冷藏南美白对虾丝氨酸蛋白酶活力与黑变相关性研究

为探明冷藏对虾黑变规律,研究了南美白对虾在为期10 d的冷藏过程中黑变与丝氨酸蛋白酶(serine protease,SP)的活性变化及其相关性。结果表明,南美白对虾感官黑变呈现出先慢后快的特征,前2 d基本无变化,第3 d时变化开始加快,第5 d变化最为显著,第6至第10 d黑变速率差异不显著,第4 d是黑变防控的关键期。进一步定量分析表明对虾不同部位的黑变速率存在显著差异,冷藏至第4 d时头部、腹部和尾部间的明度L值差异开始明显,第5 d时三者之间达到显著性差异(P0.05);统计分析表明对虾冷藏过程中不同部位SP活力与黑变存在显著相关性,头部组织对对SP活力变化最为敏感,其斜率k为0.0312,明显大于尾部的0.0271和腹部的0.0128,是黑变调控的关键部位。本研究证明在冷藏南美白对虾体内也存在酚氧化酶激活系统,SP活力水平同样对酚氧化酶原的激活水平起重要调控作用,其规律和机制有待深入研究。     

滩羊肉嫩度形成中Ca2+的信号转导作用

以6月龄滩羊背最长肌为研究对象，测定4 ℃贮藏0，96，192 h时剪切力、线粒体Ca2+水平、钙蛋白酶-1及细胞凋亡效应酶-3活性。基于同位素标记相对和绝对定量技术(iTRAQ)结合多维液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)技术，研究贮藏期间Ca2+信号通路及凋亡调节信号转导通路蛋白质表达量的变化情况。结果表明:4 ℃贮藏期间，滩羊肉剪切力先降低后升高，线粒体Ca2+含量先升高后降低，钙蛋白酶-1活性持续降低，细胞凋亡效应酶-3活性先上升后下降。滩羊肉剪切力与Ca2+水平呈显著负相关，与钙蛋白酶-1活性呈极显著正相关，与细胞凋亡效应酶-3活性呈极显著负相关。蛋白质组学分析表明:Ca2+跨膜转运ATP酶利用ATP水解的能量驱动Ca2+跨膜运输，电压依赖性阴离子通道蛋白贮藏初期上调表达，为Ca2+流入线粒体提供渠道，导致线粒体Ca2+超载、线粒体功能紊乱，使线粒体复合体表达量上升。同时，VDAC异常表达促使CYTC释放至胞浆，最终激活细胞凋亡效应酶-3，水解结构蛋白质。另外，Ca2+可间接导致肌动蛋白表达量下调，引起细胞收缩，从而影响肉的嫩度。本研究结果证实Ca2+在肉品嫩度形成过程中起重要的信号转导作用。     

虾夷扇贝肌肉丝氨酸蛋白酶的研究

为了探究虾夷扇贝肌肉冷藏过程中内源蛋白酶对其质构的影响,本文对虾夷扇贝肌肉在4 ℃下冷藏7 d过程中肌肉质构及蛋白变化进行测定,结果表明,整个冷藏过程中扇贝肌肉硬度、弹性、咀嚼性和粘性整体呈下降趋势。SDS-PAGE分析显示肌肉蛋白在第3 d开始出现明显降解。在内源酶活力方面,丝氨酸蛋白酶（Serine proteinase,SP）活力在冷藏2 d后开始急剧下降。通过硫酸铵盐析、离子交换、凝胶过滤和疏水柱层析等从虾夷扇贝肌肉中获得高度纯化的丝氨酸蛋白酶并对其酶学性质进行研究。SDS-PAGE和明胶酶谱结果表明,SP在天然状态下主要以分子量约为52 kDa的二聚体形式存在。SP的最适pH为9.0,最适温度为37 ℃。SP特异性水解羧基侧P₁位含有精氨酸或赖氨酸残基的底物。丝氨酸蛋白酶特异性抑制剂PMSF、Leupeptin、Pefabloc SC、Benzamidine分别能抑制其97%、98%、90%和85%的酶活力;金属离子Fe2+、Zn2+、Cu2+也能明显抑制SP的酶活力。37 ℃下SP可有效降解扇贝肌原纤维蛋白,为揭示SP对扇贝肌肉蛋白的品质影响提供参考。     

凡纳滨对虾肝胰腺组织化学过程参数的优化

鉴于肝胰腺组织在凡纳滨对虾生长和免疫方面的重要生理意义,以及与对虾冷藏期间品质劣变的密切相关性,本研究通过比较不同条件下石蜡切片对凡纳滨对虾肝胰腺组织HE染色结果的影响,确定其组织化学适宜参数。凡纳滨对虾肝胰腺用Carnoy固定液在室温下固定12 h,用70%,80%,95%及无水乙醇Ⅰ各脱水30min,再继续用无水乙醇Ⅱ脱水40 min,二甲苯40 min透明2次,充分浸蜡后切片(8μm),将切片经苏木精染色40 min,盐酸乙醇分化1 s,伊红复染5 min。显微观察结果显示:细胞染色均匀,细胞核呈蓝紫色,细胞质呈紫红色,背景清晰。     

嗜热芽孢杆菌高温蛋白酶HS08的化学修饰研究

分离纯化了嗜热芽孢杆菌产生的耐高温蛋白酶HS08,以SDS-PAGE凝胶电泳和Superdax75预装柱凝胶过滤,测定蛋白酶HS08的分子质量为30.6ku,同时研究了酶专一性抑制剂对酶活性的影响。结果表明,蛋白酶HS08的活性被酶活性中心丝氨酸残基专一性抑制剂PMSF以及金属离子螯合剂EDTA强烈抑制,而NBS、WRK、TNBS、Phenylgloxalhydrate等修饰剂对酶活性无明显抑制作用。K+、Na+、Ca2+、Mg2+、Zn2+等金属离子对酶活性影响实验结果表明,Zn2+可使该酶活性明显提高,Cu2+对该酶活性有抑制作用。因此,该酶属于金属离子激活的丝氨酸族蛋白酶。蛋白酶HS08的酶动力学实验表明,以BSA为底物,PMSF可使蛋白酶HS08最大反应速率Vmax下降50%,而对其米氏常数Km影响不大。     

嗜热芽孢杆菌高温蛋白酶HS08活性中心研究

运用化学修饰方法对一株嗜热芽孢杆菌所产生的耐高温蛋白酶HS08活性中心的结构进行了研究。结果表明,蛋白酶HS08的活性被酶活性中心丝氨酸残基专一性抑制剂PMSF以及金属离子螯合剂EDTA强烈抑制,色氨酸和精氨酸对酶活性有重要作用,但并不位于酶的活性中心。Zn2+可使该酶活性明显提高,Cu2+对该酶活性有抑制作用。因此,该酶属于金属离子激活的丝氨酸族蛋白酶。     

镉对中华圆田螺抗氧化酶活性和脂质过氧化的影响

为研究水环境中重金属镉(Cadmium,Cd)对中华圆田螺(Cipangopaludina cathayensis)肝胰腺组织的抗氧化酶活性和脂质过氧化的影响,实验设置4个Cd2+染毒组(1.5、3.0、6.0和12.0 mg/L)和1个空白对照组,每组分别处理24、48、72和96 h后,测定中华圆田螺肝胰腺组织中的超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)、谷胱甘肽转移酶(GST)和过氧化氢酶(CAT)的活力及谷胱甘肽(GSH)和脂质过氧化反应终产物丙二醛(MDA)的含量。结果显示,在暴露24 h时,随着Cd2+浓度的升高,SOD、GPx、CAT、GST和GSH的变化规律相似,均先升高后下降;同一浓度Cd2+暴露后,随着暴露时间的延长,SOD、GPx、GST 和CAT的活力、GSH含量均呈先升后降的趋势。随着时间延长和浓度增加,中华圆田螺肝胰腺组织中的MDA含量呈持续升高趋势。研究表明,中华圆田螺肝胰腺组织中抗氧化酶对Cd2+的毒性反应较灵敏,抗氧化酶活性变化水平和MDA含量的变化均可作为检测中华圆田螺Cd2+污染的生物指标,同时,肝胰腺组织亦可作为检测Cd2+毒性的靶器官。     

Ca2+对菠萝蛋白酶热稳定性和二级结构的影响

研究了Ca2+对菠萝蛋白酶活性及远紫外圆二色谱的变化.在37℃下,Ca2+与酶作用1h后,5～10mmol/L Ca2+对酶的活性均有促进作用,其中当Ca2+浓度为2mmoL/L时.促进作用最明显.在60℃下,Ca2+浓度为3mmol/L时,对菠萝蛋白酶的热稳定化效果最好,处理100min后仍然能保留68%的活性;菠萝蛋白酶在60℃下活性的半衰期为86min,除Ca2+浓度为1mmoVL外,其他浓度(2、3、4、5mmol/L)的Ca2+与菠萝蛋白酶作用后,酶的半衰期均有所延长.由圆二色谱曲线发现,菠萝蛋白酶在波长209nm与221am处有明显的负峰.与Ca2+作用后菠萝蛋白酶的α-螺旋、β-转角和无规则卷曲均有所变化,其中,在37℃下加入Ca2+后,菠萝蛋白酶的α-螺旋均减少,而β-转角有所增加.在70℃下处理1h,Ca2+对菠萝蛋白酶二级结构也有所影响.无Ca2+处理的菠萝蛋白酶和加入4mmol/L Ca2+的菠萝蛋白酶的α-螺旋分别减少为34.90%和35.60%,而β-转角则有所增加,分别为26.30%和25.10%.圆二色谱结果表明,α-螺旋结构对菠萝蛋白酶的稳定性起关键作用.     

芽孢杆菌NCB-01胞外蛋白酶酶学特性的初步研究

该实验对来自于渤海海域沉积物的芽孢杆菌NCB-01分泌的胞外蛋白酶的酶学特性进行了初步研究。结果表明,该蛋白酶的最适作用温度为60 ℃,最适pH值为8.0,在50 ℃以下及pH值7.0～9.0的范围内酶稳定性良好。该酶具有较好的金属离子耐受能力,Fe2+、K+、Na+、Mn2+、Ca2+、Mg2+对酶活均有不同程度的激活作用。丝氨酸蛋白酶特异性抑制剂（PMSF）能强烈抑制该酶的酶活性,表明该蛋白酶为丝氨酸碱性蛋白酶。非离子型表面活性剂Tween-20、Tween-80及Triton X-100和阳离子表面活性剂十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）对酶活均有较强的抑制作用。该酶具有良好的耐盐性。其米氏常数（Km）为1.11 mg/mL,最大反应速率（Vmax）为91.74 μg/（min·mL）,说明该碱性蛋白酶与酪蛋白的亲和力好,特异性强。     

食盐质量浓度对大叶麻竹笋腌制过程中品质特性的影响

以大叶麻竹笋为原料,研究不同食盐质量浓度对大叶麻竹笋腌制过程中pH值、总酸、水分、NaCl、乙醇不溶物(AIS)、Ca2+、Mg2+、硬度和组织微观结构等的影响。结果表明:随着食盐质量浓度的增加,腌制后大叶麻竹笋的pH值,与硬度密切相关的AIS、Ca2+和Mg2+含量、硬度,细胞结构中的中胶层厚度等均增加,但其总酸和水分含量却降低。说明高食盐质量浓度腌制大叶麻竹笋,有助于保持其硬度,减缓其质地的变软。