羊布氏菌vjbR基因的克隆及原核表达

目的克隆并原核表达羊布氏菌强毒株16M vjbR基因。方法 PCR扩增羊布氏杆菌16M株vjbR基因,亚克隆至原核表达载体pET-28a中,构建重组原核表达质粒pET-28a-vjbR,转化感受态大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达。表达的重组蛋白经His Trap FF纯化后,进行Western blot分析。结果扩增的vjbR基因大小为708 bp,与预期一致;重组原核表达质粒pET-28a-vjbR经双酶切及测序证明构建正确;表达的重组蛋白相对分子质量约为29 000,诱导4 h表达量可达6.84 mg/ml;纯化的重组蛋白纯度为65.7%,能被羊布氏杆菌阳性血清所识别。结论成功在大肠杆菌中表达了羊布氏菌VJBR蛋白,为其功能的研究、羊布病诊断试剂盒的研制及亚单位疫苗的研发奠定了基础。     

小鼠鸟氨酸脱羧酶抗酶1功能基因的克隆及原核表达

目的克隆小鼠鸟氨酸脱羧酶抗酶1(OAZ1)功能基因,原核表达并纯化OAZ1重组蛋白。方法采用RT-PCR法从小鼠黑色素瘤细胞总RNA中扩增OAZ1基因,通过重叠延伸PCR技术构建无需移码即可全长翻译的功能基因,并构建重组表达质粒pET15b/OAZ1-T,转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导表达。表达的重组蛋白经Ni2+-NTA亲和层析纯化后,进行SDS-PAGE和Western blot分析。结果重叠PCR法扩增出692bp的OAZ1功能基因,重组表达质粒经酶切及测序鉴定正确,重组蛋白可在大肠杆菌中以包涵体形式高效表达。纯化的重组蛋白纯度可达79.96%,且可与抗His标签抗体特异性结合。结论已成功克隆了小鼠OAZ1功能基因,原核表达并纯化了重组OAZ1蛋白。     

b型流感嗜血杆菌D蛋白的原核表达及纯化

目的克隆b型流感嗜血杆菌(Haemophlilus influenza type b,Hib)D蛋白(hpd)基因,原核表达并纯化重组hpd蛋白,为下一步开发以D蛋白为基础的结合疫苗奠定基础。方法从Hib CMCC株基因组DNA中PCR扩增hpd基因片段,克隆入载体pET-30a(+),构建重组原核表达质粒pET-30a-hpd,转化入感受态大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达。表达的重组蛋白经6 mol/L尿素变性、DEAE阴离子交换柱纯化、透析复性后,采用Western blot法鉴定其反应原性。结果重组表达质粒pET-30a-hpd经PCR及测序证明构建正确;表达的重组蛋白以包涵体形式存在,表达量约占菌体总蛋白的40%;经一步过柱纯化可得到纯度达95%左右的重组蛋白;纯化的重组蛋白可与Hib免疫小鼠制备的抗血清发生特异性反应。结论已成功克隆了Hib hpd基因,并在大肠杆菌中表达了重组hpd蛋白,为下一步开发以D蛋白为基础的结合疫苗奠定了基础。     

结核分枝杆菌PPE68蛋白的原核表达及纯化

目的构建结核分枝杆菌PPE68基因的原核表达质粒,并在大肠杆菌中进行表达和纯化。方法以结核分枝杆菌H37Rv基因组DNA为模板,PCR法扩增PPE68基因,将其克隆至pET-32a(+)载体中,构建重组原核表达质粒pET-32a(+)-PPE68,转化至大肠杆菌BL21(DE3)中,IPTG诱导表达。表达产物经SDS-PAGE及Western blot鉴定后,进行纯化。结果重组表达质粒pET-32a(+)-PPE68经PCR及双酶切鉴定构建正确,测序结果与GenBank中登录的PPE68基因序列一致。表达的Trx-PPE68融合蛋白相对分子质量约为57000,表达量约占菌体总蛋白的41%,可与结核分枝杆菌免疫小鼠血清发生特异性反应。纯化的重组蛋白纯度约为93%。结论已成功构建了结核分枝杆菌PPE68基因重组原核表达质粒pET-32a(+)-PPE68,原核表达并纯化了重组蛋白,为PPE68作为结核病特异性诊断抗原的开发及重组BCG疫苗的研制奠定了基础。     

慢性粒细胞白血病Bcr/Abl基因OD域融合蛋白的原核表达及纯化

目的原核表达并纯化慢性粒细胞白血病(CML)Bcr/Abl基因OD域融合蛋白。方法将TAT、OD和HA基因片段顺次克隆入pET32a(+)原核表达载体,构建重组原核表达质粒pTAT-OD-HA,经PCR、双酶切和测序鉴定正确的重组质粒转化E.coliBL2(lDE3),IPTG诱导表达,表达产物经SDS-PAGE及Westernblot分析后,用镍离子亲和层析柱纯化。结果所构建的重组质粒pTAT-OD-HA经PCR、双酶切及测序鉴定正确;表达的重组蛋白相对分子质量约为30000,诱导6h蛋白表达量达最高,约为10%;Westernblot分析显示,该蛋白可与鼠抗HA单克隆抗体发生特异性反应;纯化后纯度约为95%。结论已成功原核表达并纯化了TAT-OD-HA融合蛋白,为进一步研究其在CML中的作用奠定了基础。     

大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位的原核表达及活性鉴定

目的克隆大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位(ltB)基因,构建其原核表达质粒,并对表达产物进行活性鉴定。方法采用PCR技术从产毒大肠杆菌129株基因组DNA中扩增ltB基因,克隆入载体pET-32a(+)中,构建原核表达质粒pET-32a(+)-ltB,转化E.coli BL21(DE3),IPTG诱导表达,Ni2+-NTA树脂层析柱进行纯化,纯化产物采用ELISA法鉴定其与牛GM1的结合活性。结果重组表达质粒经菌落PCR鉴定证明构建正确,所克隆的ItB基因与GenBank中报道的相应核苷酸序列的同源性为99.9%。重组菌诱导4h,目的蛋白表达量最高,约占菌体总蛋白的25%。纯化的重组LTB蛋白纯度约为96%,具有与牛GM1特异性结合的生物学活性。结论已成功克隆了ltB基因,并构建了其原核表达质粒,表达的重组蛋白具有一定的生物学活性。     

百日咳黏附素的原核表达及其单克隆抗体的制备

目的原核表达百日咳黏附素(Pertactin,Prn),并制备抗Prn单克隆抗体。方法从无细胞百日咳疫苗生产菌株CS株基因组DNA中克隆Prn基因,插入表达载体pQE-30中,构建重组表达质粒pQE-30-Prn,转化E.coli M15,IPTG诱导表达。表达的重组Prn蛋白经阳、阴离子交换层析纯化后,采用Western blot和ELISA法鉴定重组Prn蛋白的反应原性。以纯化的重组Prn蛋白为免疫原,利用杂交瘤技术制备单克隆抗体,并对制备的单抗进行鉴定。结果重组表达质粒经双酶切和测序鉴定构建正确;表达的重组Prn蛋白相对分子质量约为69 000,主要以包涵体形式表达;纯化的重组Prn蛋白的纯度达95%以上,产量可达25 mg/L,能与不同来源的抗Prn-Ab血清特异性结合。获得2株分泌抗Prn单抗的杂交瘤细胞株,分泌的单抗均为IgG1类,轻链类型均为κ,效价均达1∶105以上,并能特异性识别Prn蛋白,而与百日咳杆菌其他抗原蛋白无交叉反应。结论原核表达、纯化了重组Prn蛋白,并制备了2株效价高、特异性强的单抗,为无细胞百日咳疫苗的质量控制及百日咳杆菌致病机制的研究提供了材料。     

植物乳杆菌中胆盐水解酶基因的原核表达及纯化

目的克隆植物乳杆菌中胆盐水解酶(BSH)基因,原核表达并纯化重组蛋白。方法利用PCR技术扩增植物乳杆菌BSH基因,克隆至表达载体pET-30a,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达,并对表达产物进行纯化及Western blot鉴定。结果重组表达质粒pET-30a-BSH经双酶切鉴定,可见961bp的目的基因条带。表达的重组蛋白相对分子质量约为40000(含6个His标签),主要以包涵体形式表达,表达量约占菌体总蛋白的43%,纯化后,纯度达90%以上,且可与植物乳杆菌多克隆抗血清发生特异性反应。结论已成功克隆了植物乳杆菌中BSH基因,并在大肠杆菌中获得高效表达。纯化的重组蛋白纯度较高,为高效降解胆固醇的基因工程菌株的研究奠定了基础。     

HIV-1 HXB2株Tat核心碱性区多肽Tat_(38-61)的原核表达及其免疫反应性

目的 构建HIV-1 Tat核心碱性区多肽Tat38-61重组原核表达质粒,在大肠杆菌中表达融合蛋白并进行纯化及免疫反应性检测。方法采用PCR法从HIV-1 HXB2株Tat1-101基因中扩增编码Tat38-61的基因序列,克隆至原核表达载体pET32a(+)中,构建重组原核表达质粒pET32a(+)-Tat38-61。转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达。表达产物经Ni2+-NTA柱亲和层析法纯化后,ELISA法鉴定其免疫反应性。结果重组原核表达质粒pET32a(+)-Tat38-61经双酶切及测序表明构建正确;SDS-PAGE分析显示,在相对分子质量约21 300处可见目的 蛋白条带,表达量占菌体总蛋白的67.4%,主要以可溶形式表达;纯化后融合蛋白的纯度可达97%以上;ELISA结果显示,该融合蛋白与兔抗PEPTIDE-Tat1-101血清及HIV阳性血清均呈特异性反应。结论已成功构建了HIV-1 Tat核心碱性区多肽Tat38-61的重组原核表达质粒,表达并纯化了PET32a(+)-Tat38-61融合蛋白,该融合蛋白碱性区表位得到较好的保留,为Tat38-61噬菌体突变文库的构建及亲和筛选奠定了基础。     

4Aβ_(1-15)的原核表达及纯化

目的在大肠杆菌中表达4Aβ1-15,并进行纯化。方法以重组质粒pcDNA3.1-s4Aβ1-15为模板,PCR扩增1-2Aβ1-15基因,并克隆至pQE30a原核表达载体中,构建重组表达质粒pQE30a-2Aβ1-15,再以其为模板,扩增2-2Aβ1-15基因,克隆入pQE30a-2Aβ1-15质粒中,构建重组原核表达质粒pQE30a-4Aβ1-15,转化大肠杆菌M15,IPTG诱导表达。表达产物经SDS-PAGE和Western blot鉴定后,采用Ni2+-NTA亲和层析柱纯化目的蛋白。结果重组表达质粒pQE30a-4Aβ1-15经双酶切和测序证明构建正确;表达的目的蛋白相对分子质量约为18 000,主要以可溶形式表达,表达量约占上清液总蛋白的40%,可与鼠抗人Aβ40单抗特异性结合;纯化后基本除去了杂蛋白。结论成功构建了重组原核表达质粒pQE30a-4Aβ1-15,表达并纯化了His6-4Aβ1-15融合蛋白,为阿尔茨海默病基因工程疫苗的研究奠定了基础。     

结核分枝杆菌Rv0057-Rv1352融合蛋白的制备及其初步应用

目的制备结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,M.tb)Rv0057-Rv1352融合蛋白,并通过化学发光酶免疫法分析其抗原性,以评价其应用价值。方法根据Rv0057和Rv1352蛋白序列,合成Rv0057和Rv1352基因片段并进行扩增,分别插入质粒pET30aSETB中,构建重组质粒Rv0057/pET30aSETB和Rv1352/pET30aSETB。用NheⅠ和XhoⅠ双酶切重组质粒Rv1352/pET30aSETB,SpeⅠ和XhoⅠ双酶切重组质粒Rv0057/pET30aSETB,将回收的Rv1352基因片段插入Rv0057/pET30aSETB质粒中,构建重组质粒Rv0057-Rv1352/pET30aSETB,转化感受态大肠埃希菌BL21(DE3),IPTG诱导表达。表达的包涵体蛋白经His.Bind蛋白纯化试剂盒纯化后,以其作为抗原建立化学发光酶免疫分析法,检测患者血清中抗结核抗体,并与市售M.tb抗体诊断试剂盒和痰涂片法进行比较。结果构建的重组质粒Rv0057-Rv1352/pET30aSETB的核苷酸序列与设计序列完全一致;表达的重组融合蛋白Rv0057-Rv1352相对分子质量约为30 500,主要以包涵体形式存在,表达量约占菌体总蛋白的30%;纯化的重组融合蛋白的浓度为1.6 mg/ml,纯度为95%;以其为抗原建立的化学发光酶免疫分析法检测患者血清中抗结核抗体的灵敏度和特异性分别为66.70%和90.00%,而市售M.tb抗体诊断试剂盒的灵敏度和特异性分别为80.00%和63.33%;30例活动性肺结核患者经痰涂片检测,灵敏度为20.0%,化学发光酶免疫分析法检测灵敏度为66.7%,二者差异有统计学意义(P<0.01)。结论成功制备了M.tb Rv0057-Rv1352融合蛋白,以其为抗原建立的化学发光酶免疫分析法检测抗结核抗体具有较高的灵敏度和特异性,在结核病血清学快速诊断方面具有广阔的应用前景。     

pET28a-Chaperonin 10重组载体的构建及SARS-CoV蛋白高效表达

目的建立在大肠杆菌中高效表达SARS-CoV蛋白的表达系统。方法PCR扩增BCG分子伴侣10基因,并将其连接到pET28a载体上,构建成分子伴侣10融合蛋白表达载体。在该载体Chaperonin10基因的3′端克隆SARS-N、SARS-E、SARS-S和SARS-M基因,在BL21(DE3)中进行诱导表达。结果SARS-E、SARS-N在与分子伴侣10融合后能获得高效表达。结论该表达系统可使部分在大肠杆菌中难于表达的SARS-CoV蛋白获得高表达。     

人表皮生长因子受体HER2胞外近膜区基因的克隆及原核表达

目的克隆人表皮生长因子受体HER2胞外近膜区基因,原核表达并纯化重组蛋白。方法从人乳腺癌细胞系SK-Br3中扩增HER2胞外近膜区编码基因,克隆并测序后,插入原核表达质粒pET41d中,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达,并进行纯化。结果从SK-Br3细胞系中扩增出387bp的人HER2胞外近膜区基因;重组表达质粒pET41d/HER2构建正确;IPTG浓度为0.5mmol/L时,目的蛋白的表达量最高;纯化后重组蛋白浓度为1.5mg/ml。结论已成功表达了HER2胞外近膜区蛋白,为抗HER2单克隆抗体的制备提供了抗原。     

人CD271基因的克隆及原核表达

目的克隆人CD271基因,并在大肠杆菌中表达。方法采用RT-PCR技术从人REH细胞系中扩增CD271基因,将其克隆入pET22b表达载体,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达,并对表达产物进行纯化及Western blot鉴定。结果重组表达质粒pET22b/CD271经双酶切鉴定,可见1197bp的目的基因条带。表达产物经SDS-PAGE分析,在相对分子质量约75000处可见表达条带。IPTG浓度为0.5mmol/L时,目的蛋白表达量最高。纯化后蛋白纯度为82.5%。Western blot检测表明纯化后的蛋白具有良好的反应原性。结论已成功克隆了人CD271基因,并在大肠杆菌中获得表达。     

Ⅱ型B族链球菌表面免疫相关蛋白基因的克隆和原核表达

目的重组表达Ⅱ型B族链球菌表面免疫相关蛋白(Surfaceimmunogenicprotein,SIP)基因,为进一步免疫学研究提供目标蛋白。方法用PCR的方法从GBSⅡ型标准株的基因组DNA中扩增出SIP基因,用T/A克隆法将其插入pMD18T载体,构建原核表达载体pET32aSIP,用BL21(DE3)/pET系统表达TrixSIP融合蛋白,SDSPAGE和质谱分析鉴定表达产物,并对表达蛋白进行初步纯化。结果PCR扩增产物经测序,证实与GenBank中Ⅰa/c型GBS的SIP的基因序列同源性为99%。SDSPAGE显示,经IPTG诱导后BL21(DE3)/pET32aSIP总蛋白中出现一条相对分子质量为66000的新蛋白带。质谱分析和蛋白质库的比较证实其为B族链球菌表面免疫相关蛋白(SIP)的可能性分数为74。结论已成功表达并初步纯化SIP,为SIP在细菌致病中的作用研究以及相关疫苗的制备奠定了基础。     

重组小鼠白细胞介素-17F/His融合蛋白的原核表达、纯化及生物活性

目的在大肠杆菌(E.coli)中表达并纯化重组小鼠白细胞介素-17F(rmIL-17F),并鉴定其生物活性。方法经RT-PCR扩增mIL-17f基因片段,定向插入原核表达载体pET28a,构建重组表达质粒pET28a/mIL-17f,转化E.coliBL21(DE3),经IPTG诱导表达,Ni2+-NTA亲和层析纯化rmIL-17F/His融合蛋白,Western blot鉴定其反应原性。以纯化复性的rmIL-17F滴鼻干预小鼠,采用实时荧光定量PCR法检测小鼠肺组织IL-6 mRNA的表达,ELISA法检测小鼠外周血IL-17F、IL-4和IFNγ的水平。结果扩增的mIL-17f基因DNA序列与GenBank中登录的mIL-17f基因序列一致,所构建的重组表达质粒pET28a/mIL-17f构建正确;表达的重组蛋白相对分子质量约为19000,主要以包涵体形式表达,表达量约占菌体总蛋白的30%;纯化的重组蛋白纯度约为95%,具有良好的反应原性,经黏膜给药后,可促进小鼠肺组织中IL-6 mRNA的表达,并提高小鼠血清中IL-4和IFNγ的水平。结论已成功地在大肠杆菌中高效表达并纯化了具有生物学活性的rmIL-17F,为进一步研究IL-17F的功能奠定了基础。     

幽门螺杆菌粘附素基因hpaA的克隆、表达及鉴定

目的　克隆幽门螺杆菌粘附素基因hpaA ,构建其原核表达系统并鉴定融合蛋白免疫原性。方法　采用PCR技术从幽门螺杆菌总DNA中扩增hpaA基因 ,T -A克隆后测定核苷酸序列 ,构建pET30a的HpaA表达载体 ,在E .coliBL2 1DE3宿主菌中用IPTG诱导表达 ,Ni2 + 柱纯化后经Westernblot鉴定其免疫原性。结果　所克隆的hpaA基因与报道的相应核苷酸序列同源性为 94 . 8%～ 97. 3% ,氨基酸序列同源性为 94 . 6 %～ 97 .7% ,在 134～ 139位存在一段KRTIQK结构 ,HpaA融合蛋白在pET30a载体中可高效表达 ,经纯化后可获得高纯度的重组蛋白。结论　成功构建HpaA原核表达系统 ,所表达的融合蛋白具有较好的免疫原性 ,可作为Hp疫苗的候选抗原。     

乙型肝炎病毒P蛋白在大肠杆菌中的分段表达及纯化

目的构建乙型肝炎病毒(HBV)P基因分段重组原核表达质粒,并进行目的蛋白的表达和纯化。方法PCR扩增HBVP基因的不同片段(1～534、1008～2040和2043～2526bp),分别经双酶切后克隆至原核表达载体pET-28a中,构建重组原核表达质粒,转化E.coliBL21(DE3),IPTG诱导表达,并对表达产物进行可溶性分析。用Ni2+-NTA凝胶亲和层析柱纯化融合蛋白,并进行Westernblot分析。结果重组原核表达质粒经酶切及测序证明构建正确。表达的融合蛋白主要以包涵体形式存在,表达量分别约占菌体总蛋白的34%、40%和36%。经Ni2+-NTA纯化的目的蛋白纯度达90%以上,且具有良好的反应原性。结论已成功构建了HBVP基因分段重组原核表达质粒,并在大肠杆菌中高效表达了重组蛋白,为研究HBVP蛋白的功能及病毒复制机制奠定了基础。     

绿色微囊藻抗HIV凝集素MVL蛋白的原核表达及纯化

目的原核表达并纯化绿色微囊藻抗HIV凝集素MVL蛋白,为进一步研究其生物学活性及其应用奠定基础。方法以绿色微囊藻Microcystis viridis NIES-103基因组DNA为模板,PCR扩增MVL基因阅读框序列,并克隆至pET-30b(+)载体中,构建重组表达质粒pET-30b-MVL,经PCR、测序鉴定后,转化感受态E.coliBL21(DE3),IPTG诱导表达。表达的蛋白采用Ni-NTA亲和柱层析纯化及复性。结果重组表达质粒pET-30b-MVL序列完整,插入的基因片段全长345bp,与GenBank中公布的MVL基因序列一致。重组菌的最佳诱导表达条件为:诱导起始浓度A600=0.5左右,IPTG浓度0.5mmol/L,诱导温度37℃,诱导时间4h,诱导培养基采用LB。以此条件诱导,在相对分子质量约20000处可见目的蛋白表达条带,表达量可占菌体总蛋白的47%,且表达蛋白主要以可溶性形式存在。纯化的重组蛋白纯度达95%以上,质谱鉴定为甘露糖结合凝集素。结论已成功地原核表达并纯化了绿色微囊藻抗HIV凝集素MVL蛋白。