结核分枝杆菌ATP依赖的丝氨酸蛋白酶调节亚基C2基因原核表达质粒的构建及表达

目的构建结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB)ATP依赖的丝氨酸蛋白酶调节亚基C2(ATP-dependent Clp regulatory subunit C2,ClpC2)基因的原核表达质粒,并在大肠埃希菌中表达重组蛋白。方法以MTB H37Rv基因组DNA为模板,PCR扩增ClpC2基因,插入表达载体pET32a(+)中,构建重组原核表达质粒pET32a(+)-ClpC2,经双酶切及测序鉴定正确后,转化大肠埃希菌BL21(DE3),IPTG诱导表达。表达产物经SDS-PAGE和Western blot进行鉴定。结果重组表达质粒经双酶切和测序鉴定,证明构建正确;表达的重组融合蛋白相对分子质量约46 000,可与鼠抗组氨酸单克隆抗体特异性结合。结论已成功构建了重组表达质粒pET32a(+)-ClpC2,并在大肠埃希菌中表达了重组蛋白,为进一步研究ClpC2蛋白的生物学功能奠定了基础。     

甘油脱水酶α亚基基因的克隆、表达及纯化

目的克隆甘油脱水酶α亚基基因,构建表达载体,表达并纯化融合蛋白。方法采用PCR技术克隆甘油脱水酶α亚基gldA基因,并将其重组到含组氨酸标签的表达质粒pET-32a(+)中。将重组质粒经热激转化至大肠杆菌BL21(DE3)中,IPTG诱导表达。表达产物经金属螯合层析柱纯化,并进行Western blot分析及活性检测。结果重组表达质粒pET/gldA经酶切鉴定及序列分析,证明构建正确。转化E.coliBL21(DE3)后,重组蛋白获得可溶性表达,融合蛋白相对分子质量约81000,与预期大小一致。经Western blot分析,纯化蛋白能与6-Histidine抗体产生特异性免疫反应。α亚基经检测,未显示活性。结论已成功获得甘油脱水酶α亚基蛋白,为进一步研究其生物学性能奠定了基础。     

HIV-1 HXB2株Tat核心碱性区多肽Tat_(38-61)的原核表达及其免疫反应性

目的 构建HIV-1 Tat核心碱性区多肽Tat38-61重组原核表达质粒,在大肠杆菌中表达融合蛋白并进行纯化及免疫反应性检测。方法采用PCR法从HIV-1 HXB2株Tat1-101基因中扩增编码Tat38-61的基因序列,克隆至原核表达载体pET32a(+)中,构建重组原核表达质粒pET32a(+)-Tat38-61。转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达。表达产物经Ni2+-NTA柱亲和层析法纯化后,ELISA法鉴定其免疫反应性。结果重组原核表达质粒pET32a(+)-Tat38-61经双酶切及测序表明构建正确;SDS-PAGE分析显示,在相对分子质量约21 300处可见目的 蛋白条带,表达量占菌体总蛋白的67.4%,主要以可溶形式表达;纯化后融合蛋白的纯度可达97%以上;ELISA结果显示,该融合蛋白与兔抗PEPTIDE-Tat1-101血清及HIV阳性血清均呈特异性反应。结论已成功构建了HIV-1 Tat核心碱性区多肽Tat38-61的重组原核表达质粒,表达并纯化了PET32a(+)-Tat38-61融合蛋白,该融合蛋白碱性区表位得到较好的保留,为Tat38-61噬菌体突变文库的构建及亲和筛选奠定了基础。     

融合蛋白TF-CTP-OD-HA和TF-CTP-OD1-HA的原核表达、纯化及其生物学活性

目的原核表达、纯化融合蛋白TF-CTP-OD-HA和TF-CTP-OD1-HA,并检测其生物学活性。方法以pET32a(+)CTP-OD-HA为模板,PCR扩增OD序列中的第1-87 bp和第190-216 bp序列,并通过重叠PCR连接成为新序列,命名为OD1,克隆至pET32a(+)载体,构建原核表达质粒pET32a(+)CTP-OD1-HA;再分别以pET32a(+)CTP-OD-HA和pET32a(+)CTP-OD1-HA质粒为模板,PCR扩增CTP-OD-HA和CTP-OD1-HA片段,分别克隆至表达载体pCOLDTF-DNA,构建质粒pCOLD-TF-CTP-OD-HA和pCOLD-TF-CTP-OD1-HA,转化E.coli BL21,IPTG诱导表达TF-CTPOD-HA和TF-CTP-OD1-HA融合蛋白;表达的融合蛋白经镍离子亲和层析纯化和脱盐浓缩后,采用MTT法和DAPI染色检测两种融合蛋白对K562细胞的增殖抑制和诱导凋亡作用。结果重组原核表达质粒pCOLD-TF-CTP-OD-HA和pCOLD-TF-CTP-OD1-HA经菌落PCR及测序证实构建正确;表达的TF-CTP-OD-HA和TF-CTP-OD1-HA融合蛋白相对分子质量分别约为67 000和63 000,主要为可溶性表达,表达量分别占总菌体蛋白的35%和20%,脱盐浓缩后,纯度分别约为98%和95%,均可与鼠抗HA单克隆抗体特异性结合;TF-CTP-OD-HA和TF-CTP-OD1-HA对K562细胞的增殖抑制率分别为34%和31%,与PBS对照组比较,差异有统计学意义(P0.001);TF-CTP-OD-HA和TFCTP-OD1-HA处理的K562细胞胞核均具有细胞凋亡的典型特征。结论原核表达并纯化了TF-CTP-OD1-HA融合蛋白,该蛋白具有与TF-CTP-OD-HA相似的生物学活性,为今后开发治疗慢性粒细胞白血病的小分子多肽药物提供了新的策略。     

链霉菌FJS31-2 abxR2基因克隆表达及蛋白纯化

利用原核表达系统获得链霉菌FJS31-2 AbxR2重组蛋白,并进行纯化。通过PCR扩增abxR2基因,将扩增产物克隆至pET32a质粒上构建重组质粒pET32a-abxR2;将重组质粒转化至大肠埃希菌Rosetta(DE3)感受态细胞中进行IPTG诱导表达,并通过尿素洗涤方式对AbxR2重组蛋白进行纯化。酶切和测序结果均证实重组质粒pET32a-abxR2构建成功;在菌液OD₆₀₀值为0.6、28℃、110 r·min^-1、1.0 mmol·L^-1 IPTG诱导4 h时,AbxR2重组蛋白的表达效果较好;采用尿素洗涤方式纯化AbxR2重组蛋白,可得到单一特异蛋白条带,效果较好。为研究AbxR2蛋白的结构和功能及提高Zunyimycins产量奠定了基础。     

CTP-OD-HA融合蛋白的原核表达及其活性鉴定

目的构建CTP-OD-HA融合基因原核表达质粒,表达并纯化融合蛋白,并检测其在人慢性粒细胞白血病(CML)K562细胞株中的转导活性及胞浆定位。方法分别将胞浆转导肽(CTP)、寡聚化区域(OD)基因和流感病毒血凝素抗原表位(HA)片段依次连接入pET32a(+)质粒,构建重组原核表达质粒pCTP-OD-HA,转化感受态大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达,经亲和纯化、Western blot验证、肠激酶切割、目的蛋白回收和FITC标记后,将FITC-CTP-OD-HA融合蛋白作用于K562细胞,观察其转导活性及细胞定位。结果重组原核表达质粒pCTP-OD-HA经酶切及测序鉴定,证明构建正确。37℃,1 mmol/LIPTG诱导4h,目的蛋白的表达量最高,约占菌体总蛋白的35%,纯化后纯度达95%以上。FITC-CTP-OD-HA融合蛋白在K562细胞中具有高转导活性和显著的胞浆定位特性。结论已成功构建CTP-OD-HA融合基因原核表达质粒,并高效表达了目的蛋白,为进一步研究其在CML信号转导通路中的作用,阐明CML的发病机制及探讨蛋白肽在CML中的治疗策略奠定了基础。     

日本血吸虫双表膜抗原融合基因原核表达质粒的构建及表达

目的构建编码日本血吸虫表膜蛋白SjTsp2与Sj29融合基因的原核表达质粒,并表达重组蛋白。方法利用基因SOEing PCR技术得到SjTsp2与Sj29融合基因,将其克隆入原核表达载体pET32a中,转化E.coli BL21(DE3),IPTG诱导表达,SDS-PAGE和Western blot进行鉴定。结果序列分析显示,融合基因与两个目的基因的同源性达100%;SDS-PAGE显示表达的重组蛋白相对分子质量为43000,表达量占菌体总蛋白的20%以上;Western blot显示其分别能与SjTsp2和Sj29蛋白的单克隆抗体结合。结论已成功构建了SjTsp2与Sj29融合基因原核表达质粒,并在大肠杆菌中表达了重组蛋白,为研制血吸虫病疫苗提供了材料。     

慢性粒细胞白血病Bcr/Abl基因OD域融合蛋白的原核表达及纯化

目的原核表达并纯化慢性粒细胞白血病(CML)Bcr/Abl基因OD域融合蛋白。方法将TAT、OD和HA基因片段顺次克隆入pET32a(+)原核表达载体,构建重组原核表达质粒pTAT-OD-HA,经PCR、双酶切和测序鉴定正确的重组质粒转化E.coliBL2(lDE3),IPTG诱导表达,表达产物经SDS-PAGE及Westernblot分析后,用镍离子亲和层析柱纯化。结果所构建的重组质粒pTAT-OD-HA经PCR、双酶切及测序鉴定正确;表达的重组蛋白相对分子质量约为30000,诱导6h蛋白表达量达最高,约为10%;Westernblot分析显示,该蛋白可与鼠抗HA单克隆抗体发生特异性反应;纯化后纯度约为95%。结论已成功原核表达并纯化了TAT-OD-HA融合蛋白,为进一步研究其在CML中的作用奠定了基础。     

结核分枝杆菌复活促进因子E的原核表达及纯化

目的构建结核分枝杆菌复活促进因子E(RpfE)的原核表达质粒,在大肠杆菌中表达并纯化。方法采用PCR方法从结核分枝杆菌H37Rv基因组DNA中扩增出RpfE基因,双内切酶消化后,与同样酶消化的pET32a(+)载体连接,转化大肠杆菌Top10。阳性克隆经酶切和DNA测序鉴定正确后,将重组质粒转化至大肠杆菌BL21中,经IPTG诱导,由T7启动子调控表达RpfE蛋白,并对表达蛋白进行鉴定和纯化。结果双酶切鉴定所切下的片段大小与预期相符,测序结果与文献报道一致。经SDS-PAGE分析和Western blot鉴定,在相对分子质量41000处均可见特异性蛋白条带。经Ni2+-NTA金属螯合层析后,重组蛋白纯度可达90%以上。结论已成功地克隆并构建了RpfE基因的重组表达质粒pET32a(+)-RpfEv,并获得了高纯度的重组蛋白,为以后的深入研究奠定了基础。     

百日咳杆菌腺苷酸环化酶毒素基因的克隆及原核表达

目的克隆百日咳杆菌腺苷酸环化酶毒素(CyaA,ACT)基因,表达并纯化重组CyaA蛋白。方法从百日咳杆菌CS株的基因组DNA中PCR扩增CyaA编码基因,克隆入载体pET30a,构建重组原核表达质粒pET30a/cyaA,转化感受态大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达。表达的重组蛋白经8mol/L尿素变性、透析复性、DEAE阴离子交换柱纯化后,采用Western blot法鉴定其反应原性。结果重组原核表达质粒pET30a/cyaA经PCR、双酶切及测序证明构建正确;表达的重组蛋白主要以包涵体形式存在,表达量约占菌体总蛋白的20%;纯化的重组蛋白纯度达90%左右,可与全细胞百日咳疫苗和无细胞百日咳疫苗免疫血清结合。结论已成功克隆了百日咳杆菌cyaA基因,并在大肠杆菌中表达了重组CyaA蛋白,为进一步开展CyaA的应用研究奠定了基础。     

金黄葡萄球菌ClfA活性基因的克隆及原核表达

目的克隆金黄葡萄球菌表面蛋白凝集因子A(ClfA)活性基因,并进行原核表达。方法以金黄葡萄球菌基因组DNA为模板,采用PCR方法扩增ClfA(221-550)活性基因,克隆入载体pET28a(+)中,构建重组表达质粒pET28a-ClfA(221-550),转化感受态大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达,并对表达产物进行SDS-PAGE和Western blot分析。结果PCR扩增出987bp的目的基因片段,重组表达质粒经双酶切证明构建正确。表达产物经SDS-PAGE分析,在相对分子质量约36000处可见目的条带,目的蛋白表达量约占菌体总蛋白的36.76%,且具有良好的反应原性。结论已成功克隆了金黄葡萄球菌ClfA活性基因,并在大肠杆菌BL21(DE3)中表达了目的蛋白。     

鲎血G因子的原核表达

目的在大肠埃希菌中表达重组鲎血G因子,并检测其酶活性。方法根据大肠埃希菌偏好性优化G因子成熟肽编码序列,将G因子α亚基及β亚基克隆至原核表达载体pET32a-sumo上,分别构建pET32a-sumo/factorG-α及pET32a-sumo/factorG-β原核表达质粒,转化E. coli BL21(DE3),IPTG诱导表达;产物经Ni-NTA亲和层析,SUMO蛋白酶切割融合伴侣,获得重组目的蛋白factorG-α及factorG-β;将二者等摩尔质量重组获得复合物G,荧光底物Boc-Glu-(OBzl)-Gly-Arg-MCA检测其酶活性。结果经PCR及测序鉴定,重组质粒pET32a-sumo/factorG-α及p ET32a-sumo/factorG-β构建正确;表达蛋白均以包涵体的形式存在沉淀中,表达量占菌体总蛋白的30%及45%;纯化的factorG-α及factorG-β蛋白相对分子质量约为74 000和31 000,每1 L LB培养基酶切回收蛋白分别为0. 7和1. 7 mg。factorG-α及factorG-β蛋白与荧光底物几乎不反应,而复合物G可与荧光底物反应产生较高的荧光强度。结论成功表达了具有酶活性的鲎血G因子,为进一步探讨鲎血G因子的生物学功能及新型真菌感染检测试剂盒开发奠定了基础。     

纤维素外切酶CbhA在大肠杆菌中的重组表达、纯化及活性研究

根据GenBank上纤维素外切酶CbhA的基因序列,设计并克隆目的基因;将目的基因克隆至表达载体pET32a,构建重组质粒pET32a-CbhA;再将重组质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,成功构建了重组工程菌BL21(DE3)-pET32a-CbhA,探讨了诱导温度、IPTG浓度和诱导时间对重组工程菌表达量的影响。结果表明,所构建的重组工程菌在诱导温度为33℃、IPTG浓度为0.7 mmol·L~(-1)、诱导时间为8h的条件下,表达量可达到46.37 mg·L~(-1),具有较高的纤维素降解活性。该研究为纤维素酶在大肠杆菌中后续共表达和酶的放大发酵技术的建立奠定了重要基础。     

通过自诱导方法对乙型肝炎病毒聚合酶TP区进行可溶性表达及鉴定

目的构建包含乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)聚合酶TP区段的重组原核表达质粒,转化表达型大肠埃希菌,以自诱导培养方法获得可溶性表达,并对其进行鉴定。方法分析HBV(A型)聚合酶N-末端1-192 AA区域的DNA序列,通过网络工具(http://www.jcat.de/)在线优化,并在5′和3′端分别添加NdeⅠ和XhoⅠ限制性内切酶位点后,送英潍捷基(上海)贸易有限公司进行人工合成;将人工合成的TP-DNA双酶切后,插入pET32a(+)原核表达载体,构建重组原核表达质粒,转化大肠埃希菌BL21(DE3)pLysS进行自诱导表达。结果重组原核表达质粒pET32a(+)/POL-TP-Opt经双酶切及测序证明构建正确;在表达菌的破菌上清中有特异性表达的蛋白,相对分子质量约20 000,经SDS-PAGE和Western blot鉴定,为可溶性的重组TP蛋白。结论通过自诱导培养方法,直接成功获得可溶性的重组TP蛋白,改变了长期以来依靠包涵体复性对TP蛋白相关功能进行研究的状况。     

结核分枝杆菌PPE68蛋白的原核表达及纯化

目的构建结核分枝杆菌PPE68基因的原核表达质粒,并在大肠杆菌中进行表达和纯化。方法以结核分枝杆菌H37Rv基因组DNA为模板,PCR法扩增PPE68基因,将其克隆至pET-32a(+)载体中,构建重组原核表达质粒pET-32a(+)-PPE68,转化至大肠杆菌BL21(DE3)中,IPTG诱导表达。表达产物经SDS-PAGE及Western blot鉴定后,进行纯化。结果重组表达质粒pET-32a(+)-PPE68经PCR及双酶切鉴定构建正确,测序结果与GenBank中登录的PPE68基因序列一致。表达的Trx-PPE68融合蛋白相对分子质量约为57000,表达量约占菌体总蛋白的41%,可与结核分枝杆菌免疫小鼠血清发生特异性反应。纯化的重组蛋白纯度约为93%。结论已成功构建了结核分枝杆菌PPE68基因重组原核表达质粒pET-32a(+)-PPE68,原核表达并纯化了重组蛋白,为PPE68作为结核病特异性诊断抗原的开发及重组BCG疫苗的研制奠定了基础。     

X盒结合蛋白1-u的原核表达及纯化

目的构建X盒结合蛋白1-u(XBP1-u)基因原核表达质粒,表达并纯化XBP1-u蛋白。方法利用RT-PCR技术从肝癌细胞HepG2中扩增XBP1-u基因,先插入中间载体pGEM-Teasy,再将其克隆至原核表达载体pET32a,构建重组原核表达质粒pET32a-XBP1-u,转化E.coliBL21(DE3),IPTG诱导表达。表达产物经Ni-NTA树脂柱亲和层析纯化后,进行Western blot鉴定。结果测序分析证实,克隆入pET32a的XBP1-u序列与GenBank中登录的XBP1-ucDNA序列一致。IPTG的最佳诱导浓度为0.5mmol/L,最佳诱导时间为6h。目的蛋白以包涵体形式表达,相对分子质量约为33000。纯化的蛋白经SDS-PAGE分析显示单一条带,且具有良好的反应原性。结论已成功构建了XBP1-u基因原核表达质粒,表达并纯化了XBP1-u蛋白,为XBP1-u在肿瘤发病中的作用机制及在应激性疾病临床治疗中的研究奠定了基础。     

大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位的原核表达及活性鉴定

目的克隆大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位(ltB)基因,构建其原核表达质粒,并对表达产物进行活性鉴定。方法采用PCR技术从产毒大肠杆菌129株基因组DNA中扩增ltB基因,克隆入载体pET-32a(+)中,构建原核表达质粒pET-32a(+)-ltB,转化E.coli BL21(DE3),IPTG诱导表达,Ni2+-NTA树脂层析柱进行纯化,纯化产物采用ELISA法鉴定其与牛GM1的结合活性。结果重组表达质粒经菌落PCR鉴定证明构建正确,所克隆的ItB基因与GenBank中报道的相应核苷酸序列的同源性为99.9%。重组菌诱导4h,目的蛋白表达量最高,约占菌体总蛋白的25%。纯化的重组LTB蛋白纯度约为96%,具有与牛GM1特异性结合的生物学活性。结论已成功克隆了ltB基因,并构建了其原核表达质粒,表达的重组蛋白具有一定的生物学活性。     

结核分枝杆菌ATP依赖的丝氨酸蛋白酶蛋白水解亚基1基因的原核表达

目的构建结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB)ATP依赖的丝氨酸蛋白酶蛋白水解亚基1(ATP-dependent Clp proteolytic subunit 1,ClpP1)基因重组原核表达质粒,并在大肠埃希菌中表达重组蛋白。方法从结核分枝杆菌H37Rv株基因组DNA中PCR扩增ClpP1基因,插入原核表达载体pET-32a(+)中,构建重组表达质粒pET-32a(+)-ClpP1,转化大肠埃希菌B21(DE3),IPTG诱导表达。表达产物经SDS-PAGE和Western blot进行鉴定。结果重组表达质粒pET-32a(+)-ClpP1经双酶切和测序鉴定,证明构建正确;表达的重组蛋白相对分子质量约35 000,可与鼠抗His单克隆抗体特异性结合。结论成功构建了重组表达质粒pET-32a(+)-ClpP1,并在大肠埃希菌中表达了重组蛋白,为进一步研究ClpP1蛋白在MTB中的生物学特性奠定了基础。     

培养基因工程菌表达未酰化胸腺素α1的研究

通过摇瓶培养对含有Thymosin α1基因的重组pET32a质粒的工程菌BL21的生长和融合蛋白表达进行了研究.选择LB和TH培养基,考察了培养温度、摇瓶中培养基盛装量、葡萄糖添加量、诱导剂IPTG浓度、诱导时间等因素对工程菌生长和融合蛋白表达的影响.确定最适生长温度为35～37℃、最佳蛋白表达温度为30℃,对数生长中期诱导,诱导剂浓度为0.4～0.5 mmol·L-1,诱导时间为4～6 h.其融合蛋白表达量占菌体蛋白总量的26.83%.     

内含肽介导的重组人干扰素α2a的原核表达及其生物学活性

目的原核表达内含肽介导的重组人干扰素α2a(rhIFNα2a)融合蛋白,并检测其生物学活性。方法以质粒pBV220-IFN-α2a为模板PCR扩增rhIFNα2a基因,将其插入原核表达载体pTWIN1的内含肽Ssp DnaB基因下游的多克隆位点,构建重组表达质粒pTWIN1-rhIFNα2a,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达,表达产物进行SDS-PAGE及Western blot分析,并对裂菌上清的生物学活性进行测定。结果双酶切及测序结果显示,融合蛋白基因已克隆入表达载体中;rhIFNα2a蛋白的相对分子质量约44 300,表达量占全菌总蛋白的30%,在裂菌上清中的表达量占目的蛋白的25%,可与小鼠抗hIFNα单克隆抗体特异性结合;裂菌上清中rhIFNα2a蛋白的活性为5.57×107IU/ml,表明该重组蛋白具有良好的IFN抗病毒活性。结论已成功在大肠杆菌BL21(DE3)中表达了具有生物学活性的可溶性重组rhIFNα2a与内含肽Ssp DnaB融合蛋白,为大量生产IFNα2a提供了新的思路。