黑曲霉TNA-09中α-葡萄糖苷酶基因敲除的研究

以柠檬酸生产菌黑曲霉TNA—09为原始菌株,通过农杆菌介导的方法,将其α-葡萄糖苷酶基因敲除,得到基因敲除菌株TGA101。对原始菌株黑曲霉TNA-09和基因敲除菌TGA101 α-葡萄糖苷酶活力测定,结果相对于TNA—09菌株,TGA101菌株α-葡萄糖苷酶活力下降61．15％。在柠檬酸发酵试验中表现出相对于黑曲霉TNA-09,TGA101菌株发酵液中异麦芽糖含量降低84．67％,柠檬酸提高2．34％,糖酸转化率提高2．34％。     

葡萄糖氧化酶基因在黑曲霉中的分泌表达

通过PCR扩增从一株葡萄糖氧化酶生产菌黑曲霉中克隆得到1818bp葡萄糖氧化酶基因GOD,将GOD基因与糖化酶基因的5’同源臂、3’同源臂进行重叠延伸,构建葡萄糖氧化酶基因的表达框。将此表达框插入载体pSZH中,构建黑曲霉同源重组表达载体pSZH-GOD。将载体pSZH-GOD通过冻融法转化农杆菌AGL1,进而通过农杆菌介导法转化高产糖化酶的黑曲霉。经潮霉素筛选和PCR鉴定获得8株重组菌株。对8株重组菌株的发酵液上清液进行酶活测定,结果表明葡萄糖氧化酶基因在高产糖化酶的黑曲霉中得到了分泌表达,静置培养6d后其分泌表达的葡萄糖氧化酶酶活最高可达1.166U/mL,而在出发菌株中检测不到葡萄糖氧化酶的分泌表达。同时,重组菌株胞内表达的葡萄糖氧化酶最高酶活可达11.45U/mL,是出发菌株的266倍。此研究结果为简化葡萄糖氧化酶发酵生产工艺、提高酶产量提供了新的途径。     

不同乳酸菌对葡萄酵素发酵特性及代谢产物的影响

以葡萄为原料，通过研究6株不同乳酸菌接种发酵过程中的发酵特性（还原糖、可溶性固形物、pH、总酸）、代谢产物（有机酸、β-葡萄糖苷酶活力、SOD酶活力）及生长情况（菌落总数）来筛选出适合葡萄酵素发酵的乳酸菌。结果表明:ACCC 11095在低pH的条件下生长情况优于其它菌株；ACCC 11095在发酵4 d后，还原糖、可溶性固形物趋于稳定；ACCC 11095、ATCC 14917和GDMCC 1.380于第5 d发酵结束后pH为3.33~3.35，总酸含量为11.07~12.74 g/L，显著高于其它三株菌（P<0.05）；发酵结束后GDMCC 1.380的超氧化物歧化酶活力最高，为37.50 U/mL，其次是ATCC 14917，而ACCC 11095的发酵液呈现出最高的β-葡萄糖苷酶活力，为400.70 μU/mL；ACCC 11095产乳酸能力是其它菌株的1.2~30倍，6株菌均能代谢苹果酸且不产生乙酸；ACCC 11095和GDMCC 1.380的葡萄酵素液发酵5 d后，活菌数明显增加，分别为8.42和8.50 lg cfu/mL。综上所述，植物乳杆菌ACCC 11095产乳酸和产酶能力相对较强，具有更大的发酵潜力和应用于葡萄酵素生产的价值。     

利用纤维素原料生产柠檬酸菌株的筛选

从土壤中筛选分离到一株能利用纤维素原料产柠檬酸的黑曲霉菌株S。研究表明:预处理稻草为菌株适宜利用的纤维素原料;以3%预处理稻草为基质,菌株的发酵特性是发酵12h时CMCase活力达218.4U/mL,FPase活力达44.1U/mL,12h后酶活力下降;发酵60h产酸率达22%。通过对菌株的产酸驯化筛选和复筛,获得一株产柠檬酸性能稳定的菌株黑曲霉S6。黑曲霉S6可作为利用纤维素原料生产柠檬酸研究的出发菌株。     

黑曲霉SH-2基因组中注释的7个α-葡萄糖苷酶基因的鉴定与表达分析

已公布的黑曲霉CBS513.88基因组中注释了7个α-葡萄糖苷酶基因信息,但其中主要高活性基因一直未报道。本文通过同源重组构建了黑曲霉SH-2菌株7个α-葡萄糖苷酶基因的系列多重敲除株。α-葡萄糖苷酶活性测定结果显示仅agdB敲除株的酶活相较于野生株SH-2降低36%,而其余多重敲除株菌株酶活影响较小。以敲除糖化酶、淀粉酶背景的黑曲霉SH-2-3菌株为宿主,分别敲除和过量表达基因agdB及与已报道的黑曲霉α-葡萄糖苷酶基因序列相似度最高的基因agdA,结果显示agdB敲除株生长速度在不含葡萄糖的培养条件下最慢,并随着葡萄糖添加量增加;agdB过量表达株酶活提高到野生型的10倍。本研究结果说明目前黑曲霉SH-2基因组中所注释的7个α-葡萄糖苷酶基因中仅agdB为主要高活性α-葡萄糖苷酶基因（占总体酶活36%）,黑曲霉SH-2中α-葡萄糖苷酶基因仍需进一步探索。     

一株细菌发酵大豆的α-葡萄糖苷酶抑制活性研究

研究了不同菌株发酵大豆的α-葡萄糖苷酶抑制活性,与纳豆菌、米曲霉、黑曲霉和红曲霉菌株相比,细菌菌株SY07发酵大豆表现出对α-葡萄糖苷酶的强抑制作用。SY07菌株发酵大豆过程中,随着微生物代谢活动的增强,样品逐渐呈现α-葡萄糖苷酶抑制活性,12h发酵样品的抑制率为37.93%,发酵24,36,48h抑制率无明显差异,约为50%,发酵12,48h样品的IC50值分别为5.077,2.079mg/mL。SY07菌株具有优良的产α-葡萄糖苷酶抑制剂的潜能,可望应用于新型降血糖功能性发酵大豆食品或调味品的研发。     

甘薯生淀粉糖化酶菌株的分离与诱变育种

以红薯淀粉作唯一碳源的察氏培养基,从腐烂甘薯分离筛选出1株产甘薯生淀粉糖化酶能力较强的黑曲霉菌株,出发菌株发酵液粗酶的生淀粉降解酶活力为55.10 U/mL.通过紫外线诱变,突变株的粗酶活提高36.70%.再经亚硝基胍诱变,生淀粉酶活达116.84 U/mL,进一步提高34.30%.     

乳酸菌发酵混合蔬菜的初步研究

采用单因素试验和正交试验,研究并优化混合蔬菜乳酸菌发酵工艺,确定适宜的工艺参数,并对发酵液的感官、酶活、理化指标进行检测。结果表明,优化的乳酸菌发酵混合蔬菜的发酵条件为加糖量40%,嗜热链球菌∶保加利亚乳杆菌=1.5∶1.0,接种量3.00%,发酵时间20 d,发酵产品中淀粉酶活28.74 U/mL,超氧化物歧化酶活45.63 U/mL,蛋白酶活51.66 U/mL,总多酚4.52 mg/mL,总黄酮63.40 mg/mL,总糖344.38 g/L,还原糖291.25 g/L,总酸8.48 g/L,亚硝酸盐含量为0.16 mg/kg,感官评分为88分。该发酵产品具有一定的营养价值和保健功效。     

柠檬酸高浓度发酵过程中糖化酶活性对柠檬酸发酵的影响

在进行柠檬酸高浓发酵的研究中发现,柠檬酸高浓发酵残糖高的主要原因是发酵料液中的糖化酶迅速失活、液化淀粉糖化不完全。对生产菌株分泌糖化酶的性质进行研究显示,该酶能够耐受较低pH值,在pH 2.0以下时仍能保留50%以上的酶活性,但对柠檬酸耐受性较差,20 g/L柠檬酸就会对酶活力造成强烈抑制,酶活力损失达90%以上。通过在发酵料液中预加商品糖化酶,加快糖化进程,及时完成糖化,解决了柠檬酸高浓度发酵残糖高的问题。     

高产α-葡萄糖苷酶黑曲霉的微波选育及发酵条件优化

采用微波诱变技术对黑曲霉J2进行选育,得到1株α-葡萄糖苷酶活力较高的突变菌株ANY-4,酶活力达到305 U/mL,比出发菌株提高了38.6%,且稳定性良好。通过单因素和正交试验得到最适培养条件为:玉米淀粉80 g/L、玉米浆干粉40 g/L、初始pH 4.5、装液量50 mL/500 mL、接种量3%、培养温度36℃、摇床转速240 r/min、培养时间40 h。在最优培养条件下进行发酵,α-葡萄糖苷酶活力达到427 U/mL,比优化前提高了40%。     

黑曲霉DB056发酵产柚苷酶中试放大研究

对在实验室筛选得到的产柚苷酶菌株黑曲霉DB056进行7、20和200L规模的逐级发酵放大研究.采用高效液相色谱法测定柚苷酶的活力.试验结果表明:随着发酵规模的增大,柚苷酶的两种组分——α-鼠李糖苷酶与β-葡萄糖苷酶的酶活力水平有一定的波动,但酶活力变化基本一致;在200 L规模的发酵中,α-鼠李糖苷酶与β-葡萄糖苷酶的最大酶活力分别为1 069 U/mL和727 U/mL,超过7L和20 L规模发酵过程中柚苷酶的活力水平,从而实现了黑曲霉DB056产柚苷酶200L规模的发酵,显示出该菌株良好的发酵性能和工业应用价值.     

60Co-γ射线-离子束复合诱变法选育高产糖化酶菌株的研究

以黑曲霉UV-4为出发菌株,利用60Co-γ射线与离子束进行复合诱变。试验表明:经复合诱变,可以获得高产糖化酶的菌株AnUVγN+7,酶活达到1 100.9U/mL,是原始菌株UV-4(156.1U/mL)的7倍,菌株经过7次传代,结果显示酶活较稳定,以此可选育高产糖化酶菌株。     

优势醋酸菌株的筛选鉴定及乙醇脱氢酶活性研究

为满足苹果醋液态深层发酵的需要,从果渣、泥土中选育出生长良好、遗传稳定的较优醋酸菌株,实现高效率、高产量的苹果醋中试生产。经初筛、复筛、产酸试验、遗传稳定性试验、生理生化试验和16S rDNA序列分析鉴定,优选菌株Y010鉴定为巴氏醋酸杆菌（Acetobacter pasteurianus）。进一步研究该菌株在苹果醋发酵过程中乙醇脱氢酶（ADH）活性与产酸量、产酸速率的关系。结果表明：该菌株在醋酸发酵48 h时酶活较高,达到4.62 U/mL,产酸速率最大达到0.51 g/（L·h）,发酵120 h总酸含量最高达到53.12 g/L,其ADH酶活与产酸速率变化趋势一致。     

安卡红曲霉液态发酵产色素及糖化酶的研究

对1株红曲霉(Monascus anka sp.)液态发酵产色素及糖化酶的培养条件进行了优化。研究了碳源、氮源、装液量、接种量等因素对色素积累及糖化酶活力的影响。并通过正交试验确定了最佳培养条件:甘油10%,蛋白胨1.5%,温度32℃,初始pH5.75,接种量6%,装液量75mL/500mL,种龄5d。验证实验表明,以色价最佳组合条件发酵时,发酵液色价达到263.5U/mL;以糖化酶活最佳组合条件发酵时,酶活达到409.6U/mL;以色价和糖化酶活力最佳组合条件发酵时,发酵液色价为260.3U/mL,糖化酶活为404.0U/mL。     

产葡萄糖氧化酶黑曲霉紫外诱变及产酶条件的研究

目的提高黑曲霉中葡萄糖氧化酶的产量。方法紫外诱变法选出产酶优势菌株,优化碳源、氮源、碳酸钙、发酵时间等条件。结果黑曲霉发酵液酶活达到6．5U／mL,比初始酶活提高5倍;单因素条件试验表明,最适碳源是蔗糖,最适氮源是蛋白胨和NaNO3,发酵周期为48h,培养温度是30℃,液体培养基的初始pH值为6．0产酶效果最好。结论紫外诱变后,葡萄糖氧化酶的活力有明显提高。     

产葡萄糖氧化酶黑曲霉紫外诱变及产酶条件的研究

目的提高黑曲霉中葡萄糖氧化酶的产量。方法紫外诱变法选出产酶优势菌株,优化碳源、氮源、碳酸钙、发酵时间等条件。结果黑曲霉发酵液酶活达到6.5 U/mL,比初始酶活提高5倍;单因素条件试验表明,最适碳源是蔗糖,最适氮源是蛋白胨和NaNO₃,发酵周期为48 h,培养温度是30℃,液体培养基的初始pH值为6.0产酶效果最好。结论紫外诱变后,葡萄糖氧化酶的活力有明显提高。     

黑根霉Q3Y在旱胁迫效应下的菌丝生长特性及糖化产物

选取产糖化酶较强和糖化能力较高的黑根霉（Rhizopus nigricans）Q3Y进行菌丝体的抗旱逆境液态发酵培养,分析了菌株Q3Y菌丝生长状况及菌丝对糯米的利用。结果表明,在土豆汁培养基中添加0.50%的琼脂,使其黏度达到500 mPa·s,黑根霉菌Q3Y在该培养基中菌丝生长状态良好,细胞分散均匀;在料水比为6∶10（g∶mL）,含水量为62.5%糯米培养液中,黑根霉菌株Q3Y菌丝体能得到更好的生长,培养72 h还原糖、可溶性总糖及糖化酶酶活分别达到26 g/100mL、32 g/100mL、23.0 U/mL。     

高产高纯度果胶甲酯酶黑曲霉工程菌的构建

为获得一株高产高纯度的果胶甲酯酶的黑曲霉工程菌,提高果胶甲酯酶的产量,从果胶酶生产菌种中克隆了果胶甲酯酶基因pmeA,通过同源重组的原理,冻融法转化农杆菌、农杆菌介导法转化黑曲霉方法,成功构建了分泌表达果胶甲酯酶的纯合重组菌株TH-2（glaA::pmeA）。基本发酵培养基中发酵第9 d上清中最高酶活达到467.77 U/mL。进一步敲除重组菌株TH-2（glaA::pmeA）中背景蛋白酸稳定的α-淀粉酶的编码基因asaA,获得纯合重组菌株TH-2（glaA::pmeA?pyrG?asaA）。该菌株在添加1%的硫酸铵的发酵培养基中培养7 d后,发酵液上清中主要的背景蛋白均消失。但是与纯合重组菌株TH-2（glaA::pmeA）相比,果胶甲酯酶表达量有所下降,最高酶活为255.40 U/mL。重组果胶甲酯酶的最适作用温度为50 ℃,适合的温度范围是40~80 ℃,在80 ℃下仍能维持其酶活性的70%以上,适合的pH范围是3.0~5.0,最适pH为4.0。最终获得了一株温度和pH作用范围较宽的高产高纯度果胶甲酯酶的黑曲霉工程菌。     

黑曲霉产α-转移葡萄糖苷酶固态发酵条件优化

摘要：对产α-转移葡萄糖苷酶的黑曲霉U菌株固态发酵条件进行了优化．结果表明：麸皮和水的质量比为1：1较好，35℃培养48h时产酶量及酶活较高；U菌株生长的最适pH值为6．0；麸皮中的碳源和氮源可以满足该菌株产酶的需要，可以不外加碳源和氮源．     

黑曲霉(Aspergillue niger)产菊粉酶发酵条件的研究

以菊粉为唯一碳源,对样土进行产菊粉酶黑曲霉菌株的初筛,得到17株菌株.用跟踪测酶活的方法进行复筛,获得3株高产菊粉酶菌株,最高酶活达到25.41U·mL-1.然后探讨了不同碳源和氮源对黑曲霉产菊粉酶活力的影响,结果表明,最佳碳源为菊粉,氮源为酵母膏.通过正交实验,得到了优化的产菊粉酶黑曲霉液体发酵条件:菊粉用量为2%.pH5.0,50mL三角瓶中装培养基量为50mL,发酵温度为30℃.