碱性木聚糖酶在毕赤酵母的表达及酶学性质研究

将教酒链霉菌L1105第10家族碱性木聚糖酶基因去除纤维素结合域(CBD)后将功能结构域基因xynAe SC克隆到毕赤酵母表达载体。经筛选得到重组工程菌GS1153-20,用甲醇诱导后产酶活力达到最高683±9U/m L。结果表明,重组木聚糖酶的最适p H为7.2,且在p H 6.2~8.6有较高的相对酶活;其最适温度为70℃,40~60℃时相对酶活力都在70%以上;重组酶Xyn Ae SC以燕麦木聚糖为底物时,酶活力最高,相对酶活力为桦木的259.7%±10.7%;对甘蔗渣木聚糖的酶活力最低,只有对桦木木聚糖酶活的16.0%±1.5%。研究表明,碱性木聚糖酶基因成功地在毕赤酵母中表达,且去除CBD域后,其酶学性质并未改变。     

N-端二硫键及芳香族氨基酸对木聚糖酶XynZF-2热稳定性的影响

为提高GH11家族中温木聚糖酶Xyn ZF-2的热稳定性,将其N-端替换成GH11家族的耐热性木聚糖酶Ev Xyn11的相应序列,并在该段序列引入芳香族氨基酸残基(P9Y、H14F),构建杂合木聚糖酶基因xyn EV-34,将木聚糖酶基因xyn ZF-2和xyn EV-34分别在E.coli BL21中表达,并分析温度和p H对酶活性的影响。结果表明,杂合木聚糖酶Xyn EV-34的最适温度为48℃,相比原酶Xyn ZF-2提高了8℃。在40℃保温1 h,原酶Xyn ZF-2残余酶活性下降到44.36%,而突变酶Xyn34残余酶活性为77.96%。在45℃,突变酶Xyn EV-34的半衰期t1/245℃为23 min,较重组酶Xyn ZF-2(t1/245℃=7 min)提高了16 min。同时,两种酶的最适p H均为5.0,但p H稳定性由原来的4.4~9.0扩增到了3.0~9.0。由此表明,二硫键以及芳香族氨基酸的引入,对该酶的热稳定性以及p H稳定性都有明显改善。     

木聚糖酶基因XynB在毕赤酵母中的表达及酶学性质研究

目的:将来源于Thermotoga maritima的酸性耐高温木聚糖酶基因Xyn B通过密码子优化整合到毕赤酵母GS115基因组上,构建高效表达木聚糖酶Xyn B的毕赤酵母工程菌并研究其酶学性质。方法:通过分子克隆手段构建目的基因重组质粒以及二拷贝重组质粒,并将重组质粒导入毕赤酵母进行发酵表达,用DNS法测定发酵液酶活,并对酵母工程菌分泌的木聚糖酶进行一系列的酶学性质研究。结果:木聚糖酶的最适p H和温度分别为6.0和60℃;在p H4~6之间,稳定性较好,相对比酶活均在80%以上;在60℃和70℃保温2 h残留酶活分别为80%和70%左右;Co~(2+)对木聚糖酶活性有较明显的促进作用,Fe~(2+)、K~+和Zn~(2+)对酶的活性有微弱的促进作用,而Cu~(2+)、Ca~(2+)、Mg~(2+)、Mn~(2+)、Na~+对木聚糖酶活性有不同程度的抑制作用。TLC检验该木聚糖酶可以将木聚糖水解为二糖和少量单糖。通过10 L发酵罐发酵,最大酶活达到了8000 U/m L。结论:木聚糖酶在毕赤酵母中实现了高效表达,并获得了木聚糖酶的最适反应条件等一系列酶学性质,该酶性质优良适合用于饲料添加剂。     

耐热木聚糖酶基因xyn11EM在大肠杆菌中的表达

将人工合成经密码子优化的11家族耐热木聚糖酶基因xyn11~(EM)克隆至表达质粒p ET-28a(+)中,获得重组质粒p ET-28a-xyn11~(EM)。将其转化Escherichia coli BL21(DE3),构建表达耐热木聚糖酶的重组工程菌E.coli BL21/xyn11~(EM)。用IPTG诱导表达重组木聚糖酶Xyn11~(EM)(re Xyn11~(EM)),酶活性可达47.5 U/m L。SDS-PAGE分析显示,re Xyn11~(EM)的表观相对分子质量为24 800。re Xyn11~(EM)的最适反应温度为70℃,在70℃以下稳定。最适反应p H为6.5~7.0,在p H5.0~8.0范围内稳定。大多数金属离子和EDTA对该重组酶的活性影响不大。re Xyn11~(EM)的Km和Vmax值分别为7.2 mg/m L和54.7 U/mg。结果表明xyn11~(EM)成功在E.coli中实现了异源表达,其良好的热稳定性具有较好的工业应用潜力。     

乙酰木聚糖酯酶协同木聚糖酶降解木聚糖的研究

探讨了宇佐美曲霉(Aspergillus usamii)乙酰木聚糖酯酶和第10、11家族木聚糖酶之间的协同作用。利用作者所在实验室构建保藏的3株工程酵母Pichia pastoris GS115/Auaxe、GS115/Auxyn11A和GS115/Auxyn10A进行甲醇诱导发酵,分别获得重组乙酰木聚糖酯酶和木聚糖酶。在木聚糖酶最适p H、40℃、料液质量体积比1 g∶60 m L、水解2 h的条件下分别研究了不同加酶量作用于小麦麸皮时生成的还原糖量。结果表明,乙酰木聚糖酯酶与第11家族木聚糖酶有更好的协同作用,并在添加量比(酶活力比)为5∶1时所测协同效果最好,还原糖生成量较木聚糖酶单独作用增加了46%。因此,在乙酰木聚糖酯酶的作用下,木聚糖上乙酰基的去除,对提高木聚糖酶对木聚糖的水解效率具有重要作用。     

杂合木聚糖酶的设计及在毕赤酵母中的表达

人工设计合成木聚糖酶,为木聚糖酶分子改造研究提供新思路。采用合成生物学思路,以黑曲霉XZ-3S木聚糖酶Xyn ZF-2基因序列为基础,将N端48个氨基酸替换成Ev Xyn11 N端的34个氨基酸;引入芳香族氨基酸P9Y和H14F;在C端引入二硫键Cys38-Cys191;α-螺旋及cord区域分别引入疏水性氨基酸K164M、G166A、N160I、V111A以及G109A,设计杂合酶Xyn ZL。基因全合成后,构建毕赤酵母重组表达质粒p PIC9K-ZL,将其转化酵母菌GS115,对工程菌GS115-XynZL进行单因素发酵条件优化及重组酶酶学性质测定。最佳发酵培养基为土豆培养基,最佳诱导温度为28℃,最佳种龄为20 h,最佳诱导时间为168 h,最佳诱导起始pH值为6. 5,甲醇诱导最佳体积分数为15 mL/L。重组酶酶学性质显示:最佳反应温度为55℃,最适pH值为5. 0,杂合酶Xyn ZL在毕赤酵母中表达后具有特定性质和功能,其设计方法拓宽了木聚糖酶分子改造研究的思路。     

引入盐桥改善木聚糖酶AoXyn11A的温度特性

为改善米曲霉(Aspergillus oryzae CICC40186)木聚糖酶Ao Xyn11A的温度特性,基于其与同一糖苷水解酶家族耐热木聚糖酶Ev Xyn11TS一级和三维结构的比对和分析,在Ao Xyn11A N端空间区域引入3对盐桥。采用大引物PCR技术对野生型木聚糖酶基因(Aoxyn11A)实施定点突变,构建突变酶Ao Xyn11AS基因(Aoxyn11AS)。分别将Aoxyn11A和Aoxyn11AS在毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115中进行表达。酶学性质分析显示:Ao Xyn11AS的最适温度(Topt)为58℃,较Ao Xyn11A提高了8℃;突变酶在50℃的半衰期(t501/2)为60 min,较原酶延长了1倍多,其在55和60℃完全丧失酶活性的时间分别由原酶的15和4 min延长至35和15 min;而突变酶的p H特性和动力学常数较原酶改变不大。在Ao Xyn11A N端空间区域引入盐桥增加了其三维结构的刚性,从而明显改善了其温度特性。     

V1C定点突变木聚糖酶XynZF-2对酶热稳定性的影响

对来源于黑曲霉(Aspergillus niger)XZ-3S的中温木聚糖酶Xyn ZF-2进行热稳定性改造,定点突变v1c,构建重组突变酶Xyn ZF-2V1C。重组原酶Xyn ZF-2与突变酶Xyn ZF-2V1C基因分别在大肠杆菌BL21(DE3)中表达并进行酶学性质分析。结果发现,突变酶Xyn ZF-2V1C最适温度为50℃,相比原酶Xyn ZF-2最适温度提高了10℃;在45℃条件下的半衰期t45℃1/2,突变酶Xyn ZF-2V1C相对于原酶Xyn ZF-2提高了10 min;原酶Xyn ZF-2与突变酶Xyn ZF-2V1C最适p H均为5.0,p H稳定范围均为5.0~9.0,基本没有变化;原酶Xyn ZF-2和突变酶Xyn ZF-2V1C的Km分别9.96 mg/m L和12.4 mg/m L,Vmax分别为74.63 U/mg和90.91 U/mg。     

二硫键对提高木聚糖酶AoXyn11A热稳定性的作用

为提高米曲霉11家族中温木聚糖酶Ao Xyn11A的热稳定性,将Ao Xyn11A与源于Thermomyces lanuginosus的耐热木聚糖酶Xyn A进行三维结构比对分析,发现Xyn A的α-螺旋与β9-折叠之间存在一个二硫键;基于分子动力学模拟预测结果,利用定点突变技术在Ao Xyn11A的相应位置引入二硫键(Cys108-Cys152),获得突变酶Ao Xyn11AT;分别将Ao Xyn11A及其突变酶基因在大肠杆菌BL21(DE3)中表达,经纯化,获得重组Ao Xyn11A和Ao Xyn11AT,并分析比较温度对其酶活性的影响。结果显示,重组Ao Xyn11AT的最适温度为60℃,比重组Ao Xyn11A提高了5℃;其在50℃下的半衰期t1/250为71 min,较重组Ao Xyn11A(t1/250=25 min)提高了近2倍。研究表明二硫键对提高Ao Xyn11A的热稳定性有重要作用。     

链霉菌L10608来源木聚糖酶xyn-GH10/11基因的克隆与生物信息分析

基于菌株L10608所产天然酶水解木聚糖底物时具有良好的水解木聚糖底物特性,通过设计简并引物,经巢式PCR克隆得到L10608菌株木聚糖酶基因全长(xyn-GH10与xyn-GH11),并对其进行生物信息学分析。由分析可知酶xyn-GH10全长1 469 bp,分子质量:50.677 ku;理论等电点pI:7.98;预测该木聚糖酶的信号肽为MGIQALPRAAVRQKLRTPLPALAAGVLGLTAALVPPTNADA;该木聚糖酶蛋白序列具有明显的第10族糖苷水解酶的八叠桶型保守区域,且能编码一段由108个氨基酸组成的RicinB-lectin非催化结构域。木聚糖酶xynGH11全长729 bp;分子质量:24.003 ku;理论等电点p I:8.98;预测该木聚糖酶的信号肽为MHQDGSQQDRT QNPAPFGGLSRRGFLVGGTGAAALAAGSGLLLPGTAHAA。该木聚糖酶蛋白序列具有明显的第11族糖苷水解酶的"右手半握状"保守区域。xyn-GH10与xyn-GH11基因经原核表达后其中木聚糖酶xyn-GH10酶活为160 U/mL,木聚糖酶xyn-GH11酶活为55 U/mL。     

Clostridium clariflavum GH10木聚糖酶的克隆表达、酶学性质及位点功能分析

首次将来源于Clostridium clariflavum的木聚糖酶基因Clocl-2441中的糖苷水解酶家族10(glycosyl hydrolase families,GH)结构域基因连接到pET28a(+)载体上,在E.coli BL21(DE3)成功异源表达。经镍柱和脱盐分离纯化达到电泳纯,并对其酶学性质进行解析。结果表明,重组木聚糖酶rXyn2441GH10最适温度和pH分别为70℃和7.0,属于中性嗜热木聚糖酶。rXyn2441GH10在65℃以下和pH 4.0~9.0范围比较稳定,金属离子中5 mmol/L的Mg~(2+)可以提高79.2%的酶活。以榉木木聚糖为底物重组酶的动力学参数,V_(max)为1 691.5μmol/(mg·min),K_m值为2.5 mg/mL,k_(cat)为1 236.4/s,k_(cat)/K_m为494.6 mL/(mg·s)。定点饱和突变表明209位点的组氨酸对酶活有重要的作用。     

毕赤酵母木聚糖酶的活力测定条件研究

为探讨毕赤酵母木聚糖酶的催化特性以及更好地发挥其催化功能,从pH、温度、底物浓度、反应时间、DNS用量、DNS显色时间等几个方面研究了木聚糖酶活性测定的最佳条件。研究结果表明,木聚糖酶酶活测定的适宜条件为:1%的木聚糖用0.05mol/L pH6.0的柠檬酸缓冲液配制;测定温度70℃,且该酶的热稳定性较好.在55～60℃下放置2h能保持68%以上的酶活;酶促反应时间10min;DNS用量3mL;DNS显色时间5min。     

木聚糖酶Xyn43A基因在大肠杆菌及毕赤酵母中的表达比较

根据木聚糖酶Xyn43A基因序列,设计特异性引物,以p MD18-T-Xyn43A重组质粒为模板克隆Xyn43A成熟肽基因,将该基因分别克隆到大肠杆菌表达载体p ET-28a和毕赤酵母表达载体p PIC9K中,分别在大肠杆菌BL21及毕赤酵母GS115中表达。重组酶在大肠杆菌中胞内表达,比酶活力可达61.43 U/mg。重组酶在毕赤酵母中分泌表达,比酶活力可达145.24 U/mg。酶学性质显示,BL21-Xyn43A、GS115-Xyn43A重组酶最适温度、p H相同均为45℃、p H 5.0。GS115-Xyn43A温度稳定性、p H稳定性均优于BL21-Xyn43A。     

毛壳霉木聚糖酶B（CsXyn11B）的分泌表达及其在面包中的应用

目的:对毛壳霉（Chaetomium sp.）CQ31木聚糖酶B（CsXyn11B）进行分泌表达,以提高产酶水平并探究在面包烘焙中的应用价值。方法:将木聚糖酶基因在毕赤酵母中表达,高密度发酵提高其产酶水平,对酶学性质进行表征并将其应用在面包烘焙中。结果:重组菌经高密度发酵156 h,木聚糖酶酶活力为2788 U/mL。CsXyn11B最适pH为8.0,最适温度为65 ℃。CsXyn11B能够水解多种木聚糖底物,对燕麦木聚糖、小麦阿拉伯木聚糖、榉木木聚糖和桦木木聚糖的比酶活分别为1145.8、1041.7、692.3和653.3 U/mg。该酶水解阿拉伯木聚糖,水解产物以聚合度4~6的低聚木糖为主。在面包制作过程中加入3 mg/kg CsXyn11B使面包比容增加15.9%,面包硬度降低25.3%,4 ℃贮藏2 d后硬度比对照组降低17%。结论:毛壳霉木聚糖酶B的优良酶学特性使其在烘焙食品中具有良好的应用前景。     

产木聚糖酶毕赤酵母工程菌株构建及表达条件优化研究

将黑曲霉XZ-3S木聚糖酶Xyn43A成熟肽基因插入表达载体p PIC9K,重组质粒SalⅠ线性化后分别电击转化2种毕赤酵母GS115和KM71,转化液经MD平板、G418浓度梯度平板和摇瓶复筛,获得两株重组菌GS115/Xyn43A(Mut~+)和KM71/Xyn43A(Mut~s)。其中GS115/Xyn43A菌株最优表达条件为:甲醇浓度2.0%,接种时间24 h,诱导时间108 h,诱导温度30℃、诱导培养基初始p H6.3;KM71/Xyn43A菌株最优表达条件为:甲醇浓度1.75%,接种时间26 h,诱导时间132 h,诱导温度30℃、诱导培养基初始p H6.5。在最优表达条件下两重组菌GS115/Xyn43A和KM71/Xyn43A比酶活力分别可达139.36、143.29 U/mg。     

Clostridium clariflavum DSM 19732木聚糖酶Xyn2441的克隆表达及条件优化

Clostridium clariflavum DSM 19732是一种颇具应用价值的木质纤维素降解菌,尤其对半纤维素的降解能力非常高,国外学者已开始关注其中木质纤维素降解酶类的结构与功能,国内尚无相关报道。作者首次从复合菌系RXS基因组DNA中扩增出C.clariflavum DSM 19732的一个表达双功能木聚糖酶(糖苷水解酶家族(glycosyl hydrolase family,GH)10和11的木聚糖酶)的基因Clocl-2441,并将其与载体p ET28a(+)连接,在大肠杆菌E.coli BL21(DE3)成功表达。重组菌最佳诱导表达条件为:添加诱导剂时的菌体量OD600值约为1.25、诱导剂IPTG浓度为0.5 mmol/L、诱导时间7~8 h及诱导温度25℃,此时胞内重组酶比酶活达到34.92 U/mg。经镍柱初步分离纯化后比酶活达713.16 U/mg,纯化倍数20.83倍,回收率27%。重组酶的最适反应温度和p H分别为70℃和6.5。     

重组木聚糖酶XynA的酶学性质及其固定化

木聚糖酶在木聚糖的降解方面具有关键作用,其中酸性木聚糖酶在饲料加工、酿酒、果汁澄清等工业中具有极大应用潜力。该文通过分子克隆技术将酸性木聚糖酶XynA基因在大肠杆菌中进行异源表达,研究其酶学性质,并通过响应面优化试验得到最佳的固定化酶条件。成功将酸性木聚糖酶XynA基因重组于大肠杆菌BL21(DE3),发现该木聚糖酶具有较好的耐酸性,最适p H值为5.0,在pH值为4.5～5.5范围时保持酸稳定性,其相对酶活力能够达到62.37%以上;其最适温度为55℃,且35℃～45℃条件下较稳定;同时采用响应面分析法来优化木聚糖酶的固定化条件,当壳聚糖浓度为2.0%、交联时间为3 h、固定化时间为12 h条件时,其酶活回收率为39.45%。     

玉米皮纤维发酵裂褶菌的产酶分析及木聚糖酶基因克隆、表达和酶学性质测定

以玉米皮为唯一碳源培养裂褶菌,分别测定发酵液中半纤维素酶活性,结果显示木聚糖酶酶活为7.45U/mL、乙酰木聚糖酯酶酶活为3.41 U/mL、α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶和α-葡萄糖醛酸苷酶活相对较低,分别为0.44 U/mL和0.074 U/mL。根据酶活测定结果克隆了裂褶菌的木聚糖酶基因Xyn22,完成了该基因在大肠杆菌中的表达、重组蛋白纯化和性质研究。Xyn22的最适反应温度为40℃,当反应温度在45℃时其相对酶活在80%以上。Xyn22的最适pH为5.0,在4.5~6.5的范围内酶活均在80%左右。Xyn22在pH 3.0~10.5范围内较稳定,酶活保持在80%左右。Mg~(2+)、Ba~(2+)、EDTA和Hg~(2+)对酶活有很大的抑制作用,Hg~(2+)可以使Xyn22几乎完全失活。     

嗜热木聚糖酶的克隆表达及其在酶解生产低聚木糖中的应用

目的:为了获得一种耐高温的木聚糖酶,并对其生物特性进行表征,使其能够更有效地应用于低聚木糖的制备。方法:首先通过生物信息学分析,确定来自厌氧孢子菌Caldicellulosiruptor saccharolyticus DSM 8903的木聚糖酶(CsXynB)基因序列,然后扩增CsXynB基因,以pET-20b为载体,构建重组质粒,将其转入大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)中表达,重组酶通过热处理和镍柱亲和层析纯化获得纯酶,将纯酶用于后续酶学性质和降解木聚糖的研究。结果:通过生物信息学方法研究表明,CsXynB属于糖苷水解酶第10家族。CsXynB的最适反应温度为80℃,最适反应pH为6.5。在65℃以内,pH为5.5~7.5的条件下重组木聚糖酶的稳定性较高。以榉木木聚糖为底物时,CsXynB的K_m,V_max和K_cat值分别为1.8 mg/mL,46.0 U/mg和60.7 s-1。在65℃、pH6.5条件下,以榉木木聚糖为底物,木聚糖酶CsXynB反应1 h,生成的低聚木糖的主要成分为木二糖和木三糖。结论:CsXynB是一种极具特点的耐高温木聚糖酶,可以催化水解木聚糖生成高含量的木二糖和木三糖,在生产低聚木糖的应用中具有潜在价值。     

重组木聚糖酶酶解玉米芯制备低聚木糖

研究了蒸煮法及碱提法对玉米芯木聚糖的提取效果,并利用重组木聚糖酶Xyn A对玉米芯低聚木糖的酶解制备条件进行了优化。对木聚糖得率及酶解产物进行了分析,确定碱提法所得玉米芯木聚糖适宜作为酶解底物制备低聚木糖。优化后得到酶解制备玉米芯低聚木糖的工艺条件:底物浓度0.9%,酶解温度49℃,酶解时间4.5 h,还原糖量可达33.9%。另外,对酶解成分进行分析,结果表明酶解碱提玉米芯木聚糖可产生以木二糖及木三糖为主要成分的低聚木糖。