重庆烟区青枯雷尔氏菌生化变种及序列变种的特性研究

为进一步明确重庆烟区烟草青枯菌的遗传及生化特性,采用生化变种分类标准及演化型复合PCR、系统发育进化分析对重庆10个烟草青枯病发生区县青枯雷尔氏菌的种下分化情况进行了研究。结果表明:46株烟草青枯雷尔氏菌均属于生化变种3和亚洲分支菌株(演化型Ⅰ)。内切葡聚糖酶基因(egl)和DNA修复蛋白基因(mutS)部分序列的系统发育学分析表明:46株供试菌株可聚类到青枯雷尔氏菌演化型Ⅰ的3个序列变种,分别为序列变种15、17和44,其中序列变种17和44为优势菌株。表明重庆烟草青枯雷尔氏菌具有一定的遗传分化和地理区域特性。     

抗青枯内生细菌的筛选及其对烟草青枯病的防治效果

烟草青枯病是由青枯雷尔氏菌引起的一种土传细菌性烟草病害,主要危害烟草的根茎,严重影响烟草的产量。从青枯病发病田健康烟株分离内生细菌55个,通过平板拮抗实验筛选,R-3、R-7、R-9菌株对青枯雷尔氏菌有明显的拮抗作用。gyr B基因序列分析表明,R-3、R-7、R-9均为贝莱斯芽胞杆菌(Bacillus velezensis)。3个菌株的发酵液经115℃高温处理均能保持对青枯雷尔氏菌的抑制活性,说明3株贝莱斯芽胞杆菌可产生耐高温的抑菌物质。田间试验结果表明,R-3、R-7和R-9均可长期定殖于烟草根和茎中,对青枯病的防治效果分别为55.72%、48.34%和50.71%。     

湖北地区烟草青枯菌系统发育分析

本研究采用青枯菌演化型分类框架,对来源于湖北烟区的48个烟草青枯菌进行系统发育学分析并进行序列变种鉴定,以明确该地区烟草青枯菌的菌系分化。基于青枯菌内切葡聚糖酶基因(egl)和DNA蛋白修复基因(mutS)的系统发育学分析结果表明,48个供试菌株属于青枯菌亚洲分支(演化型Ⅰ)的3个序列变种,分别为序列变种15、17和44,未发现我国已报道的烟草青枯菌序列变种34。其中序列变种17和44为优势菌系,且均来源于恩施地区;序列变种15只包含来源于十堰地区的3个菌株。本研究表明湖北地区烟草上的青枯菌存在一定程度的遗传分化。     

不同条件对烟草青枯雷尔氏菌生长的影响

青枯雷尔氏菌（Ralstonia solanacearum）是烟草青枯病的病原菌。为有效防治青枯病,研究了不同培养条件对青枯雷尔氏菌生长的影响;并测定了在不同pH、温度以及在培养基中添加不同浓度的N、P、K、Zn²⁺、Cu²⁺、Ca²⁺、Mg²⁺、HCO₃^-、SO₄^2-对青枯雷尔氏菌生长的影响。结果表明,青枯雷尔氏菌在偏酸和偏碱条件下生长较好,青枯雷尔氏菌最适生长温度为25~45 ℃;高浓度的Zn²⁺和Cu²⁺能够有效抑制青枯雷尔氏菌的生长,其他因素对青枯雷尔氏菌的生长无明显作用。     

我国主要烟草青枯病病圃青枯菌系统发育分析

为探究我国主要植烟区烟草青枯病鉴定病圃中青枯菌的系统发育,采用演化型分类框架下的序列变种分类方法,对从各烟株和土壤样品中分离得到的100株青枯菌进行系统发育分析。结果表明,所有菌株可归为4个分支,分别为序列变种15、17、34、54。其中,云南文山州广南县病圃中的菌株为序列变种17和54,福建泰宁县的菌株为序列变种34,福建三明市三元区的菌株为序列变种15和34,广东白云区的菌株为序列变种15和17,广东南雄市的菌株为序列变种15、17和34,安徽宣城市宣州区的菌株为序列变种34和54,贵州福泉的菌株为序列变种17,重庆彭水的菌株为序列变种17。本研究发现同一病圃中存在多个序列变种,某些病圃同一地块中烟株与土壤分离所得菌株序列变种不一致。     

福建烟草青枯菌演化型及生化变种鉴定研究

本研究尝试采用国际上新兴的青枯菌演化型分类框架并结合传统的生化变种鉴定方法,旨在探究福建省烟草青枯病菌系的构成,从而揭示青枯病的流行规律,为指导烟草青枯病的抗病育种提供理论依据。2008~2009年,分别于福建省南平、三明以及龙岩地区田间烟草病株上分离获得了45个烟草青枯病菌株。经青枯菌演化型复合PCR检测,45个菌株均能够扩增得到片段大小分别为144 bp和280 bp的两条特异性扩增条带,从而表明全部分离菌株均系青枯菌演化型I型即亚洲分支菌株。继而基于45个分离菌株对3种双糖和3种己醇氧化利用能力的检测结果,鉴定出其中43个菌株属于青枯菌生化变种III,1个菌株属于生化变种IV,1个菌株属于非标准型生化变种（能利用山梨醇和甜醇,不能利用3种双糖和甘露醇）。该研究结果部分揭示了造成国外引进的烟草品种青枯病抗性水平下降或丧失的可能原因。      

青枯雷尔氏菌拮抗放线菌的筛选及其抗菌活性物质的分离

烟草青枯病是由青枯雷尔氏菌引起的土传性病害。从健康土壤中分离到对青枯雷尔氏菌具有明显拮抗作用的放线菌LC-7,经初步鉴定为链霉菌属(Streptomyces sp.)。链霉菌LC-7的发酵液用氯仿、正丁醇萃取后,通过捷克八溶剂系统分析,判定该抗菌物质为碱性水溶性抗生素。抗菌物质进一步采用离子交换树脂纯化,并经醇沉后,获得抗生素的结晶,再用HPLC进一步纯化后并进行质谱分析可得出,LC-7所产抗菌活性物质为一种新的氨基糖苷类抗生素,其分子量为365.1。田间试验表明,链霉菌LC-7对烟草青枯病具有显著的防治效果,防效为85.48%。     

生物有机肥对烟草青枯病的防效及对土壤细菌群落的影响

烟草青枯病是一种危害严重的土传性病害,为了防治烟草青枯病,筛选了3株拮抗青枯雷尔氏菌的芽孢杆菌（甲基营养型芽孢杆菌JK3、枯草芽孢杆菌JK4和解淀粉芽孢杆菌JK10）,将其发酵液添加到有机肥中,经二次发酵后获得生物有机肥（SF2、SF4）,施入烟田。结果表明,生物有机肥能较好地防治烟草青枯病,同时促进烟株的生长,SF2、SF4处理的防效分别为82.18%、68.82%。同时,采用高通量测序技术分析了土壤细菌的群落结构,发现生物有机肥显著影响了土壤细菌的群落结构,促进了土壤中有益菌（如鞘氨醇单胞菌属、类芽孢杆菌属、耐热芽孢杆菌、梭菌属等）的增殖。芽孢杆菌和链霉菌的数量也明显增加,推测链霉菌和芽孢杆菌可抑制青枯雷尔氏菌的繁殖,进而控制烟草青枯病的发生。施用添加拮抗芽孢杆菌的生物有机肥是防治烟草青枯病的一项有效措施。     

基于锁核苷酸(LNA)增敏的植烟土壤青枯雷尔氏菌定量PCR检测

为了定量检测植烟土壤中青枯雷尔氏菌的数量,有效防控烟草青枯病,构建了一种锁核苷酸(LNA)荧光定量PCR检测方法。以青枯雷尔氏菌细胞色素c基因(Cyt c)(NCBI Genebank序列号:WP_011002214.1)为靶标,采用LNA技术合成覆盖目标片段的引物序列,结合荧光定量PCR技术,进行了植烟土壤中烟草青枯雷尔氏菌数量的快速检测。结果表明,所构建的Cyt c基因标准曲线的R~20.99,相关性较好。与普通DNA引物相比,采用Cyt c基因LNA引物进行的PCR适用退火温度更高,扩增效率也更高。通过对水稻土发病烟田18个土壤样品的检测,表明青枯雷尔氏菌数量在2.52×10~4~1.88×10~7个/g土壤之间。因此,构建的一种基于Cyt c基因的LNA增敏定量PCR检测体系,适用于水稻土等植烟土壤中青枯雷尔氏菌的定量检测,对烟田土壤的提前检测有助于烟草青枯病发生的预警。     

烟草青枯菌遗传多样性分析

【目的】阐明中国主要产烟省区烟草青枯菌的种内遗传多样性,揭示烟草青枯菌种内遗传多样性与烟草品种、地理来源等的关系,为指导烟草青枯病抗病育种及综合防治等提供理论依据。【方法】采用多位点序列分型（Multilocus Sequence Typing, MLST）研究方法对采自我国11个主要产烟省区的93株烟草青枯菌进行种内遗传多样性分析。【结果】93株供试菌株被分为51个序列型（Sequence Type, ST）,运用eBURST V3软件共享5/7基因标准可将所有供试菌株划分为4个亚群(group)与4个单一群（singleton）。【结论】实验结果表明,我国烟草青枯菌地理分布广泛,存在丰富的种内遗传多样性,但烟草青枯菌的组群划分与菌株的地理区域和烟草品种没有明显的相关性。      

湖北恩施地区烟草青枯菌的生理分化研究

本研究对湖北恩施烟区青枯病菌（Ralstonia solanacearum）的生理小种、生化型和演化型进行了鉴定,为湖北省烟草青枯病抗性品种的选育和利用提供了理论依据。从湖北恩施地区的8个县（市）采集青枯病感病烟株,通过平板稀释分离和特性性引物检测从中分离鉴定到54个具有致病性的烟草青枯菌菌株。采用注茎接种法将供试菌株分别接种青枯菌6个鉴别寄主,确定所有的菌株均属于生理小种1;基于青枯菌对3种双糖和3种己醇利用能力的检测结果,将54个菌株鉴定为生化型Ⅲ;经青枯菌演化型PCR检测,54个菌株均能扩增得到片段大小分别为280 bp和144 bp的两条特异性条带,这说明全部分离菌株均属于青枯菌演化型Ⅰ型。     

豫南烟区烟草青枯病危害调查及病原鉴定

2014年从豫南烟区信阳市罗山县、驻马店市确山县和遂平县共采集25个疑似青枯病烟草病样和10份病土,分离纯化出菌株26个,测序所得的序列与NCBI数据库中的Ralstonia solanacearum基因组序列进行Blast比对,相似度达到98%以上,对分离鉴定得到的烟草青枯病菌进行回接试验,表现出典型的青枯病症状,发病组织在TTC培养基上也同样分离得到典型的青枯菌菌落,证实病原为烟草青枯病病原。由此表明,豫南烟区确有烟草青枯病的发生。     

一株贝莱斯芽孢杆菌的分离鉴定及其益生潜力评价

贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)为芽孢杆菌属新型细菌。采用梯度稀释法及抑菌圈法进行菌株的分离和筛选，综合形态观察和16S rDNA序列比对对分离的菌株进行鉴定。通过高盐、胆盐、pH、模拟胃肠液、温度和抗生素等耐受性测定，结合体外抗氧化能力、抑菌活性以及溶血和动物饲喂试验，对分离菌株进行益生潜力评价。结果显示，从农家酱中分离出一株菌PJP10,初步鉴定为贝莱斯芽孢杆菌。该菌对金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、肠炎沙门氏菌(Salmonella enteritidis)、副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)、青枯雷尔氏菌(Ralstonia solanacearum)和黑曲霉(Aspergillus niger)等拮抗效果显著，可以耐受8%NaCl、0.5%胆盐、100℃水浴、pH 2和模拟胃肠道的环境，对于头孢类、阿奇霉素等14种常用抗生素敏感。同时菌株PJP10无菌发酵液具有较好的抗氧化活性，对ABTS阳离子和DPPH自由基的清除率分别为(95.66±3.1)%和(44.84±2.2)%,Fe³⁺     

巨大芽孢杆菌L2粗提物的抑菌效果及其抑菌成分分析

对巨大芽孢杆菌（Bacillus megaterium）L2粗提物进行初步分离,以青枯雷尔氏菌（Ralstonia solanacearum）为指示菌进行活 性追踪,并利用气质联用（GC-MS）法分析其活性成分。结果表明：粗提物洗脱组分LE4-5在质量浓度为1.4 mg/mL时对青枯雷尔氏菌（Ralstonia solanacearum）RS-2、根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）T-37及胡萝卜软腐欧文氏菌（Erwinia carotovora）EC-1的抑制 率分别为91.04%、59.58%及23.83%;对菌株RS-2和T-37的IC50值分别为（0.512±0.056) mg/mL和（1.215±0.078）mg/mL。GC-MS分析结果 发现,粗提物洗脱组分LE4-5的主要成分为亚油酸（23.607%）、亚油酸甲酯（14.444%）、油酸（4.337%）等不饱和脂肪酸。     

唐菖蒲伯克霍尔德菌椰毒致病变种食物中毒分离株的遗传特性研究

目的 对1株引起聚集性米酵菌酸中毒的生吊面浆食品样品分离株唐菖蒲伯克霍尔德菌椰毒致病变种(Burkholderia gladioli pv. cocovenenans)DBJ进行全基因组测序并分析,解析菌株产毒及致病的基因特征。方法 提取唐菖蒲伯克霍尔德菌椰毒致病变种DBJ基因组DNA,对菌株进行测序获得全基因组完成图,利用生物信息学分析手段对序列进行挖掘分析。结果 菌株DBJ基因组由两个染色体(G1和G2)和一个质粒(P)组成,其中两个染色体大小均为4 Mb左右,质粒大小约为300 kb。两个染色体的GC含量也相仿,约为68.0%,质粒则稍低为63.0%。进一步分析发现,G2染色体上存在产米酵菌酸的bon基因簇。遗传进化分析后发现,菌株DBJ在亲缘关系上与加拿大玉米分离株UCD-UG_CHAPALOTE最为接近,两株菌处在同一进化分支。且255株菌种中有31株携带bon基因簇的菌株,较不携带该基因的唐菖蒲伯克霍尔德菌有明显遗传进化倾向。结论 唐菖蒲伯克霍尔德菌椰毒致病变种DBJ分离株基因组中携带产米酵菌酸的bon基因簇,是引起食物中毒的主要原因。     

短小芽孢杆菌与化学杀细菌剂协同防治烟草青枯病研究

为探究短小芽孢杆菌与化学杀菌剂联合防控烟草青枯病的可行性,分别采用改良抑菌圈法和平板菌落计数法测定7种杀菌剂和短小芽孢杆菌AR03对青枯雷尔氏菌的毒力及杀菌剂与AR03的生物相容性,同时采用Horsfall法确定杀菌剂和AR03的复配比例。室内毒力试验结果表明,7种杀菌剂和AR03对青枯雷尔氏菌的生长均有较好的抑制作用。7种杀菌剂的毒力大小依次为三氯异氰尿酸、氯尿·硫酸铜、噻菌铜、溴菌·壬菌铜、甲霜·福美双、噻唑锌和中生菌素,EC₅₀值介于101.02~212.70 mg/L之间。浓度为1.0×10⁵~1.0×10⁹ cfu/mL的AR03对青枯雷尔氏菌的抑菌率介于26.13%~73.54%之间,呈现浓度依赖性。生物相容性分析发现7种供试药剂与AR03的生物相容性差异较大,短小芽孢杆菌AR03与噻菌铜、噻唑锌、甲霜·福美双生物相容性较好,尤其是噻菌铜表现最好,测试浓度100 mg/L时,菌落数大于1×10⁷cfu/mL。综合杀菌剂对青枯病菌的毒力及其与AR03生物相容性,噻菌铜表现最优。噻菌铜（EC₅₀=175.21 mg/L）与AR03（EC₅₀=6.84×10⁶ cfu/mL）复配剂在体积比为5∶5时,对青枯雷尔氏菌的抑制效果显著,增效作用明显,增效比率值I_R值为1.482。室内盆栽试验结果表明,菌药复配剂的防效（68.77%）明显优于单剂噻菌铜和生防菌AR03的防效,且混配剂中噻菌铜使用量只有单剂的1/2,大幅降低了化学药剂的使用量。     

烟草内生青枯病拮抗细菌的筛选和初步鉴定

为了获得防治烟草青枯病新途径,从湖南桂阳烟草青枯病重病区采集的健株上,共分离到内生菌株160个。经对峙培养法测定,32个菌株对烟草青枯菌有拮抗作用,其中H-1、H-9和H-11有强拮抗作用,抑菌圈分别为3.0、3.0、4.5 mm。根据其形态特征和生理生化性状,初步鉴定内生菌H-1为枯草芽孢杆菌,H-9和H-11为短芽孢杆菌。     

河南植烟区烟草黑胫病菌生理小种的鉴定及遗传多样性分析

为了探索河南主要烟草种植区烟草黑胫病菌生理小种及遗传分化关系,采用实验室组织培养瓶鉴定法对从河南烟叶产区分离到的28株黑胫病菌进行了生理小种鉴定,同时利用RAPD熔解曲线分析法(McRAPD)对28株烟草黑胫病菌进行了遗传多样性分析。结果表明:1从28个烟草黑胫病菌分离株中准确鉴定出25株1号生理小种,占供试菌株的89.2%,其余3株黑胫病菌的生理小种类型尚未确定;2采用非加权组平均法(UPGMA),以遗传距离0.79将供试的28个菌株划分为6个遗传聚类组,除部分同一或临近烟区的菌株被划分为同一遗传聚类组外,大多数菌株的遗传分化与地理位置远近没有直接的相关性,与生理小种类型的划分也没有直接的相关性。     

江苏地区肉鸡屠宰链弯曲菌分离菌株毒力基因分布及分子分型研究

目的了解江苏地区肉鸡屠宰生产链中弯曲菌分离菌株毒力基因分布及不同环节分离菌株遗传相关性。方法利用特异性引物对肉鸡屠宰过程不同环节分离所得的96株弯曲菌分离菌株的10种致病相关毒力基因进行聚合酶链式反应(polymera sechainre action,PCR)检测,应用多位点序列分型(multilocus sequence typing,MLST)方法对分离菌株进行分子分型研究,通过与弯曲菌MLST数据库比对获得各株菌等位基因值、序列型(sequence types,STs)及克隆复合体。结果96株分离菌株中,flaA、cadF和cdtB毒力基因携带率均为100%,其次为cdtC、iam和cdtA毒力基因,携带率较高,分别为96.9%、86.5%和84.4%,另外3个毒力基因flhA、virB11、ciaB携带率均较低,分别为25.0%、15.6%、11.5%;格林-巴利综合症相关毒力基因wlaN在所有菌株中均无检出。MLST分型结果显示,96株弯曲菌可分为10个STs,其中2个为新STs,形成1种优势克隆复合体CC828(56株)和4种未定义的克隆复合体,表现为较低的遗传多样性。结论肉鸡屠宰生产链中弯曲菌毒力基因分布广泛,不同环节弯曲菌分离菌株遗传多样性较低,表明弯曲菌在肉鸡屠宰生产链中存在交叉污染。     

黑曲霉孢子粉粗提物对青枯雷尔式菌的抑菌机制初探

以黑曲霉（Aspergillus niger）孢子粉作为原料,对其粗提物进行分离,以青枯雷尔式菌（Rastonia solanacearum）为指示菌,对抑菌活性进行监测,并利用气相色谱-质谱联用（GC-MS）技术分析其活性成分。通过测定电导率、核酸蛋白泄露、总蛋白以及活性氧（ROS）等指标的变化分析黑曲霉抑菌机制。结果显示,黑曲霉粗提物洗脱液S5对青枯雷尔式菌具有良好的抑菌效果,抑菌率可达90.87%;GC-MS检测结果显示,其主要成分为油酸（26.52%）、亚油酸甲酯（14.46%）、油酸甲酯（11.10%）、棕榈酸（10.50%）、油酸乙酯（7.36%）、亚油酸乙酯（6.88%）等;粗提物主要通过影响细胞膜完整性、损伤细胞结构、抑制细胞蛋白质合成及能量代谢等方面达到抑制菌株Q11-2的效果。