橘绿木霉菌丝体中哌珀霉素a、b的提取及测定

[目的]建立发酵液中橘绿木霉(Trichoderma citrinoviride)菌丝体所产生的哌珀霉素a、b 2个代谢产物的提取和含量测定方法。[方法]采用单因素试验和正交试验,对浸提过程中所使用的乙醇浓度、液料比、提取时间和温度等影响因素进行筛选。在使用HPLC测定哌珀霉素a、b的含量时,其测定的色谱条件为Venusil MP C18色谱柱;以乙腈-水(体积比60∶40)为流动相;流速1.0 m L/min;柱温40℃;2个组分的检测波长均为205 nm。[结果]经优化的提取条件为乙醇浓度70%;液料比(v/w)=5∶1;温度和时间:室温下100 min。用HPLC测定哌珀霉素a和b的线性范围分别为10~150、9.1~137 mg/L;平均回收率分别为100.1%(RSD=1.6%)和99.6%(RSD=2.0%);哌珀霉素a、b粗提物的含量分别为232、210 mg/g。[结论]在此研究中所开发的提取和测定方法简便、可靠,能准确测定橘绿木霉菌丝体产生的次级代谢物哌珀霉素a、b的含量。     

侧柏内生真菌G21代谢产物稳定性及发酵条件优化

[目的]了解侧柏内生真菌G21代谢产物的稳定性,并对其发酵条件进行优化。[方法]不同p H值(2~12)或不同温度(20~120℃)处理G21发酵液,并利用生长速率法测定其抑菌活性变化。采用正交试验法及响应面法对G21发酵条件进行优化。[结果]G21发酵液具有广谱农用抗真菌活性,对苹果腐烂病菌及葡萄白腐病菌抑制作用显著;其发酵液在中性(p H 6~8)及较低温度(50℃)下稳定。优化G21发酵培养基组成为蛋白胨3.1 g/L、葡萄糖11.8 g/L、硫酸镁0.58 g/L、磷酸二氢钾1.0 g/L。[结论]G21发酵液处理过程应避免酸碱及高温,优化得培养基G21发酵产物抑菌活性显著提高。     

天然N-末端人白细胞介素-29成熟肽在毕赤酵母中表达条件的优化

目的优化天然N-末端人白细胞介素-29(Human interleukin-29,hIL-29)成熟肽在毕赤酵母中的表达条件,高效表达天然N-末端hIL-29成熟肽。方法采用单因素试验和L(934)正交试验,分析摇瓶发酵条件下甲醇添加量、起始pH值、诱导时间及诱导温度对毕赤酵母工程菌GS115/hIL-29发酵液A450值的影响;用5 L发酵罐初步探索工程菌株的高密度发酵策略。结果影响重组毕赤酵母摇瓶发酵液A450值的因素重要性依次为:诱导温度>起始pH值>甲醇添加量>诱导时间,最佳发酵条件为:起始pH值7.5、甲醇添加量1.5%、26℃诱导60 h,在此条件下,发酵液的A450值达1.72;高密度发酵策略为:pH 7.5,甲醇与溶氧反相偶联,26℃诱导12 h,在此条件下,目的蛋白的表达量明显高于摇瓶水平;高密度发酵12、24 h表达的蛋白与羊抗人IL-29多抗的反应强度明显高于摇瓶发酵表达的蛋白。结论优化了工程菌株GS115/hIL-29摇瓶发酵和发酵罐高密度发酵条件,实现了重组天然N-末端hIL-29成熟肽在毕赤酵母GS115中的高效表达,为其进一步的中试放大工艺奠定了基础。     

人溶菌酶基因在毕赤酵母中的表达及发酵条件的优化

目的在毕赤酵母中表达人溶菌酶(Human lysozyme,hLY)基因,并对发酵条件进行优化。方法将人工合成的hLY成熟肽基因克隆至表达载体pPIC9K中,电转化至毕赤酵母GS115,通过抗G418筛选获得高拷贝重组子GS115/hly,经甲醇低温诱导表达后,取发酵液上清进行SDS-PAGE分析及酶活性检测,并对培养基初始pH值、甲醇添加量、诱导温度和时间进行优化。结果人工合成的hly测序结果与GenBank中报道的核酸序列完全一致;GS115/hly经PCR鉴定,hly基因已整合入GS115基因组内;经甲醇诱导表达的GS115/hly发酵液上清具有溶菌活性,活性达30U/ml;经SDS-PAGE分析,在相对分子质量约15200处可见目的蛋白条带;GS115/hly的最佳诱导条件为:培养基初始pH5.0,甲醇添加量2.0%,26℃诱导108h。结论在毕赤酵母GS115中表达了具有较高酶活性的hLY,并对发酵条件进行了初步优化。     

一株广谱拮抗细菌的鉴定、发酵条件及其抗菌物质性质

[目的]菌株S46是一株对多种植物病原菌有较好拮抗作用的细菌,为有效防治植物病害,进行菌种的鉴定、发酵培养工艺及抗菌物质性质研究。[方法]通过培养特性、形态特征、生理生化特性和16S rDNA同源性序列分析明确菌株的分类地位;通过发酵单因素实验和各因素正交试验确定菌株的发酵工艺;通过热、酸碱、紫外和日光等处理测定明确活性物质的稳定性。[结果]鉴定菌株S46为唐菖蒲伯克霍尔德氏菌(Burkholderia gladioli),其对多种植物病原菌有拮抗作用,最适发酵培养基配方为大豆粉10g/L,玉米粉15g/L,蔗糖15g/L,磷酸氢二钾1 g/L,酵母粉5g/L;最适培养条件为接种量6%,发酵时间72 h,装瓶量30 mL/250mL,初始pH值7.0,转速180 r/min,温度30℃。该菌株发酵液有较好的热稳定性、紫外光和日光稳定性,但对强酸、强碱和有机试剂都较敏感。[结论]为植物病害的防治提供新的生物防治资源。     

季也蒙毕赤酵母DQ11发酵酒糟水解液生产木糖醇条件的优化

目的优化季也蒙毕赤酵母DQ11发酵酒糟水解液生产木糖醇的条件。方法通过单因素试验和正交试验,优化季也蒙毕赤酵母DQ11发酵酒糟水解液生产木糖醇的发酵温度、初始pH值、转速和接种量,通过高效液相色谱法测定发酵液中木糖醇的含量;采用最佳发酵条件发酵生产木糖醇,检测木糖醇含量。结果摇瓶发酵酒糟水解液生产木糖醇的最佳条件为:发酵温度28℃,起始pH值5.0,接种量5%(v/v),摇床转速180 r/min;以最佳条件发酵酒糟水解液生产木糖醇的含量为9.016 g/L。结论优化了季也蒙毕赤酵母DQ11发酵酒糟水解液生产木糖醇的条件,为以酒糟生产木糖醇的可能性提供了实验依据。     

普那霉素发酵工艺研究

以RP59500为试验菌株,在15 L发酵罐内,研究了普那霉素的发酵工艺。通过单因素条件试验确定了其生物合成的最适温度、接种量。优化了其发酵培养基,并进行了发酵中间补料试验,确定了最佳补料工艺。试验结果表明：以3%淀粉、1.7%蔗糖、1%黄豆粉、1.5%酵母粉、0.5%葡萄糖、0.01%KH2PO4、0.2%MgSO4、0.2%泡敌和0.4%CaCO3的发酵培养基配方,以接种量4.0%,26℃下发酵,在发酵21 h时补加氨基酸,普那霉素的发酵效价达3 000 U/mL。     

基因工程菌发酵液中多种成分快速检测方法的建立

目的建立一种快速检测基因工程菌发酵液中葡萄糖、甘油、甲醇和乙酸含量的方法。方法采用HPLC法检测基因工程菌发酵液中葡萄糖、甘油、甲醇、乙酸的含量:使用Aminex誖HPX-87H column(300 mm×7.8 mm,9μm),以5 mmol/L H2SO4溶液作为流动相,在柱温35℃、流速0.60 ml/min的条件下,用示差折光检测器进行检测,采用外标法定量。对方法进行系统适用性、专属性、检测限、定量限、线性范围、准确性、精密性验证及初步应用。结果各物质色谱峰理论塔板数均大于8 500,各峰之间的分离度均大于4.5,阴性对照在相应位置处未见色谱峰;在标准曲线线性范围内,乙酸、葡萄糖、甘油、甲醇浓度与峰面积均呈良好的线性关系,相关系数在0.999 97⁰.999 98之间;该方法检测葡萄糖、甘油、甲醇、乙酸的平均加样回收率分别为102.18%、103.84%、105.16%、102.82%;该方法重复6次检测发酵液,其中葡萄糖、甘油、甲醇、乙酸峰面积的RSD分别为0.15%、0.21%、0.23%、0.23%。该方法对重组大肠埃希菌和毕赤酵母发酵过程中葡萄糖、甘油、甲醇、乙酸的含量进行检测,结果能够满足发酵操作的要求。结论建立的HPLC法系统适用性和专属性良好,加样回收率和精密性较高,不受培养基中蛋白胨、酵母粉和其他代谢产物的影响,可应用于基因工程菌发酵过程中3种碳源和乙酸含量的检测。     

菌株H008发酵条件的优化及其发酵液杀虫活性物质的研究

对菌株H008(Streptomyces laidensis)的发酵培养条件进行了优化,并对其发酵产物的生物学活性进行了初步研究.采用正交试验法,以菌株H008发酵液的杀虫活性为指标进行了培养条件的优化.通过正交试验确定的发酵生产工艺参数为pH值8.0、发酵温度28℃、溶解氧60%、发酵周期96 h.发酵液中该菌株的代谢产物具有杀虫活性高、热稳定性高、酸碱适应范围广、极性强等特性.     

赤霉素GA4+7在5000L发酵罐中的中试发酵工艺

[目的]探索赤霉素GA4+7在5000 L发酵罐中的中试发酵工艺条件.[方法]赤霉素GA4+7发酵培养基配方和发酵条件的优化筛选研究,分别在摇瓶条件下和在5000 L发酵罐中进行,采用多因素不同水平的正交试验设计.赤霉素GA4+7发酵单位的检测采用HPLC法.[结果]获得了赤霉素GA4+7发酵培养基优化配方:淀粉+葡萄糖为9.0％+1.0％、花生粉+黄豆粉为1.2％+0.6％、磷酸二氢钾和硫酸铵为0.2％和0.01％;获得了赤霉素GA4+7在5000 L发酵罐中优化的发酵条件:温度32℃、发酵通气量V(空气)∶V(发酵液)为0.4∶1、种子罐接种摇瓶种液400 mL、种子罐培养液中硫酸铵含量为0.05％、发酵罐补糖、种子罐种龄和发酵移种量分别为38 h和12％、发酵罐中添加碳酸钙量为0.2％.[结论]成功地探索到赤霉素GA4+7在5000 L发酵罐中发酵工艺条件,GA4+7在5000 L发酵罐中发酵效价达到788 mg/L,且GA4/GA7比例为1.06,GA4+7产品质量好,该工艺条件为大罐发酵生产赤霉素GA4+7奠定了较坚实的基础.     

多杀霉素废水的治理

[目的]研究多杀霉素生产废水的治理工艺和最佳操作条件。[方法]分析多杀霉素原药生产废水的水质,采用"化学预处理+生化处理+絮凝沉淀"工艺处理生产废水,在不同的操作条件下采集水样,监测废水中污染物浓度,计算COD去除率。[结果]对多杀霉素生产废水中的COD去除率达到99.3%以上,每吨高浓度废水处理成本大约为16.5元,是一种经济技术可行的处理工艺。污水处理各个单元最佳的操作条件为芬顿试剂氧化投加30%双氧水的量为7 g/L,[Fe2+]/[H2O2]摩尔比为1颐10,pH值为3,反应时间为2 h,分4次投加;UASB的最佳水力停留时间为48h,CASS的最佳水力停留时间为24h。[结论]应用于多杀霉素生产企业的废水治理中,取得较好的效果。     

雪白弯颈霉C41发酵液稳定性及粗提物的抑菌活性

[目的]研究雪白弯颈霉C41菌株固体发酵粗提物的抑菌活性及其发酵液在不同条件下的稳定性。[方法]采用菌丝生长速率法,以7种植物病原真菌为供试菌,测定雪白弯颈霉C41固体发酵粗提物的抑菌活性;以玉米弯孢菌叶病菌为指示菌,测定发酵液在不同条件下的稳定性。[结果]固体发酵粗提物对玉米灰斑病、玉米弯孢菌叶斑病和玉米大斑病病菌菌丝生长均具有较强的抑制作用,抑制率分别为90%、84.38%和80%。发酵液在25~60℃范围内有较好的热稳定性,温度高于60℃则稳定性降低;有较广泛的酸碱稳定性,在pH值为6时抑菌活性最好;发酵液对日光和紫外线的稳定性较强。[结论]雪白弯颈霉C41菌株的代谢产物具有广谱的抑菌活性和较好的稳定性。     

哌珀霉素(Peptaibols)对储藏期猕猴桃软腐病的防治效果

[目的]研究橘绿木霉(Trichoderma citrinoviride)菌株TR673在液体发酵过程中产生的一种次级代谢物——哌珀霉素(peptaibols)对引起猕猴桃贮藏期间软腐病的病原菌葡萄座腔菌(Botryosphaeria dothidea)的抑菌效果。[方法]采用菌丝生长速率法测定了不同质量浓度的哌珀霉素对葡萄座腔菌的室内毒力。[结果]哌珀霉素对橘绿木霉具有很好的抑菌效果。其EC_(50)和EC_(90)平均值分别为6.320、6.275 mg/L和51.79、50.734 mg/L。进一步配制含量为50 mg/L哌珀霉素的液体制剂,对采收后的猕猴桃果实进行浸泡处理,测定其对猕猴桃贮藏期软腐病的防治效果。在常温(25℃)下,经浸泡处理的猕猴桃果实在储藏期内,能有效防控由葡萄座腔菌引起的软腐病,防治率达到100%。同时,猕猴桃的保鲜贮藏期也延长了30 d。[结论]哌珀霉素能有效防治猕猴桃软腐病,并对猕猴桃果实具有保鲜效果。     

解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)FS6摇瓶发酵条件优化

[目的]对解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)FS6的摇瓶发酵工艺进行优化。[方法]通过对发酵培养基成分和发酵条件的单因素试验和正交试验,测定生防菌株FS6对人参立枯丝核菌的抑菌效果和菌体生长量,来确定其最适发酵培养基和发酵条件。[结果]最适摇瓶发酵培养基配方为葡萄糖30 g,酵母浸粉40 g,Mg SO_4·7H_2O_2 g,甘油10 m L,K_2HPO_42 g,H_2O 1000 m L;最优培养条件为接种量6%,摇瓶装液量50 m L/250m L,摇床转速160 r/min,初始p H值6.0,培养温度28℃,培养时间12 h。[结论]解淀粉芽孢杆菌FS6在最适摇瓶发酵培养基及发酵条件下,对人参立枯病菌的抑菌活性最好,为该菌株的工业化生产奠定了基础。     

四氯甲胺磷的合成及杀虫活性

[目的]设计并合成新型甲胺磷衍生物。[方法]在温和条件下,甲胺磷与三氯乙醛反应,再经氯化亚砜氯化得四氯甲胺磷。[结果]通过1H NMR和MS确定了化合物的结构,并进行了生物活性测试。四氯甲胺磷在1.3 mmol/L的浓度下对橘全爪螨、菜青虫的致死率分别为32%和42%。[结论]四氯甲胺磷对橘全爪螨、菜青虫具有较好的杀虫活性。     

橘绿木霉GF-11的哌珀霉素鉴定及活性研究

[目的]为将橘绿木霉GF-11应用于生防实践，研究了该菌的哌珀霉素及其生物活性。[方法]使用浸提法提取该菌的哌珀霉素，运用TLC及LC-MS/MS鉴定哌珀霉素，并采用稀释平板法和牛津杯法测定抑菌效果，应用染色法、电导率测定、核酸和蛋白质含量测定、DNA降解等指标初步分析了该粗提物对链格孢菌的抑菌机制。[结果]TLC和LC-MS/MS结果显示该粗提物有5种新的哌珀霉素；粗提物对链格孢菌、细极链格孢菌、高氏白粉菌的抑菌率分别为61.2%、58.2%、35.7%，对链格孢菌孢子萌发的抑制率为85%；对大肠杆菌等细菌抑制效果较弱。粗提物可改变链格孢菌丝形态、破坏细胞膜结构，致使胞内电解质及大分子物质外泄，降解基因组DNA。[结论]橘绿木霉GF-11粗提物中鉴定出5种新的哌珀霉素；该粗提物对真菌抑菌效果较好，对细菌抑菌效果较差，并可通过破坏病原菌细胞膜结构达到抑菌效果。     

嘧肽霉素发酵液抗真菌组分的高效液相色谱分析

[目的]采用反相高效液相色谱法分析嘧肽霉素发酵液,外标法测定其中抗真菌组分的含量。[方法]使用DIKMA DiamonsilⅡC18反相柱和紫外可变波长检测器,以甲醇-水(体积比为20∶80)为流动相,流速为1 mL/min,检测波长为278 nm。[结果]嘧肽霉素抗真菌组分保留时间为10.2 min,方法的线性相关系数为0.999 8,样品平均回收率为99.4%,变异系数为0.25%。[结论]该方法是用于发酵控制和用药指导的理想分析方法。     

一株可同时降解毒死蜱和联苯菊酯降解菌的筛选鉴定及其降解特性初探

[目的]筛选及鉴定一株可同时降解毒死蜱和联苯菊酯的降解菌,分析其降解特性。[方法]通过富集培养从污染淤泥中分离降解菌,经形态学特征和16S r DNA序列分析和同源性分析方法,鉴定菌株的分类。通过改变培养条件的单因素的试验,分析初始接种量、温度、p H值和农药初始质量浓度对联合降解的影响。通过GC-MS等分析其主要代谢产物。[结果]降解菌为寡养单胞菌(Stenotrophomonas sp.),降解菌可以单独或者混合降解毒死蜱和联苯菊酯,通过单因素试验研究,发现降解菌混合降解的最优条件:接种菌的最佳初始浓度OD_(600)值为0.5,p H值为7.0,温度为30℃,2种农药初始质量浓度为10 mg/L。毒死蜱的主要代谢产物为3,5,6-TCP,联苯菊酯的主要代谢产物为2-甲基-3-联苯甲醇。[结论]降解菌对环境中毒死蜱和联苯菊酯的生物降解具有较好的应用前景。     

温郁金中有效成分提取工艺研究

提取温郁金中的有效成分,有冷浸、超声与加热回流三种提取方法,提取溶剂有甲醇、乙醇、乙酸乙酯、石油醚等,采用单因素实验设计方法,对中药温郁金中活性成分进行提取,通过对高效液相色谱(HPLC)[1]分离条件的优化,比较不同提取方法、不同提取溶剂以及料液比,对提取率高低的影响,以确定分离分析温郁金中活性成分的最佳方法。实验结果表明:采用加热回流的方法,用乙醇为提取剂,料液比为1∶15时提取效率最佳。     

对氨基苯甲酰胺中对氨基苯甲酸含量的测定

运用薄层色谱、紫外光谱、红外光谱对对氨基苯甲酰胺中对氨基苯甲酸进行定性确认。通过条件试验确定HPLC最佳分离条件,用乙酸铵调节缓冲体系,用20%(V/V)的甲醇作为流动相,外标法定量。对氨基苯甲酸含量在0%~0.28%之间具有线性关系。验证试验表明方法简单、可行。可满足对氨基苯甲酰胺中对氨基苯甲酸含量的测定。