米曲霉外切β-D-氨基葡萄糖苷酶的化学修饰

采用化学修饰剂对采源于米曲霉(Aspergillus Oryzae)的外切β-D-氨基葡萄糖苷酶(GlcNase)进行修饰.氯胺-T(Ch-T)和碳二亚胺(EDAC)的修饰结果表明甲硫氨酸残基和羧基是GlcNase的必需基团.用化学修饰剂对GlcNase的羟基、精氨酸残基、酪氨酸残基、巯基和二硫键进行修饰,结果表明:修饰剂在较高的浓度范围内均没有引起酶活的显著降低,因此羟基、精氨酸残基、酪氨酸残基、巯基和二硫键都不是维持GlcNase酶活的必需基团.     

蕹菜叶过氧化物酶功能基团的化学修饰

为研究蕹菜叶面的的功能基团,将分离纯化得到的电泳纯的蕹菜过氧化物酶,分别用乙酰丙酮、顺丁烯二酸酐,二巯基苏糖醇、氯胺-T、溴代乙酸、对氯汞苯甲酸、苯甲基磺酰氟、N-乙酰咪唑选择性地对其进行化学修饰,并测定修饰前后酶活力变化。结果表明:精氨酸残基、赖氨酸残基、组氨酸残基和巯基可能是蕹菜过氧化物酶发挥活性的必需基团,而甲硫氨酸硫醚基、丝氨酸残基和酪氨酸酚羟基可能不是蕹菜过氧化物酶活性中心的必需基团。     

枝链霉菌L2001木聚糖酶的化学修饰及其活性中心

分别用多种化学修饰剂,如NBS、WRK对枝链霉菌L2001木聚糖酶进行化学修饰,结果表明,作用于色氨酸的试剂NBS能使酶活明显降低,而作用于谷氨酸、半胱氨酸、赖氨酸、精氨酸、丝氨酸及组氨酸残基的试剂对酶活力影响明显。为了进一步研究色氨酸对酶活力的影响作用,通过测定修饰酶的假一级常数,得到至少有一个色氨酸残基在枝链霉菌L2001木聚糖酶的活性中心,并通过底物对化学修饰的保护试验得到,色氨酸残基处在酶与底物的结合位点。结合荧光光谱再次确定色氨酸处于该酶的活性部位,是保持酶活性的必需基团。     

鸭心苹果酸脱氢酶功能基团的研究

分别用对氯汞苯甲酸、苯甲基磺酰氟、N-溴代琥珀酰亚胺、琥珀酸酐、乙酰丙酮、溴代乙酸、N-乙酰咪唑、二巯基苏糖醇、氯胺-T等化学修饰剂对鸭心苹果酸脱氢酶进行修饰。结果表明：半胱氨酸巯基、色氨酸侧链吲哚基和丝氨酸羟基是鸭心细胞质苹果酸脱氢酶和线粒体苹果酸脱氢酶发挥活性的必需基团;而甲硫氨酸的硫醚基、组氨酸的咪唑基、精氨酸胍基、二硫键、酪氨酸的酚羟基、赖氨酸的ε-氨基与鸭心苹果酸脱氢酶活性不直接相关,不是酶活性中心的必需基团。     

酵母蔗糖酶的纯化及其化学修饰

采用细胞破碎,热变性除杂蛋白,有机溶剂沉淀,DEAE-Sepharose Fast Flow柱层析等方法从酵母中纯化酵母蔗糖酶,用5种化学修饰剂PMSF、SUAN、NBS、DTT、EDTA及几种金属离子对其进行化学修饰.结果表明:酶分子中的丝氨酸残基和金属离子与酶活力无关,赖氨酸残基和半胱氨酸残基对酶活力有一定贡献,但不位于酶的活性中心;而色氨酸残基是酶活性中心的必需基团.     

Aspergillus ficuum菊粉酶的化学修饰

应用NBS、DEPC、EDC、DIC、Ch-T、PMSF 和DTT 化学修饰剂对Aspergillus ficuum 产内切菊粉酶和外切菊粉酶进行化学修饰,测定与其活性相关的氨基酸残基,结果表明,构成内切菊粉酶和外切菊粉酶活性中心的必需氨基酸残基均含有色氨酸和羧基氨基酸(谷氮酸或天门冬氨酸),组氨酸可能是酶活性中心的组成氨基酸。邹氏作图法进一步确认外切菊粉酶活性中心必需色氨酸残基数目为2,内切菊粉酶活性中心必需色氨酸残基数目为1 。     

根霉ZM-10脂肪酶的分离纯化和活性部位的化学修饰

根霉ZM-10脂肪酶经过硫酸铵盐析、DEAE-Sepharose FF阴离子交换层析、SephardexG100凝胶过滤层析得到电泳纯脂肪酶,分子量约为42 ku,纯化倍数15.3倍,酶活回收率22.2%。采用NBS、EDC、DEPC、CH-T、PMSF、DTNB等6种化学修饰剂对根霉ZM-10脂肪酶进行化学修饰和底物保护实验,研究了其分子中氨基酸侧链基团与酶活性中心的关系。实验结果表明,酸性氨基酸(天冬氨酸?谷氨酸)残基、组氨酸残基、丝氨酸残基、色氨酸残基为根霉ZM-10脂肪酶活性的必需基团。酶分子中酸性氨基酸(天冬氨酸?谷氨酸)残基、组氨酸残基和丝氨酸残基位于根霉ZM-10脂肪酶的活性中心部位,而色氨酸残基在保持脂肪酶活性中起到重要作用,但其不位于根霉ZM-10脂肪酶的活性中心部位。     

转谷氨酰胺酶活性基团研究

采用PMSF、NBS、IAc、BrAc、SUAN、NEM、DTT、Na2SO3、EDC、WRK 10种化学修饰剂在一定的条件下选择性修饰转谷氨酰胺酶,研究转谷氨酰胺酶分子中氨基酸侧链基团与酶活性中心的关系。结果表明:PMSF、NBS、IAc、BrAc、SUAN、NEM等化学修饰剂能显著抑制酶活力,而DTT、Na2SO3、EDC、WRK对酶活影响不大,说明丝氨酸残基、色氨酸残基、组氨酸残基、赖氨酸残基、半胱氨酸残基对酶活力影响很大,位于酶的活性中心,二硫键、谷氨酸(天冬氨酸)残基对酶活几乎没有影响,不位于酶的活性中心。     

米曲霉GX0011β-果糖基转移酶的性质研究

β-果糖基转移酶是酶法由蔗糖生产低聚果糖所必需的酶,本文对从米曲霉GX0011分离纯化得到的β-果糖基转移酶性质进行了研究。结果表明,该酶催化蔗糖转化成蔗果三糖的Km和Vmax分别为0.319mol/L和0.713mol/min/L,最适pH和最适温度分别为5.0～6.0和45℃。葡萄糖是该酶的竞争性抑制剂,其抑制常数Ki=0.608mol/L。经苯甲磺酸氟(PMSF)、N-溴代二酰亚胺(NBS)、1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)和间硝基苯磺酸钠(TNBS)对酶进行化学修饰及底物保护实验,推测该酶活性中心可能包括丝氨酸/苏氨酸、色氨酸、天冬氨酸(谷氨酸)残基,而赖氨酸残基可能与维系酶活性中心构象有关,但不是酶活性必需基团。实验还表明,超声波能在一定程度上提高酶活力,在300W功率下作用5min可提高酶活12%左右。低浓度乙醇对酶活影响并不十分显著,乙醇浓度达20%时,酶活仅损失19%。     

木聚糖酶热稳定性化学修饰研究

采用不同化学修饰剂对毕赤酵母工程菌所产的木聚糖酶进行化学修饰,结果发现用聚乙二醇(diamino-PEG)对酶进行的化学修饰,提高了酶的热稳定性。通过对化学修饰木聚糖酶条件的优化,最终确定了修饰反应体系中,木聚糖酶、diamino-PEG和偶联剂(EDAC/NHS试剂)的摩尔比为1∶1 000∶100。该修饰反应得到的修饰酶,在55℃保温10 min后,残余酶活力为61.6%,比原酶提高了29.1%,通过对酶学性质的分析,发现修饰酶只有pH稳定性、热稳定性发生了改变。     

生姜蛋白酶的大分子结合修饰

采用单甲氧基聚乙二醇(mPEG)和右旋糖苷对生姜蛋白酶进行大分子结合修饰。在酶液质量浓度为2.0mg/mL的硼酸缓冲液中,加入三聚氯氰活化的mPEG 或高碘酸钠活化的右旋糖苷,于40℃修饰反应1h,对修饰剂与酶蛋白的质量比和pH 值条件进行优化：mPEG 与酶的质量比为17.5:1.0、pH9.0,mPEG 修饰酶的修饰率为52.6%,相对酶活力(修饰酶活力/ 天然酶活力)为54.0%;右旋糖苷与酶的质量比为42:1、pH6.0,右旋糖苷修饰酶的修饰率为51.6%,其相对酶活力为原天然酶的3.3 倍。两种修饰酶的热稳定性均比天然酶显著增强,且右旋糖苷修饰酶的热稳定性明显高于mPEG 修饰酶。结果表明：右旋糖苷对生姜蛋白酶的修饰效果优于聚乙二醇,适用于酶蛋白的化学修饰与新型酶制剂的开发利用。     

环糊精糖基转移酶(CGTase)的化学修饰

不同蛋白质修饰剂对环糊精葡萄糖基转移酶进行修饰。在一定条件下,分别用丁二酮(DIC)、苯甲酰磺酰氟(PMSF)、二硫苏糖醇(DTT)和氯氨-T(Ch-T)处理后,酶活不受影响,说明精氨酸残基、羟基、二硫键和蛋氨酸残基与酶的活力无关。用焦碳酸二乙酯(DEPC)、N-溴代琥珀酰亚胺(NBS)和碳化二亚胺(EDC)修饰后,酶活力大幅度下降,说明组氨酸、色氨酸和羧基氨基酸为酶活力所必需。     

疏水改性乳清分离蛋白-普鲁兰多糖复合气凝胶的制备及性能研究

目的:对易吸湿的蛋白/多糖类气凝胶进行疏水改性并对其性能进行评估。方法:对乳清分离蛋（whey protein isolate,WPI）-普鲁兰多糖（pullulan,PUL）复合气凝胶进行低温等离子体处理,使其羟基充分暴露后,使用硅烷偶联剂进行表面接枝处理,获得具有疏水性能的复合气凝胶,并研究其吸湿性、疏水疏油性、抗压性能、热失重、精油装载与缓释性能等。结果:甲基三甲氧基硅烷（methyltrimethoxysilane,MTMS）改性后复合气凝胶的平衡吸湿率为（9.67%±0.323%）,十八烷基三甲氧基硅烷（octadecyltrimethoxysilane,OTMS）改性后复合气凝胶平衡吸湿率为（9.34%±0.276%）,相比为改性前（11.41%±0.506%）均明显降低;改性前,复合气凝胶水接触角为（40.14°±2.16°）,油接触角为（28.07°±2.43°）;MTMS改性后水接触角为（82.10°±4.78°）,油接触角为（56.14°±3.25°）;OTMS改性后水接触角为（85.21°±4.61°）,油接触角为（74.63°±3.08°）;改性后疏水疏油性均有所提升,且OTMS改性处理效果更好。改性前复合气凝胶压缩模量（21.745±1.982）MPa,MTMS改性后（17.655±3.034）MPa,OTMS改性后（18.412±3.513）MPa。改性后抗压强度略有降低,但不影响正常使用。改性前复合气凝胶丁香精油的最大装载率为（254.26%±5.585%）,MTMS疏水改性后丁香精油最大装载率（241.57%±5.214%）,OTMS组则为（223.31%±4.436%）。丁香精油装载率有所下降但缓释性能均有所提升,且MTMS改性缓释效果更好。热稳定性方面均有所提升,且OTMS组热稳定性更好。结论:综上所述,硅烷接枝疏水改性处理可以显著提升复合气凝胶的疏水性并提高其亲油性。适用于油脂类活性物质的装载与缓释应用,拓宽了WPI-PUL复合气凝胶的应用领域。     

The effect of the high pressure homogenisation on the activity and stability of a commercial neutral protease from Bacillus subtilis

The activity of a commercial neutral protease from Bacillus subtilis after high pressure homogenisation (HPH) was investigated. The enzyme was processed up to 2000 bar, and the residual activity was measured from 20 to 70 °C during refrigerated storage. Moreover, the effect of HPH at high temperatures was evaluated. No improvement in the activities at 55–70 °C were observed after HPH, while an increase of approximately 30% in the 20 °C‐activity was reached after 2000 bar processing. Thus, HPH shifted the optimum temperature from 55 to 20 °C. The high temperature homogenisation caused no changes in 55 °C‐activity, but reduced 20 °C‐activity three times. It suggests that HPH modifies the protease configuration, changing enzyme performance (maximum activity condition), as the efficacy of lock‐and‐key mechanism is strictly dependent on enzyme spatial structure. The changes can be permanent or not, depending on homogenisation pressure, inlet temperature and enzyme storage conditions. Therefore, the HPH is a promising method to change protease characteristics.     

海洋细菌Pseudoalteromonas flavipulchra HH407低温碱性蛋白酶的发酵条件和酶学性质研究

对一株分离自连云港海域的海洋细菌(Pseudoalteromonas flavipulchra HH407)菌株产蛋白酶的条件及酶学性质进行研究。结果表明,在发酵温度为20℃、培养基pH 值为8.0、NaCl 质量浓度为20g/L、接种量2.5% 和装液量20% 时产酶较高。甘露醇、果糖、乳糖、蔗糖、麦芽糖、鱼粉和酵母粉有利于蛋白酶的产生。该酶的最适作用温度为35℃,0℃时相对酶活力达21.7%。45℃条件下保温60min 后酶活力仍能保持80% 以上。酶的最适作用pH 值为10.0,pH 值为7.0～11.0 范围为时,酶活力相对比较高。酶在pH8.0～11.0 范围内稳定,最稳定的pH 值为10.0,属于低温碱性蛋白酶,Mn2+、Cu2+、Ca2+ 对其具有较强的激活作用,Hg2+ 较强地抑制其酶活力。苯甲基磺酰氟(PMSF)能完全抑制该蛋白酶,EDTA 无影响表明该酶属于丝氨酸蛋白酶。     

牛骨蛋白的酶法改性工艺优化及其结构和功能特性研究

目的 优化牛骨蛋白酶法改性工艺,挖掘牛骨蛋白作为乳化剂稳定乳液的潜力。方法 采用碱性蛋白酶对牛骨蛋白进行改性,以牛骨蛋白的乳化性为指标,探究酶添加量、酶改性温度、体系p H和酶改性时间对牛骨蛋白乳化性的影响,并通过响应面试验优化酶法改性工艺,比较改性后牛骨蛋白的功能和结构变化。结果 牛骨蛋白的酶法改性最佳工艺为酶添加量2000 U/g、改性温度为55℃、p H 7.2、改性时间1.9 h,此条件下牛骨蛋白的乳化活性、乳化稳定性、溶解度、持油性、持水性、起泡性和泡沫稳定性分别提高了53.85%、37.18%、51.43%、64.29%、50.16%、112.68%、167.22%;紫外吸收光谱、荧光光谱表明改性后牛骨蛋白的内部基团暴露程度增加,扫描电子显微镜结果显示,改性后牛骨蛋白结构从有序的片状向不规则的纤维状转变。结论 牛骨蛋白在经过酶法改性后其乳化能力得到了明显提高,为牛骨蛋白在食品乳液体系的应用提供一定参考和理论支持。     

酶法制备联合Plastein反应修饰牡蛎ACE抑制肽工艺优化

以牡蛎为原料,采用酶解联合Plastein反应修饰的方法,获得高活性血管紧张素转换酶(angiotensin converting enzyme,ACE)抑制肽。以ACE抑制率和水解度为指标,对比胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、碱性蛋白酶、中性蛋白酶、胰蛋白酶这5种蛋白酶对牡蛎肉的酶解效果,筛选出木瓜蛋白酶最佳。通过单因素试验和正交试验对酶解工艺进行优化,得到最佳酶解工艺为料液比1∶8(g/m L)、加酶量2.0%、温度65℃、时间1.0 h、pH6.0,此条件下酶解产物的ACE抑制率可达到63.30%,在此基础上采用Plastein反应对酶解产物进行修饰,以游离氨基酸减少量和ACE抑制率为指标,考察反应过程中酶种类、底物质量分数、加酶量、时间和温度对修饰结果产生的影响。通过该反应的修饰,得到选用中性蛋白酶、底物质量分数40%、加酶量1.0%、温度30℃、时间2.5h、pH7.0时,ACE抑制率最高可达82.31%,比修饰前提高了19%。     

A novel aspartic protease from the viscera of Sardinelle (Sardinella aurita): Purification and characterisation

A novel aspartic protease was extracted from the defatted viscera of sardinelle (Sardinella aurita) and purified, with a 9.5-fold increase in specific activity and 23.3% recovery. The molecular weight of the purified enzyme was estimated to be 17 kDa by sodium dodecyl sulphate–polyacrylamide gel electrophoresis (SDS–PAGE). The purified enzyme appeared as a single band on native-PAGE. The optimum pH and temperature for protease activity were around 3.0 and 40 °C, respectively. The enzyme showed pH stability between 2.0 and 5.0 and retained more than 50% of its activity after heating for 30 min at 50 °C. The enzyme lost 90% of its activity after incubation with pepstatin A at room temperature, but was not inhibited by soybean trypsin inhibitor or phenylmethylsulfonyl fluoride. Its K_m value was determined to be 0.73 × 10⁻⁴ M using haemoglobin as a substrate. The N-terminal 12 amino acid sequence of the purified acidic protease was R V I I E D X D Q F C T. This sequence showed low homology with aspartic peptidases of several other species of fish, suggesting that the enzyme is a new aspartic protease.     

多酶复合对玉米粉质构特性的影响

利用中性蛋白酶、谷氨酰胺转氨酶、普鲁兰酶和葡萄糖氧化酶复合作用对玉米粉进行修饰,改善其粘弹性和延展性。在研究多种蛋白酶和淀粉酶改性过程中,以改性条件和改性程度为基础,选择合适的酶进行复合改性,并利用StableTA．XTplus质构分析仪对玉米粉的粘弹性和延展性进行分析。结果表明,单种酶对玉米粉的改性程度有限,不能满足加工要求;多种酶复合改性能使玉米粉的粘弹性和延展性有较大改善,使普通玉米粉的粘度由46．59Pa．S提高到213．85Pa．s,延展性由10．21mm提高到28．26mm,恢复性由7．84％提高到31．04％,硬度由16．52g提高到276．13g。