利用多重PCR-RFLP同时检测羊肉及掺杂其中的肉类

以纯羊肉为原料,按2%、5%和10%的重量比在羊肉中掺杂鸡肉、猪肉和鼠肉,通过基因组DNA提取试剂盒法提取DNA,利用多重多聚酶链反应(Polymerase Chain Reaction,PCR)及限制性片段长度多态性(Restriction Fragment Length Polymorphism,RFLP)分析同时检测羊肉及掺杂其中的其他肉类。结果表明,通过多重PCR扩增,可以有效的检测出纯羊肉及其掺杂的鸡肉、猪肉和鼠肉,检出限为2%。     

多重位点特异性PCR快速检测牛肉中常见掺假动物源性成分

目的:基于动物线粒体cytb基因的多态性位点,建立一种特异性多重PCR体系检测牛肉、猪肉和鸡肉的方法。方法:提取肉类的基因组DNA,利用不同物种mtDNA cytb基因序列的SNP位点的差异,设计特异性引物。进行多重PCR扩增,利用扩增产物片段大小不同,检测牛肉中常见的掺假动物源性成分。通过灵敏性试验,确定最低检测量。结果:实验设计的引物特异性良好,在同一反应体系中,在同一退火温度52℃条件下,牛肉DNA扩增后产生149 bp的特异性条带,猪肉DNA扩增片段为261 bp,鸡肉DNA扩增片段为554 bp,未发生非特异性扩增。且检测的最低浓度达到100 pg/μL,具有高度的灵敏性和适用性。结论:根据动物线粒体cytb基因的差异性位点,开发的多重PCR体系,可一次性地同时检测牛肉、猪肉和鸡肉,可快速、灵敏、高通量地分析食品中掺假动物成分的来源。     

基于线粒体16SrRNA基因鉴别畜禽肉中5种动物源性成分

目的:建立一种快速、特异、灵敏的动物源性成分检测方法。方法:以线粒体16S r RNA基因序列为靶位点设计特异性引物,以常见畜禽包括羊、牛、猪、兔、鸡、鸭、鹅、鸽、鹌鹑等参考动物为研究对象,提取肌肉组织DNA,进行PCR扩增,设计筛选羊肉、牛肉、猪肉和兔肉特异性引物对,并进行引物特异性研究。结果:选择的特异性引物能够有效地对包括羊肉、牛肉、猪肉、兔肉以及鸡肉在内的5种动物源性成分进行快速检测,方便简洁。结论:该方法可以快速、准确地检测畜禽肉中羊肉、牛肉、猪肉、兔肉和鸡肉成分。     

用Cytb基因序列分析鉴定肉制品掺假

目的采用Cytb基因进行肉制品真伪鉴定的尝试性探索。方法随机采集21份肉制品样品,首先采用CTAB法方法提取样品DNA,基于Cytb基因的通用引物对21份样品DNA进行PCR扩增,把扩增产物进行测序,然后采用DNAMAN软件进行序列的比对分析。结果 CTAB方法适合肉制品的DNA提取。10份牛肉样品中9份与标注吻合,1份检测出是猪肉;2份羊肉样品中1份与标注吻合,1份检测是猪肉;2份猪肉样品中1份与标注吻合,1份检测是鸡肉;1份鸡肉样品与标注吻合;6份牦牛肉样品中2份与标注吻合,4份检测是水牛肉。结论用Cytb基因序列分析比对方法适合肉制品的真伪鉴定,市场上肉制品存在掺假问题。     

液相色谱串联质谱对掺假牛肉的鉴别及定量研究

本文以差异蛋白质组学为理论研究基础,利用高效液相色谱串联质谱(HPLC-MS/MS)实现了对猪肉或鸡肉掺假的牛肉的定性鉴别及定量分析。首先采用高分辨质谱仪(nLC-QE)分别找出牛肉、猪肉和鸡肉的相对专属性多肽链,并对其进行二级扫描,得到了三个物种的特异性离子对,进一步利用HPLC-MS/MS的多反应监测模式(MRM)对掺杂猪肉或鸡肉的牛肉进行特异性离子对验证,分别选择了牛肉、猪肉和鸡肉的9、8和7条多肽进行定性研究;并与聚合酶链式反应(PCR)技术进行比对,得到的结果一致;此外将鸡肉和猪肉以0.5、1.0、5.0、10.0、25.0%的比例掺杂于牛肉中,各选择3组离子对进行定量分析,其各自的线性相关系数均大于0.99,最低定量限为0.5%。由此表明,液相色谱串联质谱的方法可以快速地对牛肉中的猪肉和鸡肉进行鉴别并能准确定量分析。     

德尔卑沙门氏菌血清型分子检测靶点筛选及多重PCR检测方法的建立

利用比较基因组技术筛选到德尔卑沙门氏菌(Salmonella Derby, SD)的血清型特异性基因,以此为靶点设计引物与139-141引物共同构建多重PCR检测体系,对其特异性、菌落灵敏度、抗干扰能力及人工污染等方面进行评价。当扩增出171、284和512 bp电泳条带时,检测结果为阳性。通过该方法检测39株沙门氏菌和18株非沙门氏菌,表现出100%特异性,该检测体系的DNA灵敏度为383.2 pg/μL,菌落灵敏度为52 CFU/mL。当SD与自然(猪肉、鸡肉和牛肉)的背景菌群浓度比为1∶10~4时,该检测体系能获得清晰、准确的3条扩增条带。在人工污染的猪肉、鸡肉和牛肉样品的检测中,增菌10 h,检测灵敏度为3.8 CFU/25g。该检测方法准确灵敏的检测SD,可在食品安全领域得到广泛应用。     

2013年苏州地区肉及其制品掺假情况调查

了解苏州地区肉及其制品的掺假情况,通过对肉类种源与标签明示肉源进行比对,鉴别摻假食品,为加强食品标签管理提供依据。方法 运用自建的动物源性食品种源判定Taqman实时荧光PCR检测体系对苏州地区的肉及其制品进行种源判定,与标签明示肉源进行比对,鉴别摻假食品。结果 本次调查共检验涉及32个生产单位的90份样品,总不符合率为25.6%(23/90)。检测的44份牛肉及其制品中有12份与标签不符,8份用猪肉部分替代牛肉,1份以鸭肉部分代替牛肉进行销售;此外有3份不含有牛肉成分,存在猪、鸡、鸭源性肉类之外的肉类成分。共检测羊肉及其制品16份,有2份用鸭肉代替羊肉出售,3份羊肉样品中掺入了部分猪成分,其中1份样品还存在单个样品掺杂两种外源肉类的现象(猪源性和鸭源性)。检测猪肉及其制品19份,其中2份样品含有标签未注明的鸡肉成分。在所检测的11份混合肉类样品中有4份成分与标签不符,主要是以廉价的鸡肉取代/部分取代相对高价的牛肉和猪肉。结论 肉制品掺假情况明显,用猪肉、鸭肉部分代替牛肉和羊肉仍是主要的掺假手段,牛肉掺假样品主要是熟制牛肉制品,而火锅食用羊肉卷样品则是羊肉掺假高危品,开展肉制品摻假检测对规范肉制品市场具有积极意义。此外,3份未知种源成分的牛肉样品提示在现有检测基础上还需扩大检测范围,防患于未然。     

广东省牛羊肉及其制品中掺杂掺假情况的调查分析

目的对广东省内牛、羊肉及其制品中掺杂掺假情况进行风险监测,从而为监管部门的后续监督管理提供指导性意见。方法使用特异性引物和探针,对广东省市场上出售的牛、羊肉及其制品进行动物源性成分鉴定。并与标签明示肉源进行比对,确认掺假类别。结果共检验50份样品,其中牛肉25份,羊肉8份,混合肉类17份。检出10份掺假肉食品,总掺假率为20.0%。掺假样品均为牛肉制品,羊肉制品为未发现掺假情况。结论用猪肉和鸡肉进行肉类的掺假是目前主要的掺假手段。混合肉类制品在标签明示肉类成分方面比较混乱,部分样品检出标签未标示的肉类成分。进一步开展肉制品的掺假检测具有重要的社会意义。     

PCR鉴别猪鸡兔肉方法的建立与应用

建立一种快速准确鉴别生鲜猪肉、鸡肉和兔肉,以及混合或加工过的肉制品中这3种肉成分的方法。以猪肉、鸡肉和兔肉的线粒体细胞色素b基因为特征靶基因设计3组特异性引物对:F/R猪、F/R鸡和F/R兔,通过PCR得到特异性扩增片段,分析电泳图中是否出现目标条带,进而检测肉样是否掺假。结果表明,所设计的引物特异性良好,猪肉DNA扩增后产生331 bp的特异性条带,鸡肉DNA扩增后产生148 bp的特异性条带,兔肉DNA扩增后产生258 bp的特异性条带,而其他肉类未见该特异性条带。该方法准确、稳定,可为猪肉鉴别真假提供技术支持。     

非标记蛋白定量方法在掺假肉鉴别中的应用

目的建立一种非标记蛋白定量法鉴别牛肉或羊肉中是否掺假。方法采用四极杆串联飞行时间高分辨质谱分析各种肉类蛋白酶解之后的样品,找到每种肉类特异的肽段,再用串联四极杆质谱测定特异肽段的定量结果,判定样本中是否有这种肉类存在。结果在测定的牛肉、羊肉、猪肉、鸡肉和鸭肉样本中,均找到每种肉类的特异肽段5～7条,从每种肉中选择3条肽段进行定量分析,可以很好地鉴别出牛羊肉中掺杂的其他肉类。结论该方法操作简便,结果可靠,灵敏度高,可用于在牛肉或羊肉中掺杂其他肉类的鉴别。     

PCR方法快速鉴别食品中肉的种类

本文针对食品中肉成分种类鉴别开发了一种快速灵敏的PCR检测方法,可检测食品中是否存在猪肉、牛肉、羊肉以及鸡肉等成分。采用微波助提法提取样品中DNA,简化了前处理步骤,可在短时间内完成从多种不同类型肉与肉制品中提取肉成分DNA。为了评价方法的可靠性与灵敏度,猪肉以及掺入了不同比例浓度猪肉成分的食品样品采用本方法进行了核酸提取与PCR分析。检测结果表明,方法可检测出低至含有0.5%浓度的猪肉成分的混合样品。随机抽取50份不同类型的市面食品样品,检测出5份食品含有猪肉成分,7份食品中含有牛肉成分,5份食品中含有羊肉成分。该样品前处理方法、DNA提取方法以及PCR检测方法可广泛应用于食品中肉成分种类的检测鉴别。     

PCR在肉类品种鉴别中的应用

<正>近年来,市场上不断出现假羊肉、假牛肉。无良商家利用价格便宜的鸡肉、鸭肉、猪肉甚至老鼠肉等,用香精、香料等原料调制出类似于羊肉、牛肉的气味来贩卖,严重损害了消费者的利益,甚至危害消费者的身体健康。视觉、味觉不能够准确地鉴别出肉类的品种,而分子生物学手段针对不同的物种具有不同的基因序列,利用PCR可以鉴定扩增产物引物的特异性基因。此方法灵敏度高、可靠性强,是肉类物种鉴定的有力手段。实验部分     

中国研究多重聚合酶链反应检测鸡肉、鸭肉和鹅肉中DNA方法的建立

<正>对肉制品的来源进行准确的鉴定,对于肉制品加工的经济效益,以及尊重消费者的宗教信仰和产品的卫生控制具有重要的意义。国内学者为此研究建立了一项灵敏准确的多重聚合酶链反应的检测方法,用于区分在牛肉、羊肉、猪肉和鹌鹑肉中存在的鸡肉、鸭肉、鹅肉的DNA。PCR引物的设计是根据每种禽类线粒体中的基因序列设计的,鸡肉、鸭肉和鹅肉的扩增子片段的大小分别是131、283、387 bp。此方法检测到的基因与牛肉、羊肉、猪肉和鹌鹑肉的DNA并没有发生交联,最低检测到的DNA含量小至0.05 ng,只需要抽取样品的1%便可检测。通过此方法鉴定     

利用荧光定量PCR技术鉴别畜禽肉中猪源性成分

以猪特异性基因序列为靶位点设计特异性引物,以常见畜禽肉包括猪肉、羊肉、兔肉、牛肉、鸽肉、鹌鹑肉、鸡肉、鸭肉、鹅肉等参考动物肌肉DNA为模板,进行荧光定量PCR扩增,建立猪源性成分荧光定量PCR检测方法;并将猪肉DNA模板浓度进行8个梯度稀释,检测其灵敏度。结果显示,该方法能够有效对猪源性成分进行快速检测,具有较强的特异性,灵敏度较高,可快速准确地鉴别畜禽肉中猪源性成分。     

HDA法用于检测肉中金黄色葡萄球菌的研究

本文研究了猪肉、牛肉、羊肉、鸡肉中金黄色葡萄球菌的依赖解旋酶恒温基因扩增检测方法mDA法）,以金黄色葡萄球菌耐热核酸酶ruc粥基因为目的基因,设计一对特异性引物,优化反应条件uvrDhelicase、T4gp32的浓度,通过赖解旋酶恒温基因扩增方法直接检测猪肉、牛肉、羊肉、鸡肉中金黄色葡萄球菌,扩增产物通过电泳进行检测。结果表明,HDA法检测肉中金黄色葡萄球菌的特异性强,试验涉及的其它菌株未发生扩增,只有金黄色葡萄球菌得到与设计序列长度一致的216bp基因片段,检出限为10^5CFU／g,优化确定UvrDhelicase、T4gp32的终浓度分别为0．1gg、5．0gg,该方法用于检测猪肉、牛肉、羊肉、鸡肉中金黄色葡萄球菌的灵敏度高,耗时短,为猪肉、牛肉、羊肉、鸡肉中金黄色葡萄球菌的快速检测提供了新的方法,也为其它食品中金黄色葡萄球菌的快速检测奠定了基础。     

HDA法用于检测肉中金黄色葡萄球菌的研究

本文研究了猪肉、牛肉、羊肉、鸡肉中金黄色葡萄球菌的依赖解旋酶恒温基因扩增检测方法(HDA法),以金黄色葡萄球菌耐热核酸酶nuc基因为目的基因,设计一对特异性引物,优化反应条件UvrD helicase、T4 gp32的浓度,通过赖解旋酶恒温基因扩增方法直接检测猪肉、牛肉、羊肉、鸡肉中金黄色葡萄球菌,扩增产物通过电泳进行检测。结果表明,HDA法检测肉中金黄色葡萄球菌的特异性强,试验涉及的其它菌株未发生扩增,只有金黄色葡萄球菌得到与设计序列长度一致的216 bp基因片段,检出限为101 CFU/g,优化确定UvrD helicase、T4 gp32的终浓度分别为0.1 μg、5.0 μg,该方法用于检测猪肉、牛肉、羊肉、鸡肉中金黄色葡萄球菌的灵敏度高,耗时短,为猪肉、牛肉、羊肉、鸡肉中金黄色葡萄球菌的快速检测提供了新的方法,也为其它食品中金黄色葡萄球菌的快速检测奠定了基础。     

基于DNA条形码技术常见肉类掺假鉴别技术的研究

根据市场上常见的肉类掺假情况,本研究通过提取生鲜牛肉、羊肉、猪肉和鸭肉基因组DNA,按一定比例进行预混合,构建牛肉掺猪肉、羊肉掺猪肉、牛肉掺鸭肉和羊肉掺鸭肉4种掺假模型。通过引物COI-1和COI-2进行PCR扩增和测序比对,建立基于COI基因的动物源性食品的掺假判别方法。根据实验所得纯肉DNA提取率T实现DNA水平到肉水平掺假比例的换算。在肉的掺假水平上,引物COI-2检测效果较好,对牛-猪、羊-猪、牛-鸭和羊-鸭模型掺假物的检出限分别为5%、8%、1%和4%。对采集的28个批次的肉制品进行检测,结果表明:28个样品中89%的样品与产品标签标识的成分相符。建立的基于DNA条形码技术的检测方法可作为一种简单、快速、有效的分子鉴定技术,可以直接应用于研究物源性食品的种类和掺假鉴定。     

基于线粒体编码基因差异对食品中牛肉与猪肉成分的鉴别

市场上有不法厂商使用深加工后的猪肉冒充或添加于牛肉进行销售,但针对熟制食品中猪肉和牛肉成分的辨别方法仍不够成熟。为建立灵敏、可靠的食品中猪肉和牛肉成分的鉴定方法,分别根据线粒体基因组和细胞基因组编码基因的差异设计多组物种特异性引物,应用PCR技术对加工食品中的猪肉和牛肉成分进行鉴别。结果表明,两组基于线粒体编码基因差异所设计的引物各具优势,均可有效地进行食品中猪肉和牛肉成分的鉴定,检测灵敏度达纳克级DNA,且鉴定效果显著优于使用基于细胞基因组编码基因差异的引物。对市售食品样本的鉴别验证了方法的实用价值。总之,建立并优化了可用于深加工熟制食品中猪肉和牛肉成分鉴别的PCR方法,为肉制品质量控制提供了新的途径。     

武汉市部分菜场肉类食品中产志贺毒素大肠杆菌污染状况分析

对武汉市部分菜场肉类食品中产志贺毒素大肠杆菌(STEC)污染状况进行分析。方法 2011年7月至2012年10月期间,从武汉市汉口30个菜场和超市共采集样品196份,其中猪肉102份,牛肉60份,禽类34份。通过选择性增菌,提取DNA,PCR扩增stx1、stx2、rfbO157、wzyO157基因,分析食品中产志贺毒素大肠杆菌的污染状况。结果 猪肉、牛肉、禽类食品中非O157型STEC的阳性检出率分别为18.6%、48.4%和2.9%;O157型STEC的阳性检出率分别为13.6%(猪肉)、6.7%(牛肉)和2.9%(禽类)。菜场样品STEC检出率(35.8%)略高于超市样品(32.4%)。结论 武汉市肉类食品中STEC检出率较高,应定期跟踪监测,了解菌株流行和毒力变化状况。     

植物乳杆菌ST-Ⅲ活菌计数方法

根据植物乳杆菌ST-Ⅲ的基因序列设计多对菌株特异性引物,和细菌16S rRNA通用引物一起组合,筛选设计菌株特异性计数多重PCR。待测样品先用MRS琼脂平板进行培养计数,随机挑选一定数量的单菌落,提取DNA,做PCR鉴定。将传统平板计数技术与多重PCR技术有机地结合起来,初步建立了产品中植物乳杆菌ST-Ⅲ菌株特异性活菌计数方法。