婴幼儿食品和配方奶粉中克罗诺杆菌污染调查及分子分型研究

目的了解温州市市售婴幼儿食品和配方奶粉中克罗诺杆菌污染情况及分子分型特征,分析不同菌株间亲缘相关性。方法参照GB 4789.40—2010《食品安全国家标准食品微生物学检验阪崎肠杆菌检验》方法在食品中分离鉴定克罗诺杆菌。采用脉冲场凝胶电泳(PFGE)和多位点序列分型(MLST)方法对克罗诺杆菌进行分型研究。结果 2013—2017年共采集737份婴幼儿食品和配方奶粉,克罗诺杆菌总检出率为6.1%(45/737)。其中婴幼儿谷类辅助食品检出率最高(23.4%,37/158)。45株克罗诺杆菌属于阪崎克罗诺杆菌(C.sakazakii)、丙二酸盐克罗诺杆菌(C.malonaticus)和莫金斯克罗诺杆菌(C.muytjensii)。其中阪崎克罗诺杆菌最多(73.3%,33/45),其次为丙二酸盐克罗诺杆菌(24.4%,11/45)。MLST共分为25个ST型,其中ST64、ST1、ST40、ST4和ST7为优势型别。45株克罗诺杆菌PFGE分型得到38个带型,未发现有明显的优势分型和聚集现象。PFGE型和MLST型结果分析表明,绝大数具有相同PFGE型的菌株也有相同的MLST型,而相同MLST型却不一定具有较高的亲缘关系。结论温州市市售婴幼儿食品和配方奶粉中克罗诺杆菌的污染状况较轻,其中婴幼儿谷类辅助食品检出率最高。食品来源的克罗诺杆菌图谱具有高多态性和离散性。     

营养面条生产过程中克罗诺杆菌污染状况与溯源研究

目的调查营养面条生产加工环节中肠杆菌科和克罗诺杆菌的污染状况,对克罗诺杆菌进行溯源研究。方法采集某营养面条生产企业的生产原料、中间产品、环境、设备、人员和终产品等共101份样品,进行肠杆菌科和克罗诺杆菌检测。利用脉冲场凝胶电泳(PFGE)技术对克罗诺杆菌进行分子分型和溯源研究。结果在整个生产过程的样品中,肠杆菌科检出率为53.5%(54/101),其中环境样品的肠杆菌科检出率最高(72.7%,16/22);克罗诺杆菌检出率为29.7%(30/101),其中终产品的克罗诺杆菌检出率最高(50.0%,5/10)。31株克罗诺杆菌分离株共获得20个PFGE带型,多样性较高,经聚类分析可划分为6个簇型。结论营养面条生产加工环节中存在克罗诺杆菌的污染状况,该致病菌污染可能与原料污染有关。克罗诺杆菌的污染问题需要引起食品安全管理部门重视,加强生产加工过程监测,制定有效措施予以控制。     

婴儿配方乳粉中克罗诺杆菌的分离鉴定及分型

采集了市场中的220份婴儿配方乳粉,利用生理生化和分子鉴定的方法对采集样品中的克罗诺杆菌进行了分离鉴定,检出10株克罗诺杆菌,污染率为4.55%。利用16S r RNA和omp A基因对克罗诺杆菌进行分型分析,都将10株克罗诺杆菌分为了2个簇,但是不同分型方法各个簇中的菌株不同。结果表明16S r RNA和omp A基因可以用于克罗诺杆菌的分型,但是辨识度不高。     

即食食品中阪崎克罗诺杆菌的分离鉴定及分子分型

为了解即食食品中污染阪崎克罗诺杆菌的流行情况,分析我国阪崎克罗诺杆菌主要流行菌株,对即食食品中分离的10株阪崎克罗诺杆菌进行基质辅助激光解析/电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)、VITEK 2、16s rDNA鉴定,采用多位点序列分型(MLST)方法对分离菌株进行分型,并对PubMLST数据库中322株中国分...     

粮食加工品和肉制品中克罗诺杆菌的污染状况及致病性阪崎克罗诺杆菌生物膜形成能力研究

目的 克罗诺杆菌是重要的常见食源性致病菌,了解我国粮食加工品和肉制品中克罗诺杆菌的污染情况及致病性,为食品中该菌的防控提供理论依据。方法 本研究对黑龙江、北京、河北等八个省份的226份食品样品的克罗诺杆菌污染情况进行检测分离,对分离菌株基于重组和修复蛋白(recombination and repair protein gene, recN)基因序列进行种间鉴定,并针对阪崎克罗诺杆菌应用脉冲场凝胶电泳(Pulsed Field Gel Electrophoresis,PFGE)进行分子分型以及对生物膜形成能力进行研究。结果 所有样品中克罗诺杆菌的检出率为18.58%,其中146份粮食加工品中32份检出克罗诺杆菌(检出率21.2%),80份肉制品中有10份检出克罗诺杆菌(检出率12.5%)。种间鉴定显示,94株为阪崎克罗诺杆菌,6株为丙二酸盐克罗诺杆菌,3株为都柏林克罗诺杆菌,3株为尤尼沃斯克罗诺杆菌,9株为苏黎世克罗诺杆菌。PFGE分型结果表明,94株阪崎克罗诺杆菌可被分为49个型别。结晶紫染色实验结果表明所有阪崎克罗诺杆菌均在36 h~60 h时间范围内达到最大菌膜生产量。结论 上述八个省份粮食加工品和肉制品中存在克罗诺杆菌的污染,其中阪崎克罗诺杆菌有多种PFGE带型,且均具有生物膜形成能力,为食品安全风险评估及标准制定提供基础数据,对公众卫生和健康具有重要意义。     

阪崎克罗诺杆菌分离菌株的核糖体分型研究

利用Riboprinter对分离到的15株阪崎克罗诺杆菌进行了鉴定及核糖体分型,并利用Bio Numeicrus软件对其结果进行分析,如果按照相似性大于80%计算,根据辛普森方程计算该分型方法的分辨率可达到0.808。结果表明,核糖体分型(ribotyping)是一种适用于阪崎克罗诺杆菌的快速分子分型方法,可将不通来源的阪崎克罗诺杆菌分离菌株区别开来,能够对由该菌引起的食品中毒事件能够进行快速的溯源。     

PFGE与16S rDNA对阪崎克罗诺杆菌分型的研究

研究脉冲场凝胶电泳(PFGE)与16S rDNA序列分析在阪崎克罗诺杆菌分型中的应用。对分离自不同来源的10株阪崎克罗诺杆菌进行16S rDNA序列扩增及测序,并构建系统发育树进行聚类分析。再利用限制性内切酶Xba I对这10株菌酶切后,进行PFGE电泳分型。16S rDNA序列分析显示,所有分离菌株与ATCC标准菌株在同一系统发育分支下,其序列相似性达到98.37%,并且不能进一步分型。而PFGE分型结果显示,10株分离菌株和2株标准菌株共分成11种PFGE基因型,说明PFGE的分型能力明显优于16S rDNA序列分析,部分菌株的基因型与分离来源具有一定的相关性,所以PFGE分型方法可用于阪崎克罗诺杆菌分子分型及溯源的研究。     

多点位分型技术在婴幼儿配方乳粉中克罗诺杆菌的鉴定与溯源中的应用

克罗诺杆菌属是肠杆菌的独立新属,即阪崎肠杆菌属。传统的分子分型方法如随机扩增多态性DNA标记(RAPD)不能将克罗诺杆菌鉴定到种,且辨识度较低、重复性不高、容易混淆,而近几年发展较快且更高效快捷的分型方法多位点序列分型(MLST),能清晰地分辨出克罗诺杆菌每个基因的差别。对婴儿配方乳粉工厂的克罗诺杆菌属进行分子分型研究,并对克罗诺杆菌属的鉴定和溯源,在婴幼儿配方乳粉企业在克罗诺杆菌属在监控、预警、控制方面具有重要意义。选取具有代表性的婴儿配方乳粉中分离菌株24株,经API20E试剂条鉴定为克罗诺杆菌属,再经过MLST分型找出其中有22株有克罗诺杆菌ST分型,其中19株属于C.sakazakii,2株属于C.turicensis,1株属于C.dublinensis。通过构建进化树能清楚地识别进化关系和亲缘关系,能够很好地定种和追根溯源。     

婴幼儿食品源阪崎克罗诺杆菌的3种分型方法

阪崎克罗诺杆菌污染婴幼儿食品可能导致新生儿和婴幼儿脑膜炎、败血症和坏死性小肠结肠炎,对其健康造成严重威胁。采用脉冲场凝胶电泳(PFGE)、多位点序列分型(MLST)和肠杆菌间保守重复序列PCR(ERIC-PCR)对分离于婴幼儿配方乳粉、米粉和辅食中的阪崎克罗诺杆菌进行分子分型,计算3种分型方法的辛普森多样性指数(DI)值,评价3种方法的分型效率,以便精确和快速开展阪崎克罗诺杆菌流行病学研究。PFGE、MLST和ERIC-PCR可分别将37株阪崎克罗诺杆菌分为35个PFGE基因型、28个ERIC-PCR型和23个序列(ST)型,分型结果的DI值分别为99.55%,96.40%和98.05%。3种方法对阪崎克罗诺杆菌均具有较高的分型能力,其中PFEG分型能力最高,分型效率最佳。     

阪崎克罗诺杆菌的16S rDNA鉴定分型

阪崎克罗诺杆菌(Cronobacter sakazakii)是一种重要的食源性条件致病菌,易引发新生儿、早产儿、低体重新生儿和免疫力低下的婴幼儿产生严重的脑膜炎、菌血症和坏死性小肠结肠炎。本研究以分离自不同来源、通过生化鉴定的37株阪崎克罗诺杆菌作为研究对象,利用16S rDNA基因测序的方法对阪崎克罗诺杆菌进行鉴定和分型。结果表明:ES4并非为阪崎克罗诺杆菌,说明采用16S rDNA基因测序进行阪崎克罗诺杆菌的鉴定更为可靠;通过构建系统发育树分析,分离菌株位于同一系统发育分支;根据序列同源性比对,可将这一分支下的所有菌株分成7个子群,这表明16S rDNA基因测序可以对阪崎克罗诺杆菌进行分型,进一步揭示其系统发育关系。     

市售婴幼儿米粉中克罗诺杆菌的分子分型和耐药分析

为了解婴幼儿配方米粉中克罗诺杆菌的污染情况、分子分型特征及耐药性情况,采集广西区内市售6个厂家和品牌不同配方的婴幼儿米粉进行克罗诺杆菌分离及fusA基因的扩增、测序和MLST数据库比对分析。并应用脉冲场凝胶电泳（PFGE）对菌株进行分型鉴定及微量肉汤稀释法测定分离株对8种常见抗生素的最小抑菌浓度（Minimal Inhibitory Concentrations,MICs）。采集的268份婴幼儿米粉共分离到32株克罗诺杆菌,检出率为11.94%,菌株鉴定结果显示32株分离株包括22株C.sakazakii、6株C.malonaticus、3株C.dublinensis和1株C.muytjensii。不同添加成分的婴幼儿配方米粉污染情况差异明显,其中添加淮莲和果蔬的米粉污染率最高为17.78%和15.38%。PFGE分析显示32个菌株共分成32种不同的分子型,相似度为61.20%~92.30%,所有分离株对环丙沙星、庆大霉素和头孢噻肟都敏感,部分菌株（6.25%~43.75%）对氯霉素、四环素、甲氧苄啶/磺胺甲基异恶唑、头孢西丁和萘啶酸表现为中等敏感,有2个菌株对氯霉素表现为抗性。结果表明市售婴幼儿配方米粉中存在一定的克罗诺杆菌污染,尤其是添加营养成分的米粉。婴幼儿配方米粉中克罗诺杆菌污染来源广泛,部分菌株对一些抗菌药表现为中等敏感甚至是抗性,提示克罗诺杆菌对抗菌药的敏感性呈现减弱的趋势。     

阪崎克罗诺杆菌鉴定分型方法的比较及耐药特征分析

目的 开展乳粉原料中分离的阪崎克罗诺杆菌(Cronobacter sakazakii, C. sakazakii)鉴定分型比较研究及抗生素耐药基因特征分析。方法 采用形态学观察、生理生化特征分析、基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱法、16S rDNA测序分析,和基于全基因组测序技术的平均核苷酸一致性分析、多位点序列分型和基于全基因组的多位点序列分型技术,建立了对分离的2株C. sakazakii的鉴定分型方法,并对不同的方法进行比较,同时预测O-血清型和抗生素抗性基因。结果 本研究中分离菌株16-26、31-3经形态学、生理生化反应、16S rDNA、质谱和平均核苷酸一致性分析,均鉴定为C. sakazakii,可信度均在95%以上; MLST预测16-26为ST新型、31-3为ST4型, O血清型均为gnd 3型、galF 2型,均含有9种抗性基因, 2株C. sakazakii分离株的抗性基因呈现出多样性。结论 通过对分离的C. sakazakii进行鉴定分型比较研究,建立了一种基于表型和分子分型的食源性致病菌鉴定分型方法,为食源性致病菌的有效防控提供了有力的技术支撑和监管依据。     

克罗诺杆菌分型技术研究进展

克罗诺杆菌原名阪崎肠杆菌,是婴儿配方乳粉中主要的致病菌之一,能感染新生儿,并导致严重的坏死性小肠结肠炎、菌血症和脑膜炎等疾病,致死率高达40%~80%。本文综述了克罗诺杆菌常见的表型分型和分子分型方法,包括生化分型、基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱分型、血清型分型、脉冲场凝胶电泳分型、多位点序列分型、随机多态性扩增DNA基因分型、核糖体分型、特殊基因分型和全基因组分型,以期增加人们对克罗诺杆菌分型方法的认识,为全面揭示克罗诺杆菌的表型特征和遗传多样性提供方法和依据。     

食品中克罗诺杆菌分离菌株生物被膜形成、耐药性及毒力基因检测

研究食品中克罗诺杆菌分离菌株的生物被膜形成、耐药性以及携带毒力基因情况。在成都市周边农贸市场和路边小摊采集食品样品129份,采用DFI 阪崎肠杆菌显色培养基分离克罗诺杆菌;通过16S rRNA序列比对分析鉴定分离菌株;采用试管法和微孔板法分析菌株生物被膜形成能力,同时研究温度对细菌成膜能力影响;采用纸片法检测分离菌株对18种抗生素的耐药性;采用PCR方法检测分离菌株携带cpa、hly、sip 和ompX毒力基因情况。结果发现从129份食品样本中共检出克罗诺杆菌43株,检出率为33.3%。43株克罗诺杆菌食品分离菌株的成膜率为90.7%,并且温度对细菌成膜影响明显。四种毒力基因中,ompX检出率为100%;cpa检出率为13.9%;hly检出率为11.6%;sip基因未检出。耐药表型检测发现43株克罗诺杆菌食品分离菌株对青霉素、克林霉素、万古霉素、苯唑西林和杆菌肽B的耐药率为100%,对利福平的耐药率达97.7%;对红霉素的耐药率为7%;对环丙沙星、庆大霉素、四环素、氯霉素、亚胺培南、磺胺甲恶挫、呋喃妥因、头孢西丁、链霉素、阿米卡星、氧氟沙星等100%敏感。本研究表明克罗诺杆菌食品分离菌株具有较好的形成生物被膜能力,对常见的抗生素耐药率较高,并且分离菌株携带一定的毒力基因,对食品安全造成潜在威胁。     

Effect of vanillin, ethyl vanillin, and vanillic acid on the growth and heat resistance of Cronobacter species

Preservatives could be part of an effective intervention strategy for the control of Cronobacter species in foods, but few compounds with the desired antimicrobial properties have been identified to date. We examined the antibacterial activity of vanillin, ethyl vanillin, and vanillic acid against seven Cronobacter spp. in quarter-strength tryptic soy broth with 5 g/liter yeast extract (TSBYE) adjusted to pH 5.0, 6.0, and 7.0 at 10, 21, and 37°C. All compounds exhibited pH- and temperature-dependant bacteriostatic and bactericidal activity. MICs of vanillin and ethyl vanillin consistently increased with decreasing pH and temperature, but vanillic acid had little activity at pH values of 6.0 and 7.0. The MICs for all temperatures, pH values, and bacterial strains tested were 2 mg/ml ethyl vanillin, 3 mg/ml vanillin, and >8 mg/ml vanillic acid. MBCs also were influenced by pH, although significantly higher concentrations were needed to inactivate the bacteria at 21°C than at 10 or 37°C. Survivor curves for Cronobacter sakazakii strains at the MBCs of each compound revealed that all treatments resulted in immediate loss of cell viability at 37°C. Measurements of propidium iodide uptake indicated that the cell membranes were damaged by exposure to all three compounds. The thermal resistance of C. sakazakii was examined at 58°C in TSBYE supplemented with MBCs of each compound at pH 5.0 and 6.0. D-values at pH 5.0 were reduced from 14.56 ± 0.60 min to 0.93 ± 0.01, 0.63 ± 0.01, and 0.98 ± 0.02 min for vanillin, ethyl vanillin, and vanillic acid, respectively. These results suggest that vanillin, ethyl vanillin, and vanillic acid may be useful for the control of Cronobacter spp. in food during preparation and storage.     

基于全基因组测序的阪崎克罗诺杆菌婴幼儿食品分离株分子特征研究

目的 研究婴幼儿食品中分离的阪崎克罗诺杆菌(C.sakazakii)分子生物学特征。方法 对婴幼儿食品中C.sakazakii进行分离鉴定、药物敏感性试验和全基因组测序,利用BioNumerics软件对全基因组数据进行拼接组装,对组装基因组开展多位点序列分型(MLST)、核心基因组多位点序列分型(cgMLST)、毒力基因和耐药基因分析,并与PubMLST数据库中ST型进行比较分析。结果 本研究中分离的9株C.sakazakii共分为5个ST型,ST1和ST64型为主要型别,同时也是PubMLST数据库中C.sakazakii的主要型别。3株C.sakazakii携带mcr-9耐药基因,但药敏结果显示所有菌株对包括多粘菌素B和多粘菌素E在内的12种抗生素均敏感。除携带共同毒力基因谱外,ST1、ST64和ST458型携带脂多糖基因gtrB。cgMLST聚类分析显示,9株C.sakazakii呈高度多样性。结论 与临床分离株相关的ST1和ST64型是本研究食品分离株中的主要型别,提示C.sakazakii具有潜在的致病性,有必要对婴幼儿食品中C.sakazakii开展连续监测,为预防控制由其引起的食源性疾病提供依据。     

进口乳制品中克罗诺阪崎肠杆菌分离株耐药性研究

目的 对进口乳制品中克罗诺阪崎肠杆菌分离株的耐药性进行研究.方法 采用纸片扩散法对99株克罗诺阪崎肠杆菌分离株和1株标准菌株进行药敏性试验,共选择7大类20种抗生素.结果 所测试的100株菌株对美洛西林、亚胺培南、美罗培南、庆大霉素、阿米卡星、卡那霉素、妥布霉素、氯霉素、头孢吡肟、头孢哌酮、头孢噻肟、头孢他啶、环丙沙星和诺氟沙星敏感;对苯唑西林产生耐药;对头孢噻吩、氨苄西林、头孢唑啉、和四环素具有不同程度的耐药性,耐药率分别为65.0％、17.0％、3.0％和2.0％;对头孢唑啉、头孢噻吩、氨苄西林、头孢曲松和四环素中介率分别为25.0％、23.0％、6.0％、2.0％和1.0％;13株对3种抗生素耐药,4株表现多重耐药性.结论 进口乳制品中克罗诺阪崎肠杆菌分离株对所测试的大多数抗生素敏感,但对苯唑西林全部耐药,对部分抗生素出现较高的耐药和多重耐药性,因此克罗诺阪崎肠杆菌的耐药性应引起广泛的社会关注.     

克罗诺杆菌环境耐受性的评价

婴儿配方奶粉(powdered infant formulas,PIF)是克罗诺杆菌(Cronobacter spp.)的主要污染来源,其原辅料的添加和加工环境是最为主要的传播途径。为彻底有效地对克罗诺杆菌进行预防和控制,保障乳制品的安全,本实验以8株分离自PIF及其加工环境中的克罗诺杆菌为研究对象,对其耐热性、耐酸碱性、耐干燥性及耐高渗性进行研究,分析不同菌株环境耐受性之间的差异。结果表明：8株克罗诺杆菌对热的耐受性存在差异性,其中分离自终产品的菌株耐热性相对较强;克罗诺杆菌普遍具有耐酸不耐碱的特性,在pH为1.5的酸性条件下,所有菌株在处理30 s后仍可存活;克罗诺杆菌具有较强的抗干燥能力,在室温条件下,空气相对湿度为20.7%的条件下,所有菌株在7个月的试验过程中菌数均从初始浓度10⁸ CFU/mL下降到10⁵ CFU/mL,这种缓慢的下降趋势说明克罗诺杆菌具有很强的抵抗干燥环境的能力;克罗诺杆菌具有较强的耐高渗性,当NaCl的浓度大于8%时,所有菌株生长缓慢,且在等渗条件下,克罗诺杆菌对山梨醇的耐受性强于NaCl。