解为半乳糖和葡萄糖。     

壳聚糖固定β-半乳糖苷酶及其应用稳定性研究

以壳聚糖微球为载体,戊二醛为交联剂,固定β-半乳糖苷酶对β-半乳糖苷酶的固定化条件及周定化酶的各种性质进行研究,确定酶固定的最适条件为:用pH6.5的P-E-M缓冲液浸泡10h,25℃壳聚糖微球与0.5%戊二醛交联12h以上,4℃下酶与壳聚塘微球固定12h以上,酶活力回收率可达67%.固定化酶的最适温度为40℃左右,最适pH7.0.通过双倒数法求回归方程,求得酶动力学参数Km值为0.613 mmol/ml.固定化酶稳定性好,可以重复使用.将该固定化酶应用于乳糖分解实验和作为柱层析介质连续分解乳糖,分批反应6批次,乳糖水解率保持在90%以上,连续水解20d,乳糖水解率仍然可保持在75%以上.     

微泡菌ALW1昆布多糖酶的酶学性质及其酶解产物的抗氧化活性

本文研究微泡菌ALW1胞外昆布多糖酶的酶学性质及其酶解产物的抗氧化活性。研究结果显示,以昆布多糖为底物,菌株ALW1胞外昆布多糖酶的最适反应温度为45℃,在35℃下酶活性较稳定;酶的最适反应pH5.5,在pH 6.0～8.0范围内酶活性较为稳定;Na~+对酶活力起促进作用,而K~+,Fe~(2+),Cu~(2+),Co~(2+),Mn~(2+),Ba~(2+),Cd~(2+)和Zn~(2+)对昆布多糖酶具有不同程度的抑制作用。昆布多糖酶的酶解产物具有还原能力和清除2'-联氨-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸(ABTS)自由基和·OH自由基的能力,对ABTS自由基和·OH自由基的半抑制剂量IC_(50)分别为15.2 mg/mL和1.7 mg/mL,表明酶解产物有一定的抗氧化能力。     

β-半乳糖苷酶交联酶聚体的制备及酶学性质研究

研究了乳酸克鲁维酵母所产β-半乳糖苷酶交联酶聚体(CLEAs)的制备条件和酶学性质,并应用于乳糖为底物催化制备低聚半乳糖(GOS)的反应体系中。结果表明:将β-半乳糖苷酶酶液稀释20倍,按体积比1∶1加入异丙醇,4℃下沉淀30min,加入体积分数为0.125%交联剂戊二醛,4℃下交联30min,离心洗涤,所得CLEAs的酶活保留达45.77%;与游离酶相比,β-半乳糖苷酶CLEAs的最适p H由7提高至8,最适温度由30℃提高至37℃,p H和温度的适用范围有所拓宽,且37℃下热稳定性提高1倍,具有更高的转糖苷活性选择性,适于制备功能性低聚半乳糖。     

一株产高温β-半乳糖苷酶低温菌株及其酶学性质研究

从101株低温菌中发现了1株产高温β-半乳糖苷酶菌株G2005,依据形态特征与生理生化反应特性,参照《常见细菌鉴定手册》将其鉴定为乳球菌Lactococcus sp.。该菌株高温β-半乳糖苷酶的最适pH值为6.5,最适作用温度为50℃,65℃相对酶活为总酶活的19%,在30~60℃范围内,具有较好的稳定性。不同金属离子对β-半乳糖苷酶活性的影响为:Mg2+>Na+>K+>Fe2+>Ca2+>Zn2+>Mn2+>Hg2+>Cu2+。Mg2+增强酶活,而Hg2+、Cu2+、Mn2+抑制酶活。经测定该酶Km值为96.8 mmol/L,具高温酶特性。该菌株的最适产酶条件分别为30℃培养48h~60h,培养基初始pH 6.5,培养基乳糖浓度为2%。     

马克斯克鲁维酵母β-半乳糖苷酶合成条件的优化及其酶学性质表征

β-半乳糖苷酶是广泛使用的食品添加剂,主要用于降解乳制品中的乳糖,缓解乳糖不耐受症状。该研究对实验室保藏菌株马克斯克鲁维酵母的发酵条件进行了优化。在20 g/L半乳糖、20 g/L玉米浆干粉、40℃、初始pH 6.5、150 r/min的条件下,粗酶液的酶活力为26.3 U/mL,表明该菌株具有利用廉价碳氮源高效生产β-半乳糖苷酶的潜力。通过DEAE阴离子交换层析进一步纯化得到比活力为124.09 U/mg的纯化酶。纯化后酶的最适温度40℃,最适pH 6,K_m为5.28 mmol/L,k_cat为4.74 s^-1。此外,发现该酶受Mg²⁺的促进,在20～40℃表现出优异的热稳定性,40℃下30 min仍能保持95.6%的活力。因此,马克斯克鲁维酵母β-半乳糖苷酶比乳酸克鲁维酵母的热稳定性更好,具有潜在的工业应用潜力。     

壳聚糖固定β-半乳糖苷酶的研究

以壳聚糖微球为载体，戊二醛为交联剂，固定β-半乳糖苷酶，对β-半乳糖苷酶的固定化条件及固定化酶的各种性质进行了研究，确定了酶固定的最适条件为：用pH6．5的P—E-M缓冲液浸泡10h，25℃壳聚糖微球与0．5％戊二醛交联12h以上，4℃下酶与壳聚塘微球固定12h以上酶活力回收可迭67％。固定化酶的最适温度为40℃左右，最适pH7．0。通过双倒数求回归方程，求得动力学参数Km值为0．613μmol／ml。固定化酶稳定性好，可以重复使用。     

Kluyveromyces fragilis β-D-半乳糖苷酶催化合成低聚半乳糖

低聚半乳糖具有促进肠道有益菌增殖、抗龋齿、低能量等特定的生理功能。研究了酶反应条件对脆壁克鲁维酵母(kluyveromyces fragilis)β-D-半乳糖苷酶催化合成低聚半乳糖的影响。以乳糖为底物,k.fragilis β-D-半乳糖苷酶催化合成低聚半乳糖的最适温度为40℃,最适pH值为7.0,反应20h低聚半乳糖的产率达到最大。底物初始浓度影响k.fragilis β-D-半乳糖苷酶催化合成低聚半乳糖的产率,乳糖起始浓度由110mg/mL增加到660mg/mL,低聚半乳糖的含量从43mg/mL增加到207mg/mL。     

微泡菌昆布多糖酶Lam128A的酶学性质及酶解产物抗氧化活性

该研究探讨微泡菌ALW1来源的昆布多糖酶Lam128A的酶学性质及其酶解产物的抗氧化活性。利用毕赤酵母异源表达重组蛋白rLam128A,该昆布多糖酶的分子量为70 ku,最适反应温度和最适反应pH值分别为45 ℃和pH值5.5;温度低于45 ℃时稳定,分别在pH值3.0、5.0和11.0条件下处理96 h后,残余酶活力不低于60%。还原试剂二硫苏糖醇（DTT）对昆布多糖酶活力有促进作用,rLam128A对螯合剂乙二胺四乙酸（EDTA）表现出良好的稳定性,对去垢剂Tween 20和Tween 80、变性剂尿素表现出一定的稳定性。昆布多糖经rLam128A水解后,酶解产物对DPPH、ABTS和OH·自由基的半数抑制剂量IC50分别为7.12、1.01和 2.40 mg/mL,相比未经酶解处理的昆布多糖表现出更显著的抗氧化活性。微泡菌昆布多糖酶Lam128A的酶学性质为该酶开发利用昆布多糖生物资源提供了理论基础。     

Geobacillus thermodenitrificans α-半乳糖苷酶原核表达及其酶学性质

本文利用大肠杆菌原核表达系统对来源于Geobacillus thermodenitrificans的α-半乳糖苷酶编码基因进行了重组表达,并对该酶的酶学性质进行了研究。结果表明,该α-半乳糖苷酶的分子量为100~110 kDa,以pNPG为底物时,该酶的最适反应温度为70 ℃,最适pH6.0,且该酶具有较好的温度稳定性和pH稳定性;Hg+、Ag+、Cu2+离子能完全抑制α-半乳糖苷酶的活性,Fe3+、Mn2+、Zn2+等离子对α-半乳糖苷酶的活性具有不同程度的激活作用;以pNPG为底物测得该酶的米氏常数K_m=10.04 mmol/L,最大反应速度V_max=18.25 μmol/min。     

多粘类芽孢杆菌适冷性新型β-半乳糖苷酶的重组表达和酶学性质

目的：本实验旨在挖掘一个适冷性新型β-半乳糖苷酶,为低温生产低乳糖乳制品或合成低聚半乳糖（Galactooligosaccharides,GOS）提供基础。方法：从多粘类芽孢杆菌（Paenibacillus polymyxa）基因组中克隆一个β-半乳糖苷酶（PpBgal42A）基因,构建重组表达质粒pET-28a-PpBgal42A在大肠杆菌BL21(DE3)中表达,经亲和层析纯化后研究重组β-半乳糖苷酶的酶学性质,利用高效液相色谱检测各糖分浓度,以GOS转化率为指标,评价PpBgal42A的转糖苷能力。结果：PpBgal42A与酸热脂环酸芽孢杆菌（Alicyclobacillus acidocaldarius）来源的糖苷水解酶42家族β-半乳糖苷酶同源性最高,为59.9%。纯化后,PpBgal42A的比活力为163.7 U/mg,分子量约为79 kDa。其最适p H和温度分别为pH7.5和35℃,在pH7.0～9.5范围内和4～35℃以下保持稳定,50℃时快速失活,35℃时的半衰期为1777 min。PpBgal42A利用350 g/L乳糖于30℃反应6 h后合成GOS的转化率为31...     

海洋低温β-半乳糖苷酶菌株筛选、鉴定及酶的分离纯化

筛选自黄海海泥产β-半乳糖苷酶的菌株CD6,依据形态学特征、生理生化特征及分子生物学特征鉴定为土生拉乌尔菌(Raoultella terrigena)。通过透析、超滤和柱层析方法分离纯化菌株β-半乳糖苷酶,测定该酶的最适反应温度为20℃,30℃剩余相对酶活85%;超过35℃酶活力即迅速下降,确定其为低温酶。     

产低温β-半乳糖苷酶菌株的筛选及其酶学性质研究

从新疆高寒冻土、冷冻乳制品及生乳中分离到101株耐冷菌,利用低温β-半乳糖苷酶筛选模型,获得1株低温酶高产菌株L2004,根据其形态特征、生理生化特性,鉴定为短芽孢杆菌属(BrevibacillusShida,1996)。在以乳糖为主要碳源的发酵培养基中,L2004菌最适生长温度和最适产酶温度分别为20、15℃。该低温酶的最适pH值为6.5,最适作用温度为33℃,0℃相对酶活为总酶活的25%,在0～0℃范围内,具有较好的稳定性。不同金属离子对β-半乳糖苷酶活性的影响为:Mn2 >Mg2 >K >Na >Ca2 >Fe2 >Hg2 >Cu2 >Zn2 。Mn2 、Mg2 增强酶活,而Hg2 、Cu2 、Zn2 抑制酶活。该酶Km值为5.29mmol/L,具低温酶特性。     

黑曲霉F0215中β-半乳糖苷酶系的生化特征

通过分子克隆与遗传重组技术克隆及表达黑曲霉F0215来源的全部β-半乳糖苷酶,构建了重组菌GS115(p PIC-bgl A)、GS115(p PIC-bgl B)、GS115(pPIC-bglC)和GS115(pPIC-bglE);通过摇瓶发酵和甲醇诱导培养,制备相应的重组β-半乳糖苷酶BglA、BglB、BglC和BglE。重组酶BglA、BglB、BglC和BglE的最适作用温度分别是60,50,60,50℃;最适反应pH分别为4.0,4.5,3.5,4.5;Mg~(2+)、Ca~(2+)、Na~+和Mn~(2+)对上述酶的活性均有促进作用,Cu~(2+)、Fe~(2+)、Ni~(2+)、Zn~2、Li~+和EDTA对上述酶的活性均有抑制作用;以ONPG为底物,采用双倒数作图法测得BglA、BglB、BglC和BglE的Km分别是0.43,0.22,0.37 mmol/L和0.46 mmol/L;BglA、BglB、BglC和BglE对乳糖具有单一的特异性,包含水解与转苷两种基本活性;黑曲霉β-半乳糖苷酶的分子结构呈现典型的真菌β-半乳糖苷酶结构特征。在参照基因组中预示存在的β-半乳糖苷酶BglD,在所试黑曲霉菌种中不存在。     

驼乳中产转糖基活性β-半乳糖苷酶乳酸菌的筛选鉴定及其酶学特性分析

分离筛选高产转糖基活性β-半乳糖苷酶的乳源微生物,为高效合成低聚半乳糖（galacto-oligosaccharides,GOS）提供新酶源。以添加5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷（X-Gal）的乳糖为碳源的乳酸细菌培养基（MRS）进行初级分离筛选,以产酶菌株粗酶液催化乳糖转糖基反应产物的薄层层析进行复筛,单因素优化最佳产酶条件和转糖基反应条件,硫酸铵分级沉淀纯化β-半乳糖苷酶并对其酶学特性进行初步分析。筛选获得产转糖基活性β-半乳糖苷酶乳酸菌20?株,选择产酶水平较高、转糖基活性最强的产β-半乳糖苷酶菌株L6进行进一步研究。生理生化和分子生物学鉴定确定L6菌株为Lactobacillus kefiri。该菌株在2?g/100?mL乳糖、1?g/100?mL氮源（蛋白胨、牛肉膏和酵母浸粉）及初始pH?5.5的条件下,37?℃培养20?h,产酶水平最高可达（3.81±0.02）U/mL。L6菌株所产β-半乳糖苷酶催化反应的温度范围较宽,45～70?℃均能保持50%以上相对酶活力。以45?g/100?mL乳糖为底物,该酶在65?℃、pH?7.0条件下,反应4?h生成转移二糖的得率为13.51%（m/m,下同）,转移三糖为13.85%,转移三糖以上的GOS为4.15%。     

欧文氏菌乳糖酶的分离纯化及其酶学性质研究

对欧文氏菌Erwinia sp.E5株所产β-半乳糖苷酶进行分离纯化,所得纯酶的比酶活为554.92U/mg.蛋白质。对纯化得到的酶进行酶学性质研究,其最适反应温度为40℃,在20℃保持40%以上的酶活力;该酶最适反应pH为7.0,在pH 6.5体系中保持95%的酶活力;Mg2+和Na+对该酶具有激活作用,而Ca2+为弱抑制剂。乳糖水解试验显示该酶在乳糖含量小于10%的反应体系中具有较高反应速率。     

α-半乳糖苷酶的液体发酵条件和酶学性质研究

研究了臭曲霉ZU-G1液体发酵产α-半乳糖苷酶的最佳生产条件及其酶学性质.试验结果表明,最适发酵条件为温度28℃.转速200 r/min,装液量30 mL(250 mL三角瓶),接种量6.6%,种子培养18 h后接种,发酵144 h后α-乳糖苷酶酶活达到最大值.在此发酵条件下α-半乳糖苷酶最适pH 5.0,于28℃放王7 h,在pH 3.5～6.0内稳定性较好;该酶的最适温度为60℃,在50℃以下存放稳定性较好.Ag 可强烈抑制该酶的活性,Ca2 、Mg2 、Mn2 和Zn2 的激活效果随浓度而变.1mmol/L甘露醇、抗坏血酸和2mmol/L蜜二糖对酶的热稳定性保护效果好.