密码子优化的牛精蛋白基因在大肠杆菌中的表达

以PCR的方法得到牛精蛋白基因的基因，去其内含子，得到牛精蛋白cDNA，克隆入原核表达载体pGEX-2T中，组装成表达载体pGEX-2T-PE，利用大肠杆菌偏好的编码精氨酸的密码子CGT将野生型牛精蛋白基因中编码精氨酸的稀有密码子（AGA或AGG）替换掉，通过基因合成得到密码子优化的牛精蛋白的基因，将其克隆入原核表达载体pGEX-2T中，组装成表达载体pGEX-2T-PS。将这两个表达载体分别转化入大肠杆菌表达菌株BL21中，经IPTG诱导，同样条件下，野生型牛精蛋白基因无法得到表达，密码子优化的牛精蛋白基因能够得到良好的表达，表达产物约占细菌总蛋白的18％，将表达蛋白纯化，进行DNA－蛋白结合实验，发现其能与DNA发生非特异性的结合。     

猪瘟病毒E2蛋白4重复抗原表位的构建及抗原活性研究

利用PCR方法获得4次重复的猪瘟病毒E2蛋白中和性抗原表位基因，将其克隆到pGEM-5ZF( )载体，测序正确后亚克隆到pGEX-3X载体构建得到重组质粒pGEX-3X-4P。重组质粒在大肠杆菌中诱导表达了含4重复抗原表位的融合蛋白。该蛋白经纯化后，利用间接ELISA检测其与血清的反应性，结果表明，纯化的融合蛋白与兔抗CSFV E2血清有很强的反应性，与兔抗BVDV E2血清不反应，说明该重复抗原表位在鉴别诊断CSFV与猪的BVDV感染方面具有潜在的应用价值。     

抗夏菌蛋白Rs—AFP2基因定点突变及其对大肠杆菌中表达的影响

为了研究遗传密码子对表达调控的影响，利用PCR重叠延伸法，对萝卜抗真菌蛋白Rs-AFP2基因编码序列区的部分核苷酸进行沉默突变，构建突变体Rs-AFPm。序列分析表明，PCR产物全长240bp，有一个阅读框，编码的蛋白由29个氨基酸的信号肽和51个氨基酸的抗真菌蛋白组成。突变体与突变前的Rs-AFP2基因相比，在编码区第3号氨基酸Lys相差一个碱基(TTG→TTA)，第5号氨基酸G1n相差一个碱基(CAG→CAA)，第6号稀有密码子Arg相差两个碱基(CAG→CGA)。重新合成引物，将切除信号肤的Rs-AFP2基因和Rs-AFPm基因与原核表达载体pET-21b( )分别重组到大肠杆菌BL21菌株。IPTG诱导后，二者均得到了表达。软件分析显示，突变前pETAFPm表达产物占全菌蛋白的3％，突变后pETAFPo的表达产物占全菌蛋白含量的8％；表达蛋白主要以包涵体的形式存在，包涵体经超声波破碎后，蛋白质复性，抑菌结果表明，pETAFPm。表达产物的抑菌半径大于pETAFP2表达产物的抑菌半径。这些都说明改造后的Rs-AFPm基因与Rs-AFP2基因相比，已有效地提高表达量。     

cpcB与CT融合蛋白表达质粒在大肠杆菌中的表达和纯化

将人和鲑鱼嵌合型降钙素基因与藻蓝蛋白的β亚基基因相连,插入融合表达载体pGEX-4T-3中,转化大肠杆菌BL21。融合蛋白cpcB-CT基因在IPTG诱导下获得高效表达。超声破碎后,经SDS-PAGE分析,在48kD处有新增条,灰度扫描测定,过表达蛋白量占50％～60％,85％为包涵体。包涵体经变性、复性,过Glutathion-Sepharose-4B亲和吸附柱,获含有GST。的融合蛋白,该蛋白经凝血酶消化和截留分离,获得纯化的融合蛋白cpcBCT。Western blotting分析表明,产物具有与合成人降钙素相似的抗原决定簇部分;ELISA-受体法和大鼠降血钙试验表明,其具有降血钙作用。提示该融合蛋白可能具有良好的应用前景。     

人肥胖基因在大肠杆菌中的表达

肥胖基因编码的瘦蛋白可以反映机体脂肪含量信息,在发育、繁殖、造血及体重调节等方面具有重要功能。本文利用PCR方法扩增去除信号肽的人肥胖基因cDNA序列,并将位于基因5’端的CCC转变为大肠杆菌常用密码子CCG,扩增片段经测序证实后,克隆原核表达载体pT7-7,重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),经温度诱导,SDS-PAGE电泳可见分子量约为：16kD的特异蛋白表达带,表达量最高占菌体蛋白总含量的45％以上。表达重组蛋白经纯化,注射昆明白小白鼠,小白鼠体重明显下降,说明纯化的重组蛋白具有生物学活性。     

牙鲆抗菌肽hepcidin基因在大肠杆菌中的融合表达

根据从实验室克隆的牙鲆抗菌肽hepcidin基因(GenBank登陆号DQ129693)的序列,设计了特异性引物,PCR扩增其成熟肽片段.重组至融合表达载体pGEX-4T-1中,构建成牙鲆抗菌肽hepcidin基因融合表达载体pGEX-fhep,转化至大肠杆菌BL21(DE3)plyS中,筛选得到的阳性克隆用IPTG进行诱导.SDS-PAGE电泳显示在29kD处有特异性的蛋白条带出现,Western-blotting 检测表明已经成功表达了融合蛋白,表达的融合蛋白最高占总蛋白的21%.纯化得到的GST-fhep用凝血酶切割后,用亲合层析得到牙鲆的抗菌肽hepcidin.抑菌实验结果表明抗菌肽对大肠杆菌(ATCC25922)有一定程度的抑制作用.     

人硒蛋白SelK在大肠杆菌中的高效表达

目的:构建硒蛋白SelK的重组表达载体pGEX-6P-1-SelK-GFP.方法:利用PCR、酶切和连接酶连接等技术将硒蛋白selk连接到质粒pGEX-6P-1上,通过酶切、序列测定进行鉴定.通过IPTG诱导重组载体在BL21大肠杆菌中表达,并筛选最适诱导剂浓度和最适诱导时间.结果:成功在大肠杆菌中高效表达带有GST的SelK-GFP融合蛋白,占菌体总蛋白的15%,主要以包涵体形式表达.结论:成功构建了pGEX-6P-1-SelK-GFP重组表达质粒,为进一步研究硒蛋白SelK的功能、抗体制各打下了基础.     

牙鲆生长激素基因的克隆及其在大肠杆菌中的融合表达

采用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)方法,从牙鲆(Paralichthys olivaceus)脑垂体总RNA中扩增出编码牙鲆生长素(GH)成熟肽基因序列。重组至融合表达载体pGEX-4T-3中,构建成牙鲆GH基因融合表达载体pGEX-gh,转化大肠杆菌BL21(DF3),筛选阳性克隆,IVIG诱导表达。经SDS-PAGE电泳显示在45kD处有特异的蛋白条带出现,该蛋白的表达量随诱导时间的延长而增加,3h达最高值,达到细胞总蛋白的18．3％。该融合蛋白在胞内主要以包涵体状态存在,经优化表达条件,成功地获得了可溶性的融合蛋白,经Glutathione Sepharase 4B凝胶纯化后用Western-blotting检测表明其为牙鲆生长激素,并通过酶联免疫吸附受体法证实其具有生物学活性。     

抗真菌蛋白Rs-AFP2基因定点突变及其对大肠杆菌中表达的影响

为了研究遗传密码子对表达调控的影响,利用PCR重叠延伸法,对萝卜抗真菌蛋白Rs-AFP2基因编码序列区的部分核苷酸进行沉默突变,构建突变体Rs-AFPm.序列分析表明,PCR产物全长240bp,有一个阅读框,编码的蛋白由29个氨基酸的信号肽和51个氨基酸的抗真菌蛋白组成.突变体与突变前的Rs-AFP2基因相比,在编码区第3号氨基酸Lys相差一个碱基(TTG→TTA),第5号氨基酸Gln相差一个碱基(CAG→CAA),第6号稀有密码子Arg相差两个碱基(CAG→CGA).重新合成引物,将切除信号肽的Rs-AFP2基因和Rs-AFPm基因与原核表达载体pET-21b(+)分别重组到大肠杆菌BL21菌株.IPTG诱导后,二者均得到了表达.软件分析显示,突变前pETAFPo表达产物占全菌蛋白的3%,突变后pETAFPm的表达产物占全菌蛋白含量的8%;表达蛋白主要以包涵体的形式存在,包涵体经超声波破碎后,蛋白质复性,抑菌结果表明,pETAFPm表达产物的抑菌半径大于pETAFP2表达产物的抑菌半径.这些都说明改造后的Rs-AFPm基因与Rs-AFP2基因相比,已有效地提高表达量.     

真鲷肿瘤坏死因子(TNFα)基因的体外重组与纯化研究

将真鲷肿瘤坏死因子(TNFα)基因的成熟肽区域克隆到表达载体pQE30中,并转化到大肠杆菌XL-blue中进行表达。转化子经载体和基因特异性引物进行PCR双向筛选,并将筛选到的阳性克隆经质粒纯化后,进行序列测定。序列测定结果显示,该基因结构正确,且准确插入到表达载体启动子的下游,获得了结构和组成正确的重组子。重、组子经IPTG诱导后,以SDS-PAGE电泳鉴定,电泳结果表明,该基因在大肠杆菌XL-blue中实现了表达。通过对诱导条件的调整,在体外获得了高效表达的重组蛋白,高效表达的重组蛋白约占菌体蛋白的25％-30％。不同诱导时间对重组蛋白影响实验显示,随诱导时间的增加,重组蛋白产量逐渐增高,经4h诱导,其表达量可以达到平台期,过长时间的诱导,对表达产量没有影响。重组蛋白经镍金属亲和层析纯化,获得了纯度较高的重组蛋白。采用交换缓冲液的方法,用Sephadex G150,对重组蛋白进行脱盐复性,使重组蛋白得到了进一步纯化。     

人的Bcl－X_L和Bcl－X_ScDNA的克隆及表达研究

利用一对带有Ｔａｔ在序列的Ｂｃｌ－ｘ专一性引物从ＢＥＡＳ－２Ｂ细胞中扩增出比ｂｃｌ－ＸＬ和ｂｃｌ－ＸｓｃＤＮＡ，并将它们克隆入ｐＧＥＸ－５Ｘ－３载体进行表达。用ＩＰＴＧ诱导表达的融合蛋白占菌体蛋白总量的３０％，经谷胱甘肽－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ亲和层析，蛋白纯度达９０％。这些结果为进一步研究Ｂｃｌ－ｘ在编程性细胞死亡中的作用奠定了基础。     

抗牛精子sp18蛋白单链抗体基因的克隆及表达

应用重组噬菌体抗体技术,从小鼠抗牛精子sp18蛋白的A5杂交瘤细胞系中分离总RNA,构建重组噬菌体抗体库。以牛精子作为包被抗原,经过三轮“亲和吸附-洗脱-扩增”淘选后,用phage-ELISA筛选出特异性阳性克隆。取其中特异结合牛精子细胞的重组噬菌体抗体pCSA1克隆进行序列测定。将其ScFv(single chain fragment variable)因克隆到pET-30a( )上,用IPTG进行诱导表达,成功得到了抗sp18单链抗体基因蛋白。     

人重组血管生成素在大肠杆菌的表达与鉴定

利用ＰＣＲ技术从人肝细胞文库中扩增出血管生成素的ｃＤＮＡ，将其连入大肠杆菌表达载体后，在大肠杆菌成功地表达出人重组的Ａｎｓ融合蛋白和Ａｎｇ非融合蛋白，表达量占体蛋白的２５％，有明显的促进新生血管生成作用和ＲＮＡ酶及Ｌ９２９细胞粘附活性。     

利用自剪切融合蛋白在大肠杆菌中表达并纯化兔防御素

将源自兔嗜中性细胞的防御素基因NP-1插入原核表达载体pTYB2,并将重组质粒pTYB2-NP1转入大肠杆菌BL21中,用IPTG诱导使防御素以融合蛋白的形式表达。然后,通过亲和层析利用自剪切融合蛋白分离提纯目的蛋白。蛋白电泳检测到以二聚体形式存在的防御素,但此蛋白没有对大肠杆菌的抑菌活性。同时,对该表达纯化系统的特点和用原核生物大肠杆菌表达真核生物防御素的问题进行了分析和讨论。     

淋巴囊肿病病毒主要衣壳蛋白基因片段原核载体的构建及表达

淋巴囊肿病病毒感染牙鲆鳃细胞系FG-9307，提取细胞总RNA，采用RT-PCR法成功获得了淋巴囊肿病病毒主要衣壳蛋白0．6kb基因片段。构建其原核表达载体，IPTG诱导表达。结果表明，该融合蛋白分子量约48kD，可与抗LCDV多克隆血清特异反应。为LCDV基因工程疫苗的研制奠定了实验基础。     

以融合蛋白形式在E·Coli中表达人神经生长因子

将人神经生长因子基因（hNGF）克隆到pMalC2质粒中，构建了表达产物为麦芽糖结合蛋白（MBP）与hNGF的融合蛋白重组质粒。经由内切酶再水解及DNA序列测定等分析表明，重组质粒含hNGF基因（360bP），该质粒在E·Coli中的表达产物为融合蛋白MBP－hNGF（55kd），光密度扫描表明，其表达量约为30％。     

Simulation of 125I induced DNA strand breaks in a CAP-DNA complex

The E. coli catabolite gene activator protein (CAP)-DNA complex with 125I located at the position of the H5 atom of the cytosine near the centre was incorporated into the PARTRAC track structure code. DNA strand breaks due to irradiation were calculated by track structure and radical attack simulations; strand breaks due to neutralisation of the highly charged 125Te ion were derived from a semi-empirical distribution. According to the calculations, the neutralisation effect dominates the strand breakage frequency at 2 bases away from the 125I decay site on both strands. The first breakage distribution counted from a 32P labelled end on the strand with 125I agreed well with experimental data, but on the opposite strand, the calculated distribution is more concentrated around the decay site and its yield is about 20% larger than the measured data.