γ-聚谷氨酸生产菌种的ARTP诱变及其发酵条件优化

γ-聚谷氨酸是一种由生物所合成的氨基酸聚合物,具有极强的水溶性,生物相容性,能被广泛的运用到食品、医药、日化、环保、农业等行诸多领域,具有巨大的市场前景。本实验以实验室保藏的一株产γ-聚谷氨酸(γ-PGA)地衣芽孢杆菌Bacillus licheniformis QY-27为出发菌株,通过常压室温等离子体(ARTP)诱变,筛选获得一株遗传性能稳定的高产γ-聚谷氨酸突变菌株Bacillus licheniformis QS-21,该突变菌株γ-聚谷氨酸的产量较出发菌株的9.12g/L,提高了42.26%,达到15.89g/L。对筛选获得的变异株发酵条件优化结果显示,L-谷氨酸20g/L,甘油100g/L,Mg SO4·7H2O0.5g/L为变异株合适发酵培养基,在37℃,摇瓶转数230r/min,发酵培养72h,γ-聚谷氨酸的产量达22.56g/L,比优化前提高了29.56%。     

D-核糖高产菌株的选育及其生产性试验

BacillussubtilisJSIM 10 18菌株是 1株产D 核糖的莽草酸营养缺陷型突变株 ,以此菌株为出发菌株 ,通过甲基磺酸乙酯和紫外线连续、间断诱变处理 ,获得了 1株次黄嘌呤、莽草酸双重缺陷型突变株No .2 71菌株。该突变株摇瓶发酵的D 核糖平均产量为 10 8 1g/L ,比亲株提高了 15 8g/L。在 30 0 0 0L发酵罐中 ,连续 5罐批 ,平均产D 核糖 96 4 g/L ,最高为 98g/L ,比亲株提高了 16 2 5 g/L。     

高产γ-氨基丁酸霉菌菌株的筛选及诱变育种

以霉菌作为出发菌株,将其接入大豆-水(3:5,m/V)的发酵培养基中进行发酵,根据发酵过程中γ-氨基丁酸(GABA)产量,筛选出GABA的高产霉菌菌株,然后利用紫外线对高产菌株进行诱变处理,并通过抗性初筛获得长势较好的突变菌株,再分别利用含有质量浓度为1g/100mL L-谷氨酸的PDA综合培养基和大豆水溶液的发酵培养基进行两次筛选,得到稳定高产GABA突变菌株。结果表明,通过对产GABA霉菌菌株的筛选,得到米曲霉3.800为高产GABA霉菌,GABA产量达到0.674g/L。以米曲霉3.800作为原始菌株,对其进行紫外诱变处理,从而获得高产GABA突变菌株,结果表明,利用紫外线对米曲霉3.800进行处理的最佳照射时间为2min。在此照射时间下,通过突变菌株在含有质量浓度为1g/100mL L-谷氨酸的PDA综合培养基和大豆-水溶液的发酵培养基进行两次筛选,最终获得一株稳定的高产GABA突变菌株3.800-4,其在含有质量浓度为1g/100mL谷氨酸的PDA综合培养基中的GABA产量为4.491g/L,比原菌株的GABA产量提高了23.58%;同时其在大豆-水的发酵培养基中的GABA产量为0.874g/L,比原菌株的产量提高了29.67%。     

低能离子注入油脂高产菌株黏红酵母(Rhodotorula glutinis)的选育

本文对油脂高产菌株选育过程中的筛选方法进行研究,采用苏丹黑B染色作为定性分析、酸热耦合超声波作为定量分析高产油脂菌株的筛选方法,通过低能离子注入黏红酵母(Rhodotorula glutinis)进行诱变,筛选油脂高产菌株。结果表明:获得了一株油脂高产菌株D30,产量比出发菌株提高33.05%,传代试验表明了D30的遗传稳定性良好,当发酵96 h,其油脂产量达3.10 g/L。另外,对D30发酵动力学进行了研究,当发酵时间为10 d时,其生物量为47.98 g/L(菌体湿重),油脂产量达到7.81 g/L。     

高产辅酶Q10光合细菌的选育

以球形红假单胞菌1．1737^T为出发菌株,经紫外线和亚硝基胍诱变,并结合罗红霉素抗性和耐前体性物质-对羟基苯甲酸抗性突变株的筛选,获得1株辅酶Q10高产菌株PHB^r-2,该菌株经发酵108h的生物量为15．7g／L,辅酶Q10产量达到50．6mg／L,比原始菌株在同样条件下产量提高了90．9％。该变异株遗传性能稳定,经转接5代后其辅酶Q10产量为49．5mg／L,是1株很有前景的辅酶Q10生产菌株。     

产丁二酸杆菌诱变菌株的发酵特性及其代谢通量研究

以产丁二酸杆菌为出发菌株,利用紫外线诱变,经氟乙酸、丙烯醇两种方法筛选突变株。研究了诱变菌株发酵时不同的发酵条件对发酵产物产量的影响及代谢通量。实验表明,在CO2充足条件下,接种量为6%、摇床转速为200r/min、发酵72h时,目标产物丁二酸产量最高,达7.87g/L,而副产物的产量不高。代谢通量结果表明,原始菌株的葡萄糖利用率很低,经过诱变筛选以后,丁二酸代谢通量提高了4.1%。     

埃博霉素B高产菌株的选育及发酵工艺优化

以纤维堆囊菌(Sorangium cellulosum)So F5-76为诱变出发菌株,经紫外(UV)和亚硝基胍(NTG)复合诱变和筛选,获得一株高产突变菌株So F5-H23,其发酵产埃博霉素B的量可达79.83 mg/L,比出发菌株提高了1.27倍。通过Plackett-Burman实验和响应面分析法对纤维堆囊菌产埃博霉素B的发酵工艺进行优化。得到最佳发酵工艺为:马铃薯淀粉4.8 g/L,葡萄糖0.5 g/L,脱脂奶粉2.3 g/L,豆饼粉2 g/L,七水硫酸镁2 g/L,无水氯化钙2 g/L,EDTA-Fe3+2 m L/L,微量元素(TE)0.5 m L/L,吸附树脂2%,培养基初始p H 7.4,装液量50 m L,接种体积分数8%,温度30℃。在此最优条件下埃博霉素B产量为108.67 mg/L,比优化前提高了36.13%,此产量是国内外报道的埃博霉素最高产量。     

利用重组大肠杆菌发酵甘油合成L-丙氨酸

本文探究以甘油为唯一碳源发酵合成L-丙氨酸的可行性。以删除了乙酸、甲酸、乙醇、琥珀酸、乳酸代谢产物合成途径的Escherichia coli B0016-050为出发菌株,用λpL启动子及其调控下的嗜热脂肪芽孢杆菌(Geobacillus stearothermophilus)来源的丙氨酸脱氢酶基因(ala D)替换B0016-050菌株染色体上丙氨酸消旋酶基因(dad X),获得温度控制型L-丙氨酸合成菌株B0016-060BC。菌株B0016-060BC以甘油为唯一碳源进行两阶段发酵(包括菌体生长阶段和L-丙氨酸合成阶段),表明在菌体生长至对数后期起始L-丙氨酸合成或者提高L-丙氨酸发酵阶段的通气量可提高L-丙氨酸合成水平。进一步经5 L发酵罐发酵,可合成63.64 g/L L-丙氨酸,整个发酵阶段体积生产强度达到1.91 g/L h、转化率达到62.89 g/100 g甘油,仅合成少量的乙酸(1.73 g/L)等副产物。实现了以甘油为唯一碳源高效合成L-丙氨酸,为工业应用提供了重要参考。     

利用重组大肠杆菌发酵甘油合成L-丙氨酸

本文探究以甘油为唯一碳源发酵合成L-丙氨酸的可行性。以删除了乙酸、甲酸、乙醇、琥珀酸、乳酸代谢产物合成途径的Escherichia coli B0016-050为出发菌株,用λpL启动子及其调控下的嗜热脂肪芽孢杆菌(Geobacillus stearothermophilus)来源的丙氨酸脱氢酶基因(ala D)替换B0016-050菌株染色体上丙氨酸消旋酶基因(dad X),获得温度控制型L-丙氨酸合成菌株B0016-060BC。菌株B0016-060BC以甘油为唯一碳源进行两阶段发酵(包括菌体生长阶段和L-丙氨酸合成阶段),表明在菌体生长至对数后期起始L-丙氨酸合成或者提高L-丙氨酸发酵阶段的通气量可提高L-丙氨酸合成水平。进一步经5 L发酵罐发酵,可合成63.64 g/L L-丙氨酸,整个发酵阶段体积生产强度达到1.91 g/(L·h)、转化率达到62.89 g/100 g甘油,仅合成少量的乙酸(1.73 g/L)等副产物。实现了以甘油为唯一碳源高效合成L-丙氨酸,为工业应用提供了重要参考。     

响应面法优化木醋杆菌发酵酿酒丢糟水解液产细菌纤维素培养基及其产物性能

为提高木醋杆菌（Acetobacter xylinum）发酵酿酒丢糟水解液生产细菌纤维素（bacterial cellulose,BC）的产量,采用响应面法对发酵培养基进行了优化,同时比较了发酵产物BC的性能和结构。通过单因素及响应面试验结果确定木醋杆菌发酵酿酒丢糟水解液生产BC的最佳培养基配方为：蔗糖39.33 g、蛋白胨20.01 g、MgSO4 0.91 g、柠檬酸钠3.45 g、黄嘌呤1.02 g、乙醇10 mL、酒糟水解液1 000 mL、pH 6.0。在此条件下BC的产量为6.27 g/L,较优化前（4.4 g/L）提高了42.5%。利用傅里叶红外光谱、X射线衍射、扫描电子显微镜对发酵产物BC的性能和结构进行了比较,结果表明,酒糟水解液发酵产物BC结构性能与基本培养基发酵产物BC的基本一致,说明酒糟水解液能够替代部分发酵原料发酵生产BC,且不影响BC性能。     

紫外和He-Ne 激光复合诱变获得高产γ - 聚谷氨酸产生菌的研究

以地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)BCPG006为出发菌株,通过紫外线和He-Ne激光复合诱变处理,后将诱变菌悬液涂布到抗性平板,选育出一株高产γ-聚谷氨酸的突变株BCPG078,经过摇瓶发酵,培养温度37℃、初始pH7、摇床转速220r/min、培养周期72h,测得γ-聚谷氨酸的产量为16g/L,为出发菌γ-聚谷氨酸的产量(6g/L)的2.67倍。传代实验证明,该突变株遗传性能稳定。说明紫外线和He-Ne激光复合诱变是γ-聚谷氨酸产生菌地衣芽孢杆菌有效的选育方法。     

紫外-硫酸二乙酯复合诱变高通量筛选虫草素高产蛹虫草突变株

为了进一步提高虫草素的产量,本研究以蛹虫草(Cordyceps militaris)CICC 14014菌株为出发菌株,利用紫外-硫酸二乙酯(UV-DES)进行原生质体复合诱变,结合96孔板高通量筛选方法筛选虫草素高产且性状稳定的菌株。通过96孔板初筛获得54株虫草素产量大于6 g/L的突变株;再经三角瓶复筛,最终筛选出了一株虫草素高产突变菌株UD10-2,在液体表面培养条件下虫草素产量达到11.32 g/L,比发菌株CICC 14014(产量为5.43 g/L)提高了108.47%,经过20次传代后性状稳定。     

常压室温等离子体诱变与微生物微液滴培养选育谷胱甘肽高产菌株

为提升野生毕赤酵母菌株BY-1产谷胱甘肽的能力,通过常压室温等离子体（atmospheric and room temperatureplasma,ARTP）诱变技术得到诱变菌株BY-1-26。进一步在摇瓶培养过程中添加1,2,4-三氮唑,提高诱变菌株产量。最后将1,2,4-三氮唑作为筛选因子,利用微生物微液滴培养（microbial microdroplet culture system,MMC）仪对诱变菌株进行适应性进化,获得了1株高产谷胱甘肽的突变株BY-2-24,并对其遗传稳定性进行研究。结果表明：出发菌株BY-1经过ARTP诱变处理、抗性梯度平板初筛、MMC适应性进化、摇瓶复筛等,可以选育高产谷胱甘肽突变株。突变株BY-2-24摇瓶产量达（312.13±2.62）mg/L,较出发菌株提高134.26%,且经过7次传代培养,仍然具有较好的遗传稳定性。同时,生物量提高118.33%,表明诱变菌株的生长能力得到提高。研究表明,ARTP与MMC联合应用作为一种简便高效的微生物诱变方式,可用于定向诱变筛选高性能微生物菌株,为高通量选育目标菌株提供了参考。     

蛹虫草高产胞外虫草素和虫草多糖的诱变育种

通过诱变获得高产胞外虫草素和虫草多糖的蛹虫草菌株.采用紫外线诱变(UV)、化学诱变(LiCl)、复合诱变(UV-LiCl) 3种方式对蛹虫草孢子进行诱变;发酵检测存活菌株的胞外虫草素和虫草多糖的含量.结果:以胞外虫草素为指标,3种诱变方式的最大正突变率分别为化学突变(29.2％)＞紫外突变(28.6％)＞复合诱变(26.5％);以胞外多糖为指标,最大正突变率分别为紫外诱变(35.7％)＞复合诱变(33.3％)＞化学诱变(27.0％).紫外诱变突变株Z-5-1胞外虫草素产量达0.842g/L,比出发菌株高311％;紫外诱变突变株Z-4-7胞外虫草多糖产量达5.250g/L,比出发菌株高148％.在连续培养5代后,仍具有较好的遗传稳定性.紫外诱变能获得较高的蛹虫草正突变率,同时能获得高产虫草素、虫草多糖的突变株.     

一株低产高级醇桑椹果酒酵母的分离、鉴定

以桑椹为分离源,从其自然发酵醪液中分离得到35株酵母菌,采用杜氏小管发酵法初筛,产乙醇能力复筛,耐乙醇和SO₂能力三级筛选,再与葡萄酒活性干酵母的发酵性能和高级醇产生量进行比较,得到1株发酵性能优良且高级醇产生量低的桑椹果酒酵母—S-2。对S-2菌种进行的研究表明,该菌在12 h开始产气,48 h后产生的气体充满杜氏小管,在14%乙醇和120 mg/L SO₂的胁迫下仍有较好的发酵表现,该菌在正常情况下发酵产生的乙醇含量高达10.56%,且高级醇产生量为312.41 mg/L。采用18S rDNA对其进行序列鉴定,确定其与酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)同源性最高,相似度达到100%。该菌完全可以取代葡萄酒酵母专门用于桑椹果酒的发酵。     

常压室温等离子体诱变选育高产四甲基吡嗪地衣芽孢杆菌

地衣芽孢杆菌（Bacillus lincheniformis）可以利用葡萄发酵产生四甲基吡嗪,四甲基吡嗪广泛应用于食品、临床和其他领域。该文以地衣芽孢杆菌BL1为出发菌株,采用常压室温等离子体诱变系统进行诱变,根据脱脂奶粉平板初筛、摇瓶发酵复筛,连续传代培养后得到遗传稳定的四甲基吡嗪产量较高的突变株BT12,该菌株摇瓶发酵生产四甲基吡嗪的最大产量为43.16 g/L,相比出发菌株的37.89 g/L的提高了13.91%。     

红曲霉的初筛及在黄酒酿造中的应用

在酿酒微生物的构建研究中,对中温大曲中的红曲霉进行初步筛选,经形态观察,确定3株红曲霉分别为Q1、Q2及Q3,用3株红曲霉分别培养红曲米。其中,红曲霉Q3产生的糖化力及红曲色素的含量较高,分别为1123.4 U/g和1227.6 U/g。将3株红曲霉分别应用到黄酒的发酵中,结果发现,红曲霉Q3发酵后剩余总糖的含量明显低于另外两株红曲霉,且酒精含量可多产1%,高级醇的生成量也明显减少,同时可生成较多的乳酸乙酯及高于另外两株红曲霉2倍的乙酸乙酯。     

高通量筛选葡萄糖酸钙高产菌株

以黑曲霉为研究对象,建立了高通量筛选葡萄糖酸钙高产菌株流程。结果表明:紫外线-LiCl复合诱变处理的黑曲霉孢子悬浮液,高通量筛选得到4株高产菌株,传代后发酵性能稳定。菌株P-9,其发酵液葡萄糖酸钙含量达到23.04 g/100 mL,比原始菌种高5.86 g/100 mL。相较于传统摇瓶发酵筛选工作量大,周期长,该方法显著提高了筛选效率。     

高产油脂红酵母的选育及培养条件优化

以本实验室早期从自然界中分离纯化所得18株高产类胡萝卜素红酵母菌株为材料,采用苏丹黑染色法初筛、摇瓶法复筛,得到1株脂含量相对较高(14.63%)的菌株SCAU-13;经鉴定,该菌株为禾本红酵母(Rhodotorula graminis);以SCAU-13为出发菌株,经紫外诱变、硫酸二乙酯诱变和紫外-硫酸二乙酯复合诱变,最终得到突变菌株M124,其脂含量达42.42%,为出发菌株的2.90倍;培养条件优化结果表明其最佳产脂条件为：以葡萄糖为碳源,(NH4)2SO4为氮源,碳氮比为60:1,起始pH6.0,蛋白胨1.8g/L,酵母粉4g/L,MgSO4 ·7H2O 0.5g/L,在此条件下,菌体生物量为(13.55±0.10)g/L,脂含量为(53.67±0.17)%,产脂量为(7.27±0.03)g/L。     

雄烯二酮耐底物突变株的筛选及生物转化培养基优化

采用紫外、硫酸二乙酯复合诱变的方法对能选择性降解植物甾醇侧链的新金分支杆菌MN2进行诱变处理,利用梯度平板技术筛选高底物耐受性突变株,通过摇瓶发酵实验检测其转化性能,以期筛选出具有较高底物耐受性且转化生成雄烯二酮（androst-4-ene-3,17-dione,AD）能力提高的突变株。最终筛选到1 株能在含高浓度底物平板上生长的AD突变株MN4。在底物甾醇投料量为20 g/L,摇瓶发酵144 h时AD生成率为40.9%,较出发菌株提高了15.1%。经斜面接种连续传代5 次,MN4突变株遗传性状稳定。对突变株MN4的发酵培养基进行优化,通过正交试验确定的最佳培养基配比为：葡萄糖1 g/L,玉米浆25 g/L,磷酸二氢钠0.6 g/L,硝酸钠6.2 g/L,豆油160 g/L。根据该配方进行转化,得到AD的生成率为50.6%。