甜味剂莱鲍迪苷D的高效生物催化合成

采用来自水稻的UDP-糖基转移酶EUGT11并结合染色体改造构建了大肠杆菌工程菌,用于全细胞催化莱鲍迪苷A(Rebaudioside A,RA)生产莱鲍迪苷D(Rebaudioside D,RD)。为了增加宿主细胞内源性糖配体葡萄糖尿苷二磷酸(uridine diphosphate glucose,UDPG)的供给以满足糖基化反应需要,以大肠杆菌BL21(DE3)为出发菌对UDPG代谢通径进行改造,获得了一系列改造菌株SG1、SG2、SG3和SG4。其中以SG4为宿主过表达可高效催化RA合成RD的糖基转移酶EUGT11进行全细胞催化,RD产量高。随后以此工程菌为对象,对可能影响RD催化合成的条件进行了研究,结果表明50 m L培养菌液离心所收集新鲜菌体可在100 mmol/L pH 8.0磷酸钠缓冲液、80 mmol/L柠檬酸钠、体积分数0.1%Triton X100、500 g/L蔗糖、5 mmol/L Zn Cl2、42℃转化1 d的条件下催化1 mmol/L RA底物生成1112.21 mg/L RD,转化率可达98.5%。     

体外偶联UDP-糖基转移酶与蔗糖合成酶 高效催化合成莱鲍迪苷A

本研究构建了UDP-糖基转移酶UGT76G1基因的重组毕赤酵母菌株GS115/pPIC9K-UGT76G1和绿豆来源的蔗糖合成酶(mbSUS)基因的重组毕赤酵母菌株GS115/pPIC9K/pPICZA-mbSUS。通过甲醇诱导产酶,制备UDP-糖基转移酶UGT76G1和蔗糖合成酶,并构建生物催化级联反应体系,生物催化甜菊糖苷(Stevioside,ST)合成莱鲍迪苷A(rebaudioside A,RA),有效实现了级联反应体系中尿苷二磷酸葡萄糖(UDPG)的循环利用。本研究通过反应条件优化,发现级联反应中的限速酶是糖基转移酶UGT76G1,添加酶活比例为U_((UGT76G1)):U_((mbSUS))=6:1为合成莱鲍迪苷A的最佳酶活比例,在pH7.0,UDP浓度1mM,蔗糖浓度50mM,MgCl_2浓度3 mM的反应条件下,10 mM ST转化合成8.20±0.11 mM RA,RA的产率达到82.91%,与在大肠杆菌表达系统中相比,极大缩短了催化反应时间。利用体外偶联UDP-糖基转移酶与蔗糖合成酶催化合成RA为酶法高效生物合成RA及其产业化应用提供技术支持。     

拟南芥蔗糖合酶基因合成、重组表达及其在酶催化合成莱鲍迪甙A中的初步应用

本研究采用两步PCR的方法,合成拟南芥蔗糖合酶At SUS1的编码基因,并将其亚克隆到携带糖基转移酶UGT76G1基因的表达质粒p ET28a-UGT上,构建了双酶共表达质粒p EUGT-SUS。将质粒p EUGT-SUS转化到大肠杆菌Rossetta(DE3)中,在自诱导培养基中培养12 h,收集细胞超声破碎取其上清液为粗酶液用于催化甜菊甙合成莱鲍迪甙A的反应,结果确定重组酶At SUS1获得了活性表达,在双酶反应体系中,蔗糖和UDP在At SUS1作用下生成UDP-葡萄糖,供给UGT76G1所催化的糖基转移反应。考察了UDP初始浓度、反应pH、温度及反应时间对酶催化RA甙合成的影响。当UDP初始浓度为0.01 mmol/L,pH7.2和35℃反应条件下,反应12 h,10 g/L甜菊甙转化为莱鲍迪甙A的收率最高可达56.2%。为建立高效、经济的合成莱鲍迪甙A的酶催化工艺奠定了基础。     

重组酿酒酵母全细胞催化合成莱鲍迪苷A

用经密码子优化后合成的甜叶菊UDP糖基转移酶UGT76G1编码基因构建了表达该酶的重组酿酒酵母YPH499(pYES2-UGT)。建立了通过柠檬酸钠调节酿酒酵母细胞内由葡萄糖到尿苷二磷酸葡萄糖(UDPG)的代谢通量,用于催化甜菊苷合成莱鲍迪苷A的全细胞催化方法。优化后的催化体系为:甜菊苷1 g/L,葡萄糖20g/L,普郎尼克F68 10 g/L,MgCl2 6 g/L,柠檬酸钠15 g/L,pH 7.2,细胞密度200 g湿细胞/L反应液,在37℃下经72 h后转化生成莱鲍迪苷A 267.89 mg/L。     

pH值对普鲁兰多糖发酵的影响及其机理分析

探究不同pH值条件对出芽短梗霉CGMCCNO.7055合成普鲁兰多糖的影响。同时通过测定合成普鲁兰多糖的前体尿苷二磷酸葡萄糖(uridine diphosphate glucose,UDPG)含量及其相关酶磷酸葡萄糖变位酶(phosphoglucomutase,PGM)和UDPG焦磷酸化酶(Uridine diphosphate glucose pyrophosphorylase,UGPase)活性来分析普鲁兰多糖合成机理。结果发现一种双阶段调控pH值的方法,即第一阶段,发酵开始后24 h(OD6200.5)控制初始pH 6.0;第二阶段,发酵24 h后(OD6200.5)调控pH值到5.0并维持恒定,此阶段磷酸葡萄糖变位酶(PGM)和UDPG焦磷酸化酶(UGPase)活性最高。采用该方法使普鲁兰多糖产量达到(92.5±2.41)g/L,生物量达到(13.87±0.89)g/L,经相关性检验发现该发酵条件下普鲁兰多糖产量与尿苷二磷酸葡萄糖含量呈显著负相关关系。     

新型甜味剂莱鲍迪苷D和莱鲍迪苷M的生物转化进展

来源于植物甜叶菊的天然甜味剂莱鲍迪苷D(rebaudioside D,Reb D)和莱鲍迪苷M(rebaudioside M,Reb M)具有高甜度、无热量和近似于蔗糖的口感，被认为是高热量糖的理想替代品，其在食品领域具有广阔的应用前景。文章综述了Reb D和Reb M的结构、口感、水溶性、安全性以及合成相关的糖基转移酶的研究进展，并重点介绍了Reb D和Reb M合成相关的糖基转移酶的蛋白质结构、催化机制以及蛋白质理性改造的研究进展，以期为Reb D和Reb M的开发和应用提供参考。     

体外多酶级联反应体系高效合成莱鲍迪苷M

为建立体外多酶级联反应体系高效合成莱鲍迪苷M（Rebaudioside M,RM）,该文分别构建了含有甜叶菊来源的糖基转移酶UGT76G1和水稻来源的糖基转移酶EUGT11以及拟南芥来源的蔗糖合成酶SUS1的重组大肠杆菌,将甜菊苷经一锅法催化合成RM。为提升该体系中限速酶EUGT11的酶活,从而提升整个体外多酶级联反应体系的RM产量,本文将该酶表达质粒的T7启动子核心区域串联,并比较一重、二重、三重和四重启动子启动转录时该酶活性,当三重启动子启动转录时,重组酶EUGT11的酶活力最高,是一重启动子启动转录时的2.13倍,在酶活力配比为SUS1:UGT76G1:EUGT11/3 copies of T7=1:2:6.39的体外多酶级联反应体系中,RM产量为3.79 mmol/L,较酶活力配比为SUS1:UGT76G1:EUGT11=1:2:3的体外多酶级联反应体系中,RM的产量提升了2.35倍。该文成功建立了高效合成RM的体外多酶级联反应体系,为此后工业化酶法合成RM提供理论和数据支持。     

耐热木聚糖酶和葡萄糖醛酸苷酶的共表达及应用

目的：提高海栖热袍菌（Thermotoga maritima MSB8）来源的木聚糖酶XynB和α-葡萄糖醛酸苷酶AguA生产效率并降低生产成本。方法：利用基因重组技术将海栖热袍菌的XynB和AguA基因置于不同表达盒下构建共表达载体pET-20b-xynB-aguA和pET-28a-xynB-aguA,分别转化大肠杆菌Escherichia coli JM109（DE3）进行诱导表达,获得双酶混合物进而水解桦木木聚糖及玉米芯。结果：重组菌E. coli JM109（DE3）/pET-28a-xynB-aguA比E. coliJM109（DE3）/pET-20b-xynB-aguA产酶更具优势,在LB培养基中诱导培养8 h,XynB和AguA的产量分别达到7.6 U/mL和0.5 U/mL,在TB培养基中培养,XynB可达到10.27 U/mL,AguA为1.5 U/mL。在80 ℃水解条件下,双酶比单一木聚糖酶能够更彻底降解桦木木聚糖,所得酶解液中木二糖的含量和纯度更高;从还原糖释放量及电子显微镜观察可以看出双酶液对农副产品玉米芯具有良好的降解作用。结论：XynB和AguA基因（T. maritima）的克隆共表达具有可行性,并且在生物转化、食品工业和饲料生产等领域具有潜在应用前景。     

基因工程菌糖基转移酶的分离纯化与酶学性质研究

将含重组质粒pET28b-Val G在BL21(DE3)宿主菌中成功表达,以镍柱亲和层析、超滤脱盐及真空冷冻干燥结晶获得糖基转移酶并初步研究酶学性质。在10~40°C或pH 5~11下,该酶还能保持较好的稳定性,且最适反应温度及p H分别为30°C与8.0。1 mmol/L金属离子Ca2+、Mg2+、Mn2+、Co2+对酶反应有着显著的促进作用,而Cu2+、Zn2+对酶反应有强烈的抑制效果。当酶反应进程中酶活达到最大时,底物及产物的最适浓度分别为8μmol/L与2μmol/L。以底物井冈羟胺A足量为前提,双倒数作图法表明Km B为35.275μmol/L,Vm为0.153μmol/(L·min),酶对井冈羟胺A的亲和力较尿苷二磷酸葡糖(UDPG)好,因此在全细胞酶催化过程中对提高UDPG供应量的研究是有必要的。     

海洋杆菌糖基转移酶Agt突变体的制备及其在单葡萄糖甘油二酯催化合成中的应用

甘油糖脂由糖与甘油脂通过糖苷键连接而成，具有抗肿瘤、抗病毒和抗炎等多种生物活性，已成为当前研究的热点。目前获得甘油糖脂的方法包括植物提取法及化学合成法。植物提取法提取率及纯度较低；化学合成法对反应条件和分离设备要求高，产品不易分离，产生的废液污染环境。该研究采用基因工程方法构建海洋杆菌Candidatus pelagibacter sp.HTCC7211中的糖基转移酶Agt高活性突变体重组质粒，实现在大肠杆菌E.coli BL21-CodonPlus (DE3)-RIL中的表达，进一步研究其酶活性，优化催化合成单葡萄糖甘油二酯的最佳反应条件及其提取方法。结果表明：构建的突变体T257S可将二磷酸尿苷-葡萄糖(uridine diphosphate gluscose, UDP-Glu)和甘油二酯高效地转化为单葡萄糖甘油二酯，其催化效率是野生型合成酶Agt的1.56倍；采用环己烷/乙酸乙酯法提取单葡萄糖甘油二酯，最高提取率达84.7%;在最佳反应条件酶浓度8 U/mL、UDP-Glu质量浓度500 mg/L、温度35℃和pH 8.5条件下，转化率和纯度分别达68.5%和93.8%。因此利用...     

重组大肠杆菌合成光学纯L-苯基乳酸

以巨大芽孢杆菌Z2013513基因组DNA为模板,分别PCR扩增得到L-乳酸脱氢酶基因(ldh L)和葡萄糖脱氢酶基因(gdh),将gdh与ldh L分别连接至表达载体p ETDuet,获得共表达质粒p ETDuet-ldh L-gdh。经转化和验证获得重组菌大肠杆菌BL21(DE3)/p ETDuet-ldh L-gdh。十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳和比酶活力分析表明重组蛋白L-乳酸脱氢酶和葡萄糖脱氢酶均成功表达且具有酶活力。在37℃、200 r/min条件下,经60 min反应,催化底物苯丙酮酸合成24.26 mmol/L L-苯基乳酸。产物L-苯基乳酸光学纯度(99%),底物摩尔转化率(59.55%),结果表明此重组体系可用于高效合成高光学纯L-苯基乳酸。     

敲除ptsG基因及共表达透明颤菌血红蛋白提高大肠杆菌SHMT产量

利用Red同源重组技术敲除大肠杆菌BL21(DE3)的ptsG基因,得到ptsG基因缺失菌株BL21(DE3)ΔptsG。构建重组质粒,得到表达大肠杆菌丝氨酸羟甲基转移酶(serine hydroxymethyltransferase,SHMT)工程菌株BL21(DE3)/pET-glyA、BL21(DE3)ΔptsG/pET-glyA,及共表达SHMT和透明颤菌血红蛋白(Vitreoscilla hemoglobin,VHb)工程菌株BL21(DE3)ΔptsG/pET-SV。在LB培养基中,BL21(DE3)ΔptsG/pET-glyA菌株与BL21(DE3)/pET-glyA菌株生长情况没有明显差异,BL21(DE3)ΔptsG/pET-SV菌株稳定期的OD 600 nm值比BL21(DE3)ΔptsG/pET-glyA菌株提高了21.3%,在LBG培养基中,稳定期BL21(DE3)ΔptsG/pET-glyA菌株OD600 nm值比BL21(DE3)/pET-glyA菌株提高了19.4%,BL21(DE3)ΔptsG/pET-SV菌株OD600 nm值比BL21(DE3)ΔptsG/pET-glyA菌株提高了21.5%。在LBG培养基中,经过异丙基-β-D-硫代半乳糖苷诱导,与对照菌株BL21(DE3)/pET-28a相比较,两种单表达工程菌株产SHMT活力分别是其6.4倍和7.7倍,共表达工程菌株产SHMT活力是其9.6倍。实验结果表明,敲除ptsG基因能够增加大肠杆菌在含葡萄糖培养基中的生长量及SHMT表达量,共表达VHb能进一步提高菌株生长量和SHMT产量。     

Lactococcus lactis subsp.lactis IL1403谷氨酸脱羧酶的克隆表达、分离纯化及活性研究

谷氨酸脱羧酶(GAD)是功能因子γ-氨基丁酸(GABA)生物合成过程中的重要酶。为了得到一种有高效活性的GAD基因工程菌,克隆到一种GAD基因,来源于微生物Lactococcus lactis subsp.lactis IL1403。以pET-22b(+)为载体质粒,Escherichia coli BL21(DE3)为宿主细胞,构建了基因重组菌,IPTG可诱导目的重组GAD过量表达;经亲和层析纯化的重组蛋白质样品进行SDS-PAGE分析,在约54 000处出现显著的特征蛋白质条带;活性检测结果表明,该重组GAD的转化活性比野生菌株有明显提高,野生菌株经5h细胞转化,反应底物转化率为55.8%,而工程菌20min后转化率达到82.1%,30min后转化可达到98.3%。     

人工合成的单链甜蛋白monellin基因在大肠杆菌中的高效表达

根据已报道的单链monellin甜蛋白的氨基酸序列,采用细菌偏爱密码子,人工合成了全长294bp的monellin基因。插入到大肠杆菌表达载体pET22b中,构建重组分泌型表达载体pETMO。经IPTG诱导pETMO所含有的甜蛋白基因可在大肠杆菌BL21(DE3)中高效表达,表达量占菌体可溶性蛋白的44.8%。且经纯化后测定其甜度是蔗糖的3000倍。     

植物甜蛋白Mabinlin Ⅱ在大肠杆菌中的表达

本研究从马槟榔种子中扩增得到天然植物甜蛋白MabinlinⅡ的全长cDNA序列(M1),并通过特异引物PCR去除部分5'端序列得到修饰型的基因序列(M2).将M1与M2分别克隆至表达载体pET43.1a(+),并分别转化表达宿主菌Escherichia coli BL21(DE3)和Rosetta(DE3),成功构建出...     

植物甜蛋白monellin基因工程菌表达条件的研究

将带有monellin基因的重组分泌型表达载体pETMO转入大肠杆菌BL21(DE3),得到重组工程菌株BMC33。经IPTG诱导,其所含有的甜蛋白基因可高效表达。研究不同的表达条件对甜蛋白表达水平的影响,得到优化发酵条件:装液量为50 mL/250 mL三角瓶,当培养液OD值达0.8时,添加诱导剂IPTG至终浓为0.9mmol/L,32℃诱导5 h。此时,甜蛋白monellin表达量可高达细菌可溶性蛋白的44.8%。     

碳源对manA基因突变大肠杆菌代谢的影响

ManA基因编码的甘露糖-6-磷酸异构酶在大肠杆菌中催化D-甘露糖和D-果糖的异构化,促进大肠杆菌对碳源的代谢吸收。本文通过研究manA基因突变大肠杆菌对碳源的利用和编码糖代谢基因情况,探讨甘露糖-6-磷酸异构酶对大肠杆菌糖代谢的影响。采用Ⅱ型内含子逆转录突变方法构建manA基因突变大肠杆菌,分析manA基因突变大肠杆菌对不同碳源的利用情况和manA基因突变对大肠杆菌糖代谢相关基因表达的影响,结果显示,大肠杆菌BL21(DE3)ΔmanA以甘露糖、果糖为碳源时,菌株生长受到显著抑制;以淀粉为碳源时,BL21(DE3)ΔmanA菌株的生长显著优于野生型大肠杆菌;以葡萄糖为碳源时,manA基因突变对大肠杆菌的生长无显著影响。通过基因表达分析,发现大肠杆菌BL21(DE3)ΔmanA中甘露糖代谢相关基因的表达显著性降低;果糖代谢途径中6-磷酸果糖激酶Ⅰ亚基的编码基因(pfkA)显著下调表达;水解淀粉的α-淀粉酶编码基因(malS)显著性上调表达。ManA基因突变影响大肠杆菌甘露糖、果糖和淀粉代谢途径中相关基因的表达,从而影响大肠杆菌对碳源的利用。     

蔗糖异构酶基因在Escherichia coli BL21(DE3)中的表达及重组菌的细胞固定化

分别利用IPTG和乳糖两种诱导物诱导蔗糖异构酶(SIase)基因在E.coliBL21(DE3)中实现表达,对诱导温度、诱导时机、诱导物浓度、诱导持续时间进行比较分析并优化,确定了二者的最佳诱导条件,在E.coli培养3h后(OD600约为0.9)添加终浓度为0.8mmol/L的IPTG(0.5mmol/L乳糖)在20℃(24℃)条件下诱导14h(12h)能获得最高的蛋白表达量及SIase酶活。在最优条件下以IPTG为诱导物时目的蛋白占总蛋白的41.6%,单位体积培养液中SIase酶活为12.37U/mL,以乳糖为诱导物时分别为27.2%,14.72U/mL,从收获酶活角度考虑可见乳糖作为诱导物的优势;而后利用海藻酸钠包埋法固定化重组菌,转化初始浓度为500g/L的蔗糖溶液,转化10～11h后异麦芽酮糖平均得率在83%以上,蔗糖平均转化率大于99%,固定化细胞能够连续稳定转化25批次,转化效率相对于原始菌提高了近55%。     

牛凝乳酶原基因在大肠杆菌中的高效表达及活性检测

以实验室保存的携带凝乳酶原前体基因的重组载体pMD 19-T/bPPC为模板克隆凝乳酶原基因,经双酶切后与载体pET-30a连接得到重组载体pET-30a/bPC,转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导后,采用SDS-PAGE检测目的蛋白表达情况。重组蛋白经变性/复性、DEAE-Sepharose Fast Flow纯化和自催化后检测凝乳活性。结果表明,重组凝乳酶原基因在大肠杆菌中高效表达,表达量占菌体总蛋白的68%,采用Arima K方法检测,其凝乳活力达到80 SU/mL。因此,通过大肠杆菌表达系统大量制备具有生物活性的重组牛凝乳酶原的策略是可行的,研究结果为弥补国内天然牛凝乳酶的短缺提供一种途径。