浙江新分离狂犬病病毒街毒株与国内外疫苗株G基因的比较分析

目的对浙江新近分离的2株狂犬病病毒街毒株的G基因进行遗传学分析,并比较其与国内外使用的狂犬病疫苗株间的差异。方法以直接免疫荧光法和双抗体夹心ELISA法检测伤人犬脑组织,乳鼠接种分离病毒,RT-PCR扩增G基因片段,直接测序后进行遗传学分析。结果在2份伤人犬脑组织(编号LH和ZJCA1)中均检出狂犬病病毒,与其他浙江街毒株相比,G基因核苷酸和氨基酸序列同源性均为98.7%～99.2%。与当前国内外使用的多种疫苗株相比,与CTN疫苗株同源性最高,G基因核苷酸和氨基酸序列同源性分别为79.5%～86.1%和86.8%～94.1%。结论浙江新分离的2株狂犬病病毒街毒株属于基因1型,与当前使用的多种疫苗株相比,与CTN疫苗株属于同一分支,二者的亲缘关系最近。     

新分离5株狂犬病病毒街毒株N和G基因的序列分析

目的分析我国新分离的5株狂犬病病毒(RV)街毒株基因序列及分子流行病学状况。方法采用RT-PCR法从疑似狂犬的犬脑组织内获得N和G基因cDNA的全序列并进行测序,将所得结果与已发表的国内外代表性毒株相应基因进行核苷酸和推导氨基酸序列比较。结果5株均含有完整N基因序列,3株含有完整G基因序列。与国内外发表的部分毒株比较,5株街毒N基因的核苷酸同源性在98.1%～99.9%之间,推导氨基酸同源性在99.5%～100%之间。将5株街毒与人用疫苗株3aG、PV株的N基因进行比较,核苷酸同源性在86.2%～86.7%之间,氨基酸同源性在95.1%～95.5%之间;而与人用疫苗株CTN比较,核苷酸同源性在89.4%～89.6%之间,氨基酸同源性在98.2%～98.6%之间。3株街毒G基因的核苷酸同源性在98.5%～99.4%之间,推导氨基酸同源性在99.6%～100%之间。将3株街毒与人用疫苗株aG、PV和兽用疫苗株ERA的G基因进行比较,核苷酸同源性在82.8%～83.1%之间,氨基酸同源性在88.0%～90.1%之间;而与人用疫苗株CTN比较,核苷酸同源性在86.7%～87.1%之间,氨基酸同源性均为92.0%。结论新分离街毒株基因未发生较大变异,与CTN的同源性高于与aG株和PV株。     

一例人狂犬病病例的病毒分离及鉴定

目的对2013年武汉市新发生的一例疑似狂犬病死亡病例的脑组织进行病毒分离及鉴定。方法采用直接荧光抗体法(DFA)和ELISA法检测狂犬病病毒(rabies virus,RABV)抗原;提取病毒RNA,设计12对引物,分段扩增全基因组,克隆后测序,应用DNAStar软件包中的MegAlign模块对基因所编码的氨基酸进行对位分析;Clustal X 1.83软件和GENEDOC软件用于序列比对;MEGA 4.1软件以Kimura two-parameter模型邻位相连法(Neighbor-Joining,NJ)构建系统进化树(Bootstrap-l000),并与国内外疫苗株及近期湖北省及周边地区分离的代表性街毒株进行同源性分析。结果分离的街毒株13WH10的RABV抗原呈阳性;13WH10街毒株基因组全长11 924 bp,属基因Ⅰ型狂犬病病毒;13WH10与湖北省及周边街毒株处于同一亚群,与CTN-1疫苗株及东南亚地区的街毒株同源性较高,高于欧美国家疫苗株。结论成功对武汉市2013年新发生的一例疑似狂犬病死亡病例的脑组织进行了病毒分离及鉴定;CTN-1与RABV国内分离株同源性较高,系统进化关系较近,提示采用CTN-1疫苗株生产的狂犬病疫苗可有效预防中国狂犬病的流行。     

广西玉林市2005-2012年狂犬病病原学监测及病毒N基因特征分析

目的：分析2005—2012年广西玉林市狂犬病病原学监测结果及病毒N基因遗传变异特征,为狂犬病防控提供科学依据。方法2005—2012年在广西玉林市采集犬脑组织及临床诊断人狂犬病病例的唾液进行病原学检测,检测阳性标本进行N基因核苷酸序列测定、同源性比较和种系发生分析。结果共采集、检测外观健康犬脑组织728份、临床诊断人狂犬病病例唾液33份,RT-PCR检测阳性率分别为0.96%（7/728）和51.52%（17/33）。获得5条犬源、6条人源狂犬病病毒株N基因全序列。该11条序列之间的核苷酸同源性为94.7%～100.0%,与广西以往分离株 GX01的核苷酸序列的同源性为94.5％～98.4％,与疫苗株 CTN 株的同源性为94.6％～99.7％。进化树分析显示,犬源株和人源株病毒N基因亲缘进化关系很近,处于同一分支,都属于基因Ⅰ型狂犬病病毒。结论从病原学和病毒分子水平证实玉林市外观健康犬携带狂犬病毒及17例临床诊断病例为确诊病例,其病原为狂犬病病毒基因I型,阳性带毒犬的流动是造成本病传播和扩散的主要因素,也是造成该地区疫情高发的重要原因之一。     

中国狂犬病毒疫苗株CTN-1-V三个代次的GP基因序列分析

目的分析三个代次CTN-1-V病毒株糖蛋白(GP)基因部分序列,并与代表性街毒株进行比较。方法利用RTPCR反应,从感染了CTN-1-V病毒的小鼠脑内获得GPcDNA的部分片段,并进行序列测定。结果三个代次的CTN-1-V病毒株GPcDNA序列的690个核苷酸与代表性狂犬病毒GP核苷酸相应序列同源性为83.2%～96.8%,氨基酸序列同源性为90.0%～97.4%。CTN1V株三代之间的核苷酸序列几乎相同。结论CTN1V株在传代过程中GP基因结构基本稳定,与中国流行的代表性街毒株的同源性高于aG株和PV株。     

我国流行的4株狂犬病街毒株G基因序列及分子流行病学研究

目的探讨我国流行的狂犬病毒(RV)基因差异,评价现有疫苗的适用性。方法通过RT-PCR并对其产物测序后获得4株RV街毒株的G基因序列以及G与M和L基因的区间序列。利用计算机分析软件比较4株RV与已经发表的毒株的核苷酸和推导的氨基酸序列。结果糖蛋白(GP)完整的编码基因序列长度为1575 bp。GP氨基酸序列同源性明显高于相应的核苷酸序列(除Mokola外),4株街毒与CTN的同源性高于aG株。GP不同区段比较显示,膜外区同源性高于膜内区。G-M区间核苷酸序列长度为5 bp;除广西4外,其余毒株100％同源。GL区间核苷酸序列长度为2,4 bp,越1与肥东同源性为100％。结论4株RV均属于基因I型。广西的毒株之间存在不同的来源。街毒与疫苗株之间基因存在差异。4株RV与SAD-B19进化途径相近,与PV株相差较远。越1与肥东株亲缘关系极近,可能是由同一毒株演化而来。     

肾综合征出血热灭活疫苗毒株84Fli株的M和S基因核苷酸序列分析

目的对肾综合征出血热灭活疫苗毒株84Fli株的M和S基因进行核苷酸序列分析,了解该毒种的基因稳定性。方法根据汉坦病毒标准株设计特异的PCR引物,用RT-PCR技术分段扩增疫苗株84FLi株的M和S基因片段,PCR产物纯化后直接测序,并进行遗传进化分析。结果疫苗株84FLi株M基因片段的核苷酸序列与GenBank中收录的HTN型毒株的M基因核苷酸序列的同源性为83.5%～99.9%,而与SEO型毒株的同源性为70.2%～72.0%。其S基因与HTN型毒株的同源性为85.9%～99.6%,与SEO型毒株的同源性为69.4%～70.8%。疫苗株84FLi株的M和S基因的氨基酸序列与GenBank中收录的HTN型汉坦病毒84FLi株M和S基因的氨基酸序列的同源性分别为99.9%和99.5%。从遗传进化树上可以看出,疫苗株84FLi株与GenBank中收录的84FLi株位于一个独立的分支上,与其他HTN型病毒亚型分布于不同分支上,与其他HTN型病毒亚型亲缘关系较远。结论肾综合征出血热灭活疫苗毒株84FLi株M和S基因片段的核苷酸和氨基酸序列未发生较大变异,说明在传代过程中该疫苗株在基因水平上并未发生较大改变。     

鹅细小病毒VP3基因的克隆及序列分析

目的克隆鹅细小病毒(Goose parvovirus,GPV)黑龙江各分离株和疫苗株的VP3基因,并进行序列分析,为小鹅瘟的诊断与防治奠定理论基础。方法根据GenBank中登录的GPV B株全基因序列设计1对特异性引物,PCR扩增、克隆VP3基因,并进行测序和同源性分析。结果克隆的VP3基因大小699 bp,编码233个氨基酸;7个分离株的VP3基因核苷酸序列同源性为99.4%～100%,各分离株与疫苗株的核苷酸序列同源性为98.7%～99.3%,与标准B株的核苷酸序列同源性为97.6%～97.7%,与MDPV核苷酸序列的同源性为80.8%～81.7%;各分离株之间亲缘关系较近,其中QTH分离株与疫苗株亲缘关系最近,氨基酸序列同源性为97.8%,其他分离株与疫苗株的亲缘关系相对较远,氨基酸序列同源性为96.6%～97.4%;所有分离株和疫苗株与标准B株亲缘关系相对较远,与MDPV的亲缘关系最远。结论黑龙江省各分离株与疫苗株的核苷酸和氨基酸序列存在一定的差异。     

低神经外毒力乙脑病毒M47株的分子生物学特征

目的探究低神经毒力乙脑病毒M47株的分子生物学特征,以期找出其低毒力的分子基础。方法采用RTPCR法扩增M47株病毒全长基因片段,测定其序列,并与GenBank中19株代表性乙脑病毒株全基因序列进行核苷酸和氨基酸比对分析。结果 M47株属于基因Ⅲ型,与GenBank中19株代表性乙脑病毒株核苷酸序列同源性为79.4%~99.6%,氨基酸序列同源性为91.3%~99.6%;氨基酸序列比对发现,该毒株存在一个独特的氨基酸位点改变E-29(S-R)。结论 M47株独特的氨基酸位点改变E-29(S-R)可能是导致其低神经外毒力的原因。     

埃可病毒9型分离株MSH-KM812 VP1基因的遗传特征

目的分析2010年昆明市引起手足口病(Hand,foot and mouth disease,HFMD)的病原埃可病毒9型(Echovirus 9,E9)分离株MSH-KM812 VP1基因的遗传特征。方法分别采用RD细胞和Hep-2细胞对3份HFMD患儿粪便标本进行病毒分离,应用RT-PCR法分2段扩增病毒VP1基因,并进行序列测定。应用NCBI BLAST软件对所测定的节段序列进行比对;Omiga软件对所测定的节段序列的核苷酸及推导的氨基酸序列进行编辑、比对和拼接;应用Mega 5.05软件进行序列分析,并与15个E9参考株的VP1基因序列进行比较,构建基因系统进化树。结果从3份HFMD患儿粪便标本中分离到1株E9,命名为MSH-KM812,其VP1区的核苷酸长度为888 bp。MSH-KM812株与其他15个E9参考株的核苷酸和氨基酸序列同源性分别为78.6%～98.0%和87.5%～99.3%,与中国分离株的核苷酸和氨基酸序列同源性分别为92.7%～98.0%和97.0%～99.3%,其中与中国江苏分离株M10MF37 China2010核苷酸和氨基酸序列同源性最高,分别为98.0%和99.3%,而与德国分离株Hill的核苷酸和氨基酸序列同源性最低,分别为78.6%和87.5%。基因进化树分析显示,MSH-KM812分离株与中国江苏分离株M10MF37 China 2010和中国山东分离株05189-SD-CHN-2005-E9属于同一个进化分枝。结论 MSH-KM812分离株为E9,与中国其他分离株同属一个进化分枝。     

CTN株疫苗对中国狂犬病病毒街毒代表株的保护性

目的研究人用狂犬病病毒CTN株疫苗对中国狂犬病病毒街毒代表株的保护性,为评估该疫苗的适用性提供依据。方法用CTN株疫苗免疫昆明小鼠,用3株具有代表性的街毒株CQ92、HN06、J和标准攻击毒株CVS经脑内和肌肉攻击,以未免疫小鼠进行脑内和肌肉攻击为对照,观察CTN株疫苗的保护效果。结果原倍和5倍稀释的疫苗免疫的小鼠经3株街毒肌肉攻击后,均得到100%的保护,与对照组比较,差异均有极显著意义;经3株街毒脑内攻击后,原倍疫苗免疫的小鼠均得到100%的保护,5倍稀释的疫苗免疫的小鼠对3株街毒CQ92、HN06、J的保护率分别为85%、75%和77.8%,与对照组比较,差异均有极显著意义。结论CTN株疫苗总体上能有效预防我国目前狂犬病的流行。     

狂犬病毒街毒株糖蛋白基因克隆、测序与表达

经实验研究证明狂犬病毒街毒株SBD0 7株具有较好的免疫原性后 ,通过RT PCR法 ,克隆了该毒株的糖蛋白 (G)基因 ,并进行了全序列测定。结果表明该株狂犬病毒G基因与疫苗株 (aG株 )的核酸及蛋白同源性分别为 85 8%和 88 5 %。以痘苗病毒为载体成功地表达了该基因 ,经小鼠实验表明能诱生较高滴度的狂犬病毒中和抗体 ,并能保护狂犬病毒致死量的攻击     

滁州市CDC 2004～2007年预防狂犬病门诊就诊者监测分析

目的对滁州市CDC2004～2007年预防狂犬病门诊就诊者的登记资料及流行病学监测资料进行监测分析。方法采用描述性流行病学方法,对暴露者的登记资料及当地狂犬病流行病学资料进行分析。结果4年间共有12种动物不同程度伤人11024例,其中被犬伤害者由2004年的84.03%降至2007年的65.03%,猫伤由2004年的12.28%上升至2007年的28.12%,其他动物如鼠、兔等肇事呈逐年增多趋势;被动物伤害后常规接种人用狂犬病疫苗,Ⅲ级暴露者加注狂犬病人免疫球蛋白,4年来无免疫失败现象;免疫人群中,年龄最小为出生19d,最大93岁,小于1岁39例,大于80岁78例;接种狂犬病疫苗者中,7支组和6支组阳性率均显著优于5支组;接种狂犬病疫苗联合狂犬病人免疫球蛋白者与单用狂犬病疫苗者相比,无明显自动免疫力滞后现象。结论对狂犬病暴露者彻底清洗、消毒伤口,并全程接种狂犬病疫苗,Ⅲ级暴露者加注狂犬病人免疫球蛋白,可以阻止狂犬病发生。     

2009年云南省昆明地区柯萨奇病毒B5的遗传特性分析

目的对2009年中国云南省昆明地区柯萨奇病毒B5(Coxsackievirus group B5,CVB5)的部分VP1基因序列进行分析,以了解CVB5的遗传特性。方法收集2009年中国云南省昆明地区临床诊断为无菌性脑炎患儿的200份粪便标本,设计针对CVB的通用引物,利用半巢式RT-PCR扩增部分VP1基因。PCR产物直接测序后,采用Omiga和Mega 5.05等生物学软件进行核苷酸、氨基酸序列及系统进化分析。结果共分离出7株CVB5,其部分VP1基因之间的核苷酸和氨基酸序列同源性均较高,分别为92.7%～98.5%和93.6%～100.0%;与中国其他不同地区参考株的核苷酸序列同源性为80.1%～99.1%,其中与中国山东株98388-SD-CHN-1998同源性较低;与中国其他不同地区参考株的氨基酸序列同源性为84.4%～100.0%,其中与中国河南株CoxB5-Henan-2010和中国山东株98388-SD-CHN-1998之间同源性最低;与其他不同国家参考株比较,其核苷酸和氨基酸序列同源性分别在77.5%～89.1%和92.1%～96.3%之间;与原型株Faulkner的核苷酸和氨基酸序列同源性分别为79.6%～80.9%和92.1%～95.4%。基因系统进化分析显示,分离的7株CVB5属于相对独立的1个分枝,中国流行株除98388-SD-CHN-1998外,构成1个分枝。结论 2009年中国云南省昆明地区CVB5流行株属于相同基因型。     

肠道病毒71型吉林分离株的全基因组序列分析

目的对2011年吉林省肠道病毒71型(enterovirus type 71,EV71)分离株全基因组进行序列分析。方法将手足口病伴发重症脑炎患者的粪便样品接种至Vero细胞,分离EV71;采用RT-PCR法分8段扩增全基因组序列,进行双酶切及序列测定;应用Mega5软件构建EV71系统进化树;通过DNAMAN7和DNASTAR7软件进行EV71分离株核苷酸和氨基酸序列的同源性比较;经RDP4软件对EV71分离株进行同源重组分析。结果粪便样品接种至Vero细胞2 d后,细胞出现圆缩、透亮、聚堆的病变现象;各PCR扩增产物经双酶切鉴定,均可见与预期大小一致的目的条带;经种系进化树分析显示,EV71分离株属C4a亚型,命名为EV71-JiLin-11-China;其与A、B和C亚型间核苷酸序列的平均同源性分别为22.44%、17.72%和11.96%,与A、B和C亚型间氨基酸序列的平均同源性分别为96.0%、97.2%和97.3%;全基因同源重组分析显示,EV71分离株的165～1 946和7 289～7 366核苷酸区有重组现象,分别源于分离自湖北的C4a-EV71-Hubei-09-China及马来西亚的B4-SB2864-SAR-00和C1-S18062-SAR-98。结论 2011年吉林地区流行的EV71为C4a基因型,为EV71基因特征及流行病学的研究提供了实验依据。