毕赤酵母组成型表达载体的构建及报告蛋白表达评价

目的构建毕赤酵母(Pichia pastoris)组成型分泌表达载体,并表达报告蛋白葡萄球菌核酸酶(staphylococcus nuclease,SNase,NucA),以评价其表达外源蛋白的能力。方法从巴斯德毕赤酵母GS115基因组中PCR扩增毕赤酵母甘油醛-3-磷酸脱氢酶启动子(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase promoter,pGAP)片段,克隆至载体pPIC9K中,构建组成型分泌表达载体pGHKα;从金黄色葡萄球菌基因组中PCR扩增编码报告蛋白金黄色葡萄球菌NucA成熟肽的序列nucA,克隆至载体pGHKα中,构建重组表达质粒pGHKα-nucA,经SacⅠ和BglⅡ依次酶切线性化后,电转化至毕赤酵母GS115中;PCR及TB-D平板法筛选阳性重组酵母菌;Tricine-SDS-PAGE检测表达产物;琼脂扩散法检测重组酵母菌表达上清液的核酸酶活性。结果组成型分泌表达载体pGHKα经PCR鉴定,证明构建正确;重组表达质粒pGHKα-nucA经PCR及测序鉴定,证明nucA基因片段正确插入载体pGHKα中;重组酵母菌GS115/pGHKα-nucA经PCR及TB-D平板法检测证明构建成功;表达的目的蛋白相对分子质量约为17 000,表达量约占上清总蛋白的42%,且具有显著的核酸酶活性。结论成功构建了毕赤酵母组成型分泌表达载体pGHKα,其能正确表达报告蛋白NucA,且表达的蛋白能分泌到细胞外,表达效率高,为异源蛋白在毕赤酵母中的安全高效表达奠定了基础。     

重组人乳铁蛋白基因克隆及表达

目的　构建重组人乳铁蛋白 (HLF)的毕赤酵母分泌表达菌株 ,并对表达产物进行评价。方法　由外周血白细胞总RNA经RT- PCR克隆获得HLF基因结构cDNA ,测序后克隆入酵母表达载体获得质粒pPIC9K- HLF ,线性化后电转化入毕赤酵母 ,经G4 -18 YPD筛选多拷贝后进行甲醇诱导表达。结果　获得基因与GenBank中的人HLF0 1基因基本相符。 2株多拷贝菌株诱导表达产物均能与人HLF抗体反应 ,具有抑制大肠杆菌生长的作用。结论　获得了能分泌有活性HLF的重组人乳铁蛋白 (HLF)的毕赤酵母分泌表达菌株。     

胆盐水解酶基因在毕赤酵母中的表达

目的在毕赤酵母中表达胆盐水解酶(Bile salt hydrolase,BSH)基因。方法以重组质粒pMD18-BSH为模板,PCR扩增BSH基因,克隆至毕赤酵母表达载体pGAPZαA上,经AvrⅡ线性化,电转化至毕赤酵母SMD1168,PCR筛选阳性重组子,诱导表达,表达产物经Western blot进行分析。结果重组表达质粒pGAPZαA-BSH经双酶切及测序证明构建正确;经PCR鉴定阳性的重组酵母菌的诱导表达产物经SDS-PAGE分析,可见相对分子质量约35000的目的蛋白表达条带;表达的重组蛋白可与兔抗植物乳杆菌多克隆抗体发生特异性反应。结论在毕赤酵母中成功表达了BSH,为BSH结构与相关功能及高效降解胆固醇的基因工程菌株的研究奠定了基础。     

经基因优化的HPV16L1蛋白在毕赤酵母中的表达

目的利用毕赤酵母表达系统(Pichia pastoris)高效表达HPV16L1蛋白。方法按照Pichia pastoris密码子偏爱性合成HPV16L1基因,构建pAO819r-16L1表达载体,电转化至GS115菌株中,经MD板和不同浓度G418筛选,挑取高拷贝整合菌株,甲醇诱导目的蛋白的表达,用HPV16L1抗血清,经Western blot检测蛋白的特异性。结果重组质粒pAO819r-16L1在甲醇营养型酵母菌株中经甲醇诱导后可表达HPV16L1蛋白,在试管中的表达量超过10mg/ml,经Western blot验证,该蛋白可与抗血清特异结合,在相对分子质量55000附近出现目的条带,证明该蛋白确为HPV16L1蛋白。结论利用毕赤酵母表达系统可高效表达HPV16L1蛋白,为研制HPV疫苗奠定基础。     

人溶菌酶-木聚糖酶融合基因在毕赤酵母中的表达

目的在毕赤酵母中表达人溶菌酶(Human lysozyme,hLY)-木聚糖酶(Xylanases,XynⅡ)融合基因。方法通过PCR技术将hLY基因与XynⅡ基因连接,中间插入肠激酶识别位点序列;将其克隆至载体pPIC9K上,构建重组表达质粒pPIC9K-XynⅡ-EKsite-hLY,经SacⅠ线性化后,电转化毕赤酵母GS115,通过G418抗性筛选得到高拷贝转化子,PCR鉴定为阳性的克隆用甲醇进行诱导;表达的融合蛋白经Sephadex G-75凝胶柱层析纯化后,用肠激酶酶切,分别采用改良舒加法和DNS法测定hLY和XynⅡ的活性。结果获得的融合基因序列与理论序列完全一致;重组表达质粒构建正确;融合蛋白的hLY和XynⅡ活性分别为170和158 U/ml,经肠激酶酶切后,hLY的活性为520 U/ml,XynⅡ的活性达244 U/ml。结论已在毕赤酵母中成功表达了XynⅡ-EKsite-hLY融合基因,经肠激酶酶切后的目的蛋白活性均有较大提高。     

应用毕赤酵母表达中国株HIV-1核心蛋白Gag

目的 构建含HIV-1Gag全长基因的重组酵母表达质粒pPICGAG，并在毕赤酵母中进行表达。方法用Not I和XhoI将含HIV－1 Gag全长基因的质粒pKSGAG双酶切后，克隆到酵母表达载体pPIC9中，构建了重组表达质粒 pPICGAG。pPICGAG用 SacI线性化后，电转化毕赤酵母 GS115，PCR鉴定阳性酵母转化子，并分别将PCR阳性的酵母转化子在BMGY和BMMY培养基中进行诱导表达，表达产物进行SDS-PAGE电泳分析。结果 酵母转化子的整合率为72．7％。SDS-PAGE结果显示表达蛋白的相对分子质量为55000左右，与预计计算的值相同。Western blot结果显示表达蛋白能与单克隆抗体发生特异性反应。结论 在毕赤酵母中成功地表达了HIV-1核心蛋白Gag，且表达的蛋白具有良好的反应原性和特异性。     

人Ⅰ型精氨酸酶基因的克隆及其酵母表达

用RT-PCR扩增人Ⅰ型精氨酸酶基因(hAⅠ),经DNA序列分析后,插入含α分泌信号肽序列的毕赤酵母表达载体pPIC9K中,构建重组表达质粒pPIC9K-hAⅠ.转化酵母宿主菌SMD1168,菌落PCR鉴定目的基因的整合,甲醇诱导工程酵母表达,用酶活检测的方式鉴定目的基因的表达,结果显示,经诱导的工程酵母胞内精氨酸酶活性为对照的2.3倍.     

人LIGHT-Fc融合蛋白在毕赤酵母中的表达及鉴定

目的利用酵母表达系统制备人LIGHT-Fc融合蛋白。方法利用基因工程方法构建含人LIGHT胞外段基因和人Ig G4 Fc基因的重组质粒p PIC9K-LIGHT-Fc,经SalⅠ线性化后电转化感受态酵母菌GS115,PCR鉴定重组转化子。将阳性重组转化子经甲醇诱导表达后,RT-PCR法检测目的基因的转录水平,SDS-PAGE及Western blot法进行表达产物的鉴定。结果表达质粒p PIC9K-LIGHT-Fc经酶切及测序鉴定,证明构建正确。10个重组子均为Mut+型阳性转化子,经甲醇诱导后可扩增出特异性目的基因片段。表达的重组LIGHT-Fc融合蛋白相对分子质量约45 000,可与鼠抗人LIGHT多克隆抗体发生特异性结合。结论人LIGHT-Fc融合蛋白在毕赤酵母中已成功获得了表达,为进一步开展其生物学功能的研究奠定了基础。     

重组靶向毒素IL-6(23)-PE40_(KDEL)在毕赤酵母中的表达及其活性

目的利用毕赤酵母表达系统表达IL-6(23)-PE40KDEL重组靶向毒素,并检测其杀伤肿瘤细胞的活性。方法采用PCR技术,将目的基因IL-6(23)-PE40KDEL插入到pPIC9载体中SnaBⅠ与NotⅠ位点,电转化至巴斯德毕赤酵母GS115中,筛选Mut-型重组酵母;甲醇诱导表达,体外细胞试验检测其细胞毒性。结果获得12株Mut-重组酵母,其中8株具有细胞毒性,表达产物占上清液蛋白的9%～12.7%;15"l以上的表达产物在体外对SP2/0、HL-60、HepG2、BGC-832和HCT-116细胞具有高度杀伤活性,对CK、HeLa和NIH/3T3细胞无明显影响。结论IL-6(23)-PE40KDEL重组靶向毒素在毕赤酵母GS115中获得表达,并具有选择杀伤肿瘤细胞的活性。     

恶性疟原虫膜蛋白Pf332-DBL区在毕赤酵母中的表达

目的在毕赤酵母中表达恶性疟原虫膜蛋白Pf332-DBL区。方法采用PCR技术,扩增Pf332-DBL区基因序列,并插入到pPICZαA载体EcoRⅠ和XbaⅠ位点间,电转化至毕赤酵母X-33中,筛选阳性重组酵母,甲醇诱导表达,并通过亲和层析纯化重组蛋白,Western blot进行鉴定。结果获得1株阳性重组酵母;表达的重组蛋白相对分子质量约33000,诱导72h,目的蛋白的表达量最高,占上清蛋白总量的85%;纯化的重组蛋白浓度为800μg/ml,与抗His标签的鼠源单抗和抗Pf332-DBL单抗均可发生特异性反应。结论已成功地在毕赤酵母中表达了恶性疟原虫膜蛋白Pf332-DBL区,为下一步利用该蛋白进行亚单位疫苗的研制及其功能研究奠定了基础。     

多拷贝重组HBsAg质粒的构建及在毕赤酵母中的高效表达

目的通过构建多拷贝数表达质粒,获得高表达乙型肝炎表面抗原(HBsAg)的毕赤酵母(Pichia pastoris)菌株。方法通过对单拷贝表达质粒进行改造,将表达盒(5′AOX-HBsAg-TT)重复导入载体,构建多拷贝数表达质粒。通过电转化、15L规模发酵和纯化,获得纯化HBsAg颗粒,并对表达产物的特异性、免疫原性及表达量与拷贝数间的关系进行分析。结果多拷贝数重组毕赤酵母的表达产物经ELISA、SDS-PAGE、Western blot检测,显示出良好的特异性,电镜观察证明表达产物能够自发装配成22nm类病毒颗粒(VLP),其表达量与拷贝数呈正相关,拷贝数提高未对菌体正常生长带来影响,HBsAg制备的免疫原能有效刺激小鼠产生保护性抗体。结论含多拷贝数表达质粒的工程菌可显著提高毕赤酵母HBsAg表达量。     

人纤溶酶原K5基因在毕赤酵母中的表达及其抗肿瘤活性

目的在毕赤酵母中表达人纤溶酶原K5基因,并检测hK5蛋白的抗肿瘤活性。方法根据酵母遗传密码的偏爱性优化设计hK5基因,构建重组表达质粒p819-8α-hK5,经G418加压筛选和甲醇诱导表达,并对摇瓶发酵条件进行优化。表达的hK5蛋白经纯化后,通过荷H22肿瘤昆明小鼠模型检测其抗肿瘤活性。结果筛选到2株高表达hK5蛋白的转化子,摇瓶表达量超过150mg/L,纯化后的蛋白纯度大于95.0%,并能够显著抑制昆明小鼠H22肿瘤的生长。结论hK5基因能够在毕赤酵母中高效分泌表达,且表达的hK5蛋白具有良好的抗肿瘤活性。     

圆弧青霉碱性脂肪酶在毕赤酵母中的高效表达

目的在毕赤酵母(Pichia pastoris)中高效表达圆弧青霉碱性脂肪酶(Alkaline lipase,LipⅠ)。方法采用RT-PCR法从圆弧青霉PG37中扩增lipⅠ基因的cDNA片段,克隆入表达质粒pPIC9K中,构建重组表达质粒pPIC9K-lipⅠ,转化入毕赤酵母GS115,筛选高拷贝重组子GS115/lipⅠ,甲醇诱导表达,并对诱导表达条件进行初步优化。结果 GS115/lipⅠ在培养基初始pH6.0,甲醇添加量1.0%的BMMY培养基中,于30℃诱导96h,发酵液上清中LipⅠ的活性为10.5U/ml。在培养基初始pH9.0,甲醇添加量1.0%的BMMY培养基中,24℃诱导120h,GS115/lipⅠ发酵液上清中LipⅠ的活性最高,达407U/ml。结论在毕赤酵母GS115中高效表达了具有活性的圆弧青霉LipⅠ。     

猪血清白蛋白基因的克隆及其在毕赤酵母中的分泌表达

目的克隆猪血清白蛋白(PSA)基因,并在毕赤酵母中分泌表达。方法Trizol法提取新鲜猪肝组织总RNA,经RT-PCR扩增PSA全长cDNA,克隆至酵母分泌型表达载体pPICZaC,构建重组表达质粒pPICZaC-PSA,电转化至毕赤酵母X33,甲醇诱导表达,表达产物进行SDS-PAGE和Western blot分析。结果重组表达质粒pPICZaC-PSA经双酶切及测序鉴定正确,表达的重组蛋白经SDS-PAGE分析,在相对分子质量约69500处可见特异条带,表达量为菌体总蛋白的29.5%,紫外吸收法测定蛋白含量为0.06mg/ml,并可与PSA多抗发生特异性反应。结论已成功克隆了PSA基因,并在毕赤酵母中获得表达。     

重组猪源抗菌肽Cecropin P1在毕赤酵母中的分泌表达与活性研究

为构建活性表达重组猪源抗菌肽Cecropin P1的酵母基因工程菌,采用重叠区基因扩增拼接法设计并合成其编码基因,分别载入分泌型表达载体pPICZαB和pGAPZαA中,酶切线性化后电穿孔导入酵母细胞进行整合,经高拷贝整合子筛选以及表型筛选获得高效表达抗菌肽的重组菌株,经培养条件优化确定摇瓶发酵抗菌肽的最佳收获时间,据...     

HBsAg/GM-CSF融合蛋白的克隆及其在毕赤酵母中的表达

目的在毕赤酵母中表达HBsAg/GM-CSF融合蛋白。方法利用PCR扩增HBsAg和GM-CSF基因,通过15个氨基酸的连接肽将两个片段连接,获得融合基因S-GM,克隆入酵母穿梭质粒pPIC9K中。将重组质粒9K-S-GM电转化毕赤酵母后,G418筛选,甲醇诱导,HBsAg/GM-CSF融合蛋白表达。经SDS-PAGE检测表达水平,Western blot检测表达产物特异性。结果PCR扩增的片段与预期大小一致,HBsAg/GM-CSF融合蛋白在毕赤酵母中获得了表达。Western blot检测,该融合蛋白同时具有HBsAg和GM-CSF的特异性。结论该融合蛋白的获得为提高乙肝疫苗的免疫原性奠定了科学基础。