体外偶联UDP-糖基转移酶与蔗糖合成酶 高效催化合成莱鲍迪苷A

本研究构建了UDP-糖基转移酶UGT76G1基因的重组毕赤酵母菌株GS115/pPIC9K-UGT76G1和绿豆来源的蔗糖合成酶(mbSUS)基因的重组毕赤酵母菌株GS115/pPIC9K/pPICZA-mbSUS。通过甲醇诱导产酶,制备UDP-糖基转移酶UGT76G1和蔗糖合成酶,并构建生物催化级联反应体系,生物催化甜菊糖苷(Stevioside,ST)合成莱鲍迪苷A(rebaudioside A,RA),有效实现了级联反应体系中尿苷二磷酸葡萄糖(UDPG)的循环利用。本研究通过反应条件优化,发现级联反应中的限速酶是糖基转移酶UGT76G1,添加酶活比例为U_((UGT76G1)):U_((mbSUS))=6:1为合成莱鲍迪苷A的最佳酶活比例,在pH7.0,UDP浓度1mM,蔗糖浓度50mM,MgCl_2浓度3 mM的反应条件下,10 mM ST转化合成8.20±0.11 mM RA,RA的产率达到82.91%,与在大肠杆菌表达系统中相比,极大缩短了催化反应时间。利用体外偶联UDP-糖基转移酶与蔗糖合成酶催化合成RA为酶法高效生物合成RA及其产业化应用提供技术支持。     

重组酿酒酵母全细胞催化合成莱鲍迪苷A

用经密码子优化后合成的甜叶菊UDP糖基转移酶UGT76G1编码基因构建了表达该酶的重组酿酒酵母YPH499(pYES2-UGT)。建立了通过柠檬酸钠调节酿酒酵母细胞内由葡萄糖到尿苷二磷酸葡萄糖(UDPG)的代谢通量,用于催化甜菊苷合成莱鲍迪苷A的全细胞催化方法。优化后的催化体系为:甜菊苷1 g/L,葡萄糖20g/L,普郎尼克F68 10 g/L,MgCl2 6 g/L,柠檬酸钠15 g/L,pH 7.2,细胞密度200 g湿细胞/L反应液,在37℃下经72 h后转化生成莱鲍迪苷A 267.89 mg/L。     

体外多酶级联反应体系高效合成莱鲍迪苷M

为建立体外多酶级联反应体系高效合成莱鲍迪苷M（Rebaudioside M,RM）,该文分别构建了含有甜叶菊来源的糖基转移酶UGT76G1和水稻来源的糖基转移酶EUGT11以及拟南芥来源的蔗糖合成酶SUS1的重组大肠杆菌,将甜菊苷经一锅法催化合成RM。为提升该体系中限速酶EUGT11的酶活,从而提升整个体外多酶级联反应体系的RM产量,本文将该酶表达质粒的T7启动子核心区域串联,并比较一重、二重、三重和四重启动子启动转录时该酶活性,当三重启动子启动转录时,重组酶EUGT11的酶活力最高,是一重启动子启动转录时的2.13倍,在酶活力配比为SUS1:UGT76G1:EUGT11/3 copies of T7=1:2:6.39的体外多酶级联反应体系中,RM产量为3.79 mmol/L,较酶活力配比为SUS1:UGT76G1:EUGT11=1:2:3的体外多酶级联反应体系中,RM的产量提升了2.35倍。该文成功建立了高效合成RM的体外多酶级联反应体系,为此后工业化酶法合成RM提供理论和数据支持。     

甜叶菊糖基转移酶UGT76G1的克隆表达及其性质研究

目的:利用甜叶菊糖基转移酶UGT76G1特异性催化甜菊糖中含量高并且具有较强后苦味的甜菊甙生成高甜度的莱鲍迪甙A。方法:将合成的UGT76G1编码基因插入pYES2载体的EcoRⅠ和XhoⅠ酶切位点之间,成功构建了pYES2-UGT重组质粒。重组质粒导入表达宿主酿酒酵母YPH499中,利用2%半乳糖对重组菌进行诱导表达。结果:确定了最佳诱导时机为菌体培养后48h,诱导表达时间为12h。并对重组酶粗酶液性质进行了初步研究,确定其最适反应pH为8.0,最适反应温度为40℃,最佳反应时间为36h。结论:为建立经济高效的生物催化法对甜菊糖口味改质奠定了基础。     

酿酒酵母组成型表达甜叶菊糖基转移酶UGT76G1及相关性质研究

本研究将酿酒酵母穿梭质粒p ESC-Leu的诱导型启动子GAL1和GAL10分别替换为PGK1和TEF1启动子,构建了组成型双启动子表达载体p ESCD,再将甜叶菊糖基转移酶UGT76G1的编码基因亚克隆到p ESCD的Sal I和Xho I酶切位点之间,构建了组成型表达UGT76G1的重组质粒p ESCD-UGT。将p ESCD-UGT转化到酿酒酵母YPH499中进行表达,结果确定该重组酵母在SD-L液体培养基培养24h达到稳定期,菌体培养8h蛋白表达量高,选用1%的甲苯作为重组菌全细胞催化的通透剂时,催化15h产生288mg/L的莱鲍迪甙A,其产量是对照组的5倍。     

毕赤酵母全细胞催化合成新型高倍甜味剂莱鲍迪苷A

本研究构建经密码子优化后的UDP-糖基转移酶UGT76G1和蔗糖合成酶AtSUS基因的重组毕赤酵母菌株GS115/p PIC9KUGT/p PICZA-At SUS,实现双酶在毕赤酵母中的胞内共表达。利用共表达菌株作为全细胞催化剂在体外进行催化反应,可成功将ST转化为RA,并在此基础上对其最适反应温度、反应p H、底物UDP浓度与底物蔗糖浓度条件进行优化。重组菌株经甲醇诱导,对不同发酵时间菌体的催化能力进行探究,确定发酵120 h菌体催化能力最佳,RA产量为0.58 mg/mL。对共表达菌株催化体系中全细胞催化条件进行优化,优化后的催化体系为:反应pH 7.0,UDP浓度1 mM,蔗糖浓度70 mM,MgCl_2浓度3 mM,ST浓度10 mg/mL,将OD_(600)为30的细胞与上述体系混合后在最适温度45℃下,200 r/min反应15 h,重组菌可将10 mg/mL ST转化为7.46 mg/mL RA,为RA酶法生物合成及其产业化应用提供技术支持。     

构建高效糖配体再生重组菌生物催化合成莱鲍迪苷D

利用拟南芥（Arabidopsis thaliana）蔗糖合酶AtSUS3构建活化糖配体尿苷二磷酸葡萄糖（uridine diphosphate glucose,UDPG）再生体系,与高效催化莱鲍迪苷D（rebaudioside D,RD）合成的糖基转移酶协同偶联完成RD的高效生物催化。从拟南芥cDNA克隆获得AtSUS3基因,将其装配至pET28a获得表达质粒pLW105,随后pLW105与携带糖基转移酶EUGT11基因的质粒共转化大肠杆菌BL21（DE3）构建双酶共表达工程菌。在不添加UDPG或者尿核苷二磷酸（uridine diphosphate,UDP）的条件下,以上述双酶共表达工程菌全细胞催化莱鲍迪苷A（RA）获得的底物摩尔转化率大于80%,RD产量达到930?mg/L。随后构建双酶基因串连质粒pLW108及双酶共表达大肠杆菌BL21（DE3）工程菌。用串连质粒构建的工程菌催化效果与双质粒共转化相同。采用共表达双酶工程菌的发酵破碎粗酶进行催化,结果显示以粗酶催化可简化催化体系,并可将细胞催化体系所需高质量浓度蔗糖用量降至质量浓度5 g/100 mL,同时在不添加外源UDPG的条件下实现RD的高效生物催化,RA底物摩尔转化率达到93%,RD产量约为1?051?mg/L。     

β-呋喃果糖苷酶的生产及对甜菊苷和莱鲍迪A苷的酶法改性研究

用Arthrobacter sp.10137生产一种β-呋喃果糖苷酶(FFase),SDS-PAGE检测纯化后的酶分子质量为48.7ku左右,酶的比活力为19.81U/mg。纯酶的最适pH值和温度分别为6.5和40℃,并在pH6～8及40℃以下稳定。纯酶对甜菊苷和莱鲍迪A苷改性的最适条件是:酶量为15U/mL,莱鲍迪A苷和甜菊苷与蔗糖的摩尔比分别为0.0005:1和0.0012:1,反应时间为15h。在最适条件下,莱鲍迪A苷和甜菊苷的最大转化率分别为69.4%和72.0%。     

α-1,6-单葡糖基莱鲍迪苷A的合成

莱鲍迪苷D(RD)是甜味特性最好的甜菊糖苷,也是单葡萄糖基取代的莱鲍迪苷A(RA);但RD在甜叶菊提取物中含量很低且溶解度只有莱鲍迪苷A的十分之一。本实验使用来自L. citreum CICC23234.的交替糖蔗糖酶定向催化莱鲍迪苷A C19位上的α-1,6的葡萄糖基化,得到了一种莱鲍迪苷D的同分异构体,即单葡萄糖基莱鲍迪苷A(RAG1)。25℃下,RAG1在水中的溶解度分别是RA的13倍,是RD的148倍。感官分析实验表明,0.01%(w/v)的RAG1溶液的甜度是蔗糖的190～210倍,且甜味纯正,无后苦味。     

甜味剂莱鲍迪苷D的高效生物催化合成

采用来自水稻的UDP-糖基转移酶EUGT11并结合染色体改造构建了大肠杆菌工程菌,用于全细胞催化莱鲍迪苷A(Rebaudioside A,RA)生产莱鲍迪苷D(Rebaudioside D,RD)。为了增加宿主细胞内源性糖配体葡萄糖尿苷二磷酸(uridine diphosphate glucose,UDPG)的供给以满足糖基化反应需要,以大肠杆菌BL21(DE3)为出发菌对UDPG代谢通径进行改造,获得了一系列改造菌株SG1、SG2、SG3和SG4。其中以SG4为宿主过表达可高效催化RA合成RD的糖基转移酶EUGT11进行全细胞催化,RD产量高。随后以此工程菌为对象,对可能影响RD催化合成的条件进行了研究,结果表明50 m L培养菌液离心所收集新鲜菌体可在100 mmol/L pH 8.0磷酸钠缓冲液、80 mmol/L柠檬酸钠、体积分数0.1%Triton X100、500 g/L蔗糖、5 mmol/L Zn Cl2、42℃转化1 d的条件下催化1 mmol/L RA底物生成1112.21 mg/L RD,转化率可达98.5%。     

固定化β-葡萄糖苷酶转化甜菊糖的研究

用海藻酸钠作为包埋材料,对巨大芽孢杆菌所产β-葡萄糖苷酶进行了固定化,并对固定化酶转化甜菊糖的条件进行了研究。采用单因素分析方法探讨了温度、pH、时间、酶量、底物浓度和回收次数对转化的影响。结果表明,固定化酶在40℃、pH7.0、酶量20g/100mL时转化5d,可将1%甜菊糖(W/W)中的甜菊苷转化96.45%,固定化酶经4次重复利用后其转化活力仍能维持在原活性的57.77%,具有较好的稳定性和可回收性。该工艺操作简单、成本较低,在转化甜菊苷、提高莱鲍迪甙A纯度方面具有潜在的应用前景。     

甜菊糖苷单体制备研究进展

甜菊糖是继蔗糖和甜菜糖之外的世界第三糖源,是从甜叶菊中提取分离得到的低热量、高甜度的糖苷类化合物。甜菊糖大约含有80%以上的甜菊糖苷,甜菊糖苷组分复杂,包含多种单体,目前已知的有40多种,常见的有莱鲍迪苷A、莱鲍迪苷B、莱鲍迪苷C、莱鲍迪苷D、莱鲍迪苷E、莱鲍迪苷F、莱鲍迪苷M、杜克苷A、甜菊苷、甜茶苷、甜菊双糖苷等。甜菊糖苷单体用途多种多样,可单独作为食品添加剂,生理活性成分及单体转化的媒介等,是具有良好发展前景的物质,实现甜菊糖苷单体分离纯化及制备,是近几年的研究热点之一。因此对近几年国内外甜菊糖苷利用化学法和生物合成与转化法等相关的途径实现单体制备进行论述,为甜菊糖苷单体实现大规模生产应用提供理论依据和支撑。     

高产环糊精葡萄糖基转移酶的枯草芽孢杆菌选育、产酶与酶学特性

选育了一株高产环糊精葡萄糖基转移酶(CGTase)的芽孢杆菌Sx菌株,经16S rRNA测序分析,结合菌体及菌落的形态特征,鉴定该菌株为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis).对其产酶条件与酶学特性进行了研究.结果表明,以l g/dL玉米淀粉和2 g/dL豆粕粉为碳氮源,pH 6.5,30℃,220 r/min,60 h的条件下,菌株所产CGTase酶活性可达5 596 U/mL;该酶在30～50℃,pH 5.5～9.0下保持稳定,在50℃,180 r/rain,pH 6.5,CGTase酶活力为1 107 U/mL的条件下对20 mg/ml,甜菊甙转化48 h,甜菊甙溶液中的昂莱鲍迪甙与甜菊甙的比值(RA/SS)从转化前的0.45上升到0.53.     

中温α-淀粉酶改性甜菊糖的研究

利用中温α-淀粉酶BAN 480L的转糖基活性,对甜菊糖分子进行改性。实验结果表明,以马铃薯淀粉和甜菊糖为底物,转糖基反应主要发生在味质需要改善的组分甜菊苷上,而味质最好的组分莱鲍迪苷A几乎不发生转糖基反应。经优化得到反应的最佳条件:甜菊糖20 g/L,马铃薯淀粉160 g/L,温度70℃,pH 6.5,酶添加量2 KNU/g淀粉,反应6 h。甜菊苷的转化率为38.9%。反应液经大孔吸附树脂分离纯化,得到了脱除淀粉糖的产品。感官评定结果表明,产品后苦味明显改善,甜度和口感均优于原料。     

生物合成葡萄糖基-L-抗坏血酸产酶条件及转化条件优化

采用单因素实验确立微生物发酵法产环糊精糖基转移酶培养基基本条件和工艺条件,利用此酶催化L-抗坏血酸和糖基供体β-环糊精合成葡萄糖基-L-抗坏血酸(AA-2G),并通过正交实验考察不同加酶量、反应温度、pH等因素,确立环糊精糖基转移酶合成产物最佳条件为:在浓度0.04 mol/L L-抗坏血酸,酶量20 ml,pH值7.0,温度50℃下反应15 h。     

右旋糖酐蔗糖酶生产菌的产酶条件研究

右旋糖酐蔗糖酶是一种以蔗糖为底物,催化转移D-葡萄糖基生成α-葡聚糖或低聚糖的葡萄糖基转移酶.本实验对右旋糖酐蔗糖酶生产菌的产酶条件进行了研究.结果表明:诱导产酶碳源为5%蔗糖、培养时间24h、培养温度25℃、培养液初始pH值8.0为最佳产酶条件.     

β-呋喃果糖苷酶催化甜菊糖的改性研究

本文用β-呋喃果糖苷酶催化甜菊糖的分子改性,采用蔗糖和甜菊糖的混合反应体系,优化的催化反应条件为:pH 6.5,反应温度40℃,甜菊苷和甜菊双糖A苷与蔗糖的摩尔比为0.007和0.003,加酶量15 U/mL,反应时间15 h.在优化的反应条件下,甜菊苷和甜菊双糖A苷的转化率分别为63.6%和63%.     

苹果根皮苷糖基转移酶基因克隆及生物信息学分析

糖基化反应是植物次级代谢物合成的重要反应。苹果根皮苷生物合成需要糖基转移酶的催化。本研究基于PCR的c DNA基因克隆技术对3个苹果根皮苷糖基转移酶进行克隆测序及生物信息学分析,结果表明,UGT71A15,UGT71K1和UGT88F1基因c DNA长度分别为1 416,1 434 bp和1 452 bp;其二级结构中含有较多的α-螺旋,占40%~46%;N端和C端均有典型的Rossmann折叠,含有PLN02992结构域;均具有亲水性,不含跨膜结构域,无信号肽,存在于叶绿体或细胞质中。本结果为进一步研究苹果根皮苷糖基转移酶的酶学性质及分离纯化提供理论依据。     

新型甜味剂莱鲍迪苷D和莱鲍迪苷M的生物转化进展

来源于植物甜叶菊的天然甜味剂莱鲍迪苷D(rebaudioside D,Reb D)和莱鲍迪苷M(rebaudioside M,Reb M)具有高甜度、无热量和近似于蔗糖的口感，被认为是高热量糖的理想替代品，其在食品领域具有广阔的应用前景。文章综述了Reb D和Reb M的结构、口感、水溶性、安全性以及合成相关的糖基转移酶的研究进展，并重点介绍了Reb D和Reb M合成相关的糖基转移酶的蛋白质结构、催化机制以及蛋白质理性改造的研究进展，以期为Reb D和Reb M的开发和应用提供参考。     

微生物交替糖蔗糖酶的研究进展

交替糖蔗糖酶(alternansucrase,EC 2.4.1.140)是一种具有转苷活性的葡聚糖蔗糖酶,可以催化蔗糖的葡糖基聚合反应以及受体分子存在时的受体反应等。利用其受体反应可以生产具有益生特性的低聚糖、对淀粉进行改性、提高黄酮类物质的溶解度、降低甜菊苷的苦味等。因此,交替糖蔗糖酶在食品、饲料、化妆品以及医药等行业具有潜在的应用价值。本文主要对产交替糖蔗糖酶菌株的选育、交替糖蔗糖酶的理化性质、三维结构、受体反应以及应用等方面的研究现状进行了综述,以期对微生物交替蔗糖酶的研究及其相关制品的开发利用提供参考。