实时荧光PCR法检测鼠伤寒沙门氏菌

目的 建立实时荧光PCR法检测鼠伤寒沙门氏菌的方法。方法 基于鼠伤寒沙门氏菌II型限制酶基因, 设计引物及Taqman探针, 利用实时荧光PCR进行特异性、灵敏性及模拟样品的检测实验。结果 特异性探针可从25种血清型沙门氏菌(共49株)及11株阴性对照菌株中检测出全部的11株鼠伤寒沙门氏菌。以鼠伤寒沙门氏菌梯度稀释菌液DNA为模板进行实时荧光PCR实验, 菌株模板浓度与Ct值呈良好线性关系, 线性系数(R2)为0.998, 扩增效率90%, 最低检测浓度300 cfu/mL。对已接种鼠伤寒沙门氏菌的4种模拟样品同时进行实时荧光PCR检测和传统方法鉴定, 两者结果一致。结论 此方法特异、灵敏、准确, 适于食品中鼠伤寒沙门氏菌的检测。     

3种血清型沙门氏菌多重PCR检测方法的建立

目的建立多重聚合酶链式反应(multiplex polymerase chain reaction,mPCR)法检测3种常见血清型沙门氏菌的分析方法。方法以肠炎沙门氏菌Hat基因、鼠伤寒沙门氏菌Stm-4495基因、乙型副伤寒沙门氏菌sdfI基因设计合成特异性引物,提取沙门氏菌基因组DNA为扩增模板,验证引物特异性,优化多重PCR退火温度及引物浓度,检测方法特异性及检出限,并利用该方法对人工污染冷鲜鸡肉进行检测。结果 3对引物特异性强且无交叉影响;25μL多重反应体系中,引物STM、HAT、SDF最佳终浓度分别为:0.5、0.5、0.4μmol/L,最佳退火温度为60℃;11株阴性对照菌无目标条带检出,方法特异性良好,以3种血清型沙门氏菌纯培养物DNA混合物为模板,检出限低至DNA质量浓度1 pg/μL;人工污染鸡肉经过12 h增菌,能同时检测出3种血清型沙门氏菌的检测限为:肠炎沙门氏菌(4.0±1.0) CFU/g、鼠伤寒沙门氏菌(8.0±0.9) CFU/g、乙型副伤寒沙门氏菌(8.0±0.6) CFU/g。结论本方法特异性强、检测限低,对食品中3种常见血清型沙门氏菌快速检测具有重要意义。     

鼠伤寒沙门氏菌ompc基因PCR的检测方法

建立一种鼠伤寒沙门氏菌的聚合酶链式反应检测方法。根据GenBank中已发表的鼠伤寒沙门氏菌的ompc的基因序列,设计和合成了一对特异性引物,并优化了反应条件,检测了该方法的敏感性和特异性。结果成功扩增出了鼠伤寒沙门氏菌470 bp的ompc特异性基因片段,而对致病性大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌和志贺氏菌4 种食品中常见的病原菌均未扩增出相应片段。敏感性实验结果表明本方法可检测到最低1 pg/μL的鼠伤寒沙门氏菌基因组DNA。     

鼠伤寒沙门氏菌PCR快速检测试剂盒的研制

为了能快速、准确、灵敏地检测鼠伤寒沙门氏菌,而研制一种基于PCR技术的检测试剂盒。该试剂盒采用了一对特异引物,该引物是以鼠伤寒沙门氏菌的基因STM4495中一段特异序列为检测靶点设计的,可使试剂盒具有良好的特异性。特异性评价试验结果显示,可从22株沙门氏菌(12种血清型)和20株非沙门氏菌(12个常见属)中,准确地检测出鼠伤寒沙门氏菌。此外,从5种PCR增强剂中筛选到了3种,并添加到试剂盒中,以避免PCR反应受到引物二聚体和食品中PCR抑制剂的干扰,使试剂盒具备良好的灵敏性。经评价试验表明,试剂盒检测鼠伤寒沙门氏菌的检测限可以达到37.5 fg/PCR,即使贮存于—20℃放置30 d,仍然能够达到原有检测限;而将该试剂盒反复冻融60次后,也可达375 fg/PCR。对食品样品进行检测,经过增菌24 h后,可以从0～1 CFU/10 g乳粉中检测出鼠伤寒沙门氏菌。从以上结果可知,研制的PCR试剂盒能够准确地检测出鼠伤寒沙门氏菌,具有较高的灵敏性和稳定性,可以用于食品中鼠伤寒沙门氏菌的快速筛检。     

基于核酸适配体杂交链式反应比色法检测鼠伤寒沙门氏菌

该研究探讨了基于核酸适配体特异性识别机制和杂交链式反应（hybridization chain reaction,HCR）扩增策略,以金纳米粒子（gold nanoparticles,AuNPs）颜色变化为比色信号,设计了一种无标记、无酶、灵敏的鼠伤寒沙门氏菌（Salmonella typhimurium,S. typhimurium）比色检测法。根据鼠伤寒沙门氏菌核酸适配体设计引发链和两个发夹探针,核酸适配体捕获鼠伤寒沙门氏菌,触发引发链打开发夹探针,发生杂交链式反应,在实现目标菌信号放大同时,利用反应前发夹探针粘性末端以及反应后形成的杂交长链对金纳米粒子结合差异性,产生比色信号,实现鼠伤寒沙门氏菌的快速检测。通过对杂交链式反应时间、发夹探针与金纳米粒子结合时间以及发夹探针浓度等实验参数进行优化,提高实验灵敏度。在最优实验条件下,鼠伤寒沙门氏菌浓度对数值与紫外吸光比值（A630/525）在103~107 CFU/mL范围内呈现良好的线性关系,检测限为6.3×101 CFU/mL,在牛奶样品中加标回收率为90.05%~109.97%。本比色法操作方便,无需要化学修饰以及复杂仪器且实验结果可视,为鼠伤寒沙门氏菌监测提供一种新的方法。     

基于TaqMan探针双重荧光PCR检测食品中肠道沙门氏菌和肠炎沙门氏菌

建立基于TaqMan探针双重重实时荧光PCR检测肠道沙门氏菌(Salmonella enterica,SP)和肠炎沙门氏菌(Salmonella Enteritidis,SE)的方法。根据SP的aceA基因(Gen Bank:U43344.1)、肠炎沙门氏菌特异序列SEP(GenBank:AF370707.1),分别设计引物和探针,在ace A探针的5′端标记FAM和SEP探针的5′端标记VIC,建立基于TaqMan探针双重荧光PCR检测方法。试验结果,58株29种不同血清型肠道沙门氏菌均扩增出ace A基因扩增曲线,SEP特异性地扩增出15株SE,而28种不同血清型沙门氏菌和17株变形杆菌等阴性对照株扩增结果均为阴性。ace A和SEP的双重荧光PCR扩增效率分别为100%和104%,R2分别为0.999和0.998,最低检测浓度分别达到280 cfu/m L和260 cfu/m L。建立的方法特异性好、灵敏度高,整个试验可在31 h完成,是快速检测SP和SE的有效方法,可用于食品中SP和SE的特异性检测。     

S．Heidelberg血清型特异性基因筛选及PCR检测方法的建立与应用

海德尔堡沙门氏菌(Salmonella enterica serovar Heidelberg,SH)是沙门氏菌属内重要的致病性血清型。通过对SH基因组序列进行BLAST比对和PCR验证,筛选出了4个SH血清型特异性基因(SeHA_C2639、SeHA_C2640、SeHA_C3259和SeHA_C3258)。以SeHA_C3258作为靶点设计引物pHAm8(350bp)和沙门氏菌属特异性引物139-141(284bp),建立SH的PCR检测方法,并对其应用效果进行评价。结果表明,经55株不同血清型的沙门氏菌和其他常见食源性致病菌证明,该检测体系具有较好的特异性,纯菌菌落灵敏度为6.1×10~2 CFU/mL。以浓度为N×10~5~N×10~1 CFU/mL的大肠杆菌或鼠伤寒沙门氏菌为干扰菌时,该体系对10~2 CFU/mL的SH检测结果无影响。人工污染SH的牛奶样品,经8h培养,检测限达1.52CFU/mL。该检测方法能快速、准确检测出食品中的SH,有利于在食品安全领域中的应用。     

进出口食品中不同血清型沙门氏菌PFGE和MLST分型比较研究

目的通过脉冲场凝胶电泳(PFGE)和多位点序列分型(MLST)两种方法对进出口食品中不同血清型沙门氏菌的分辨力和应用价值进行了比较研究。方法采用PFGE和MLST两种方法对进出口食品中分离得到的鼠伤寒及肠炎两种血清型共30株沙门氏菌进行分型研究。结果两种血清型共30株沙门氏菌经PFGE分型可得到23种型别,DI值为0.9563;鼠伤寒和肠炎两种血清型菌分别经PFGE分型,DI值分别为1.000和0.9048。MLST对30株沙门氏菌分型得到4种ST型,DI值为0.5793;鼠伤寒和肠炎两种血清型菌分别经MLST分型,DI值分别为0.2571和0.1333。结论 在分辨力方面,PFGE更适合于同一沙门氏菌血清型的分型,MLST则适合于不同沙门氏菌血清型间的分型。MLST在替代、补充血清型分型方面有潜在的优势,PFGE在溯源研究方面更胜一筹。     

进出口食品中不同血清型沙门氏菌PFGE和 MLST分型比较研究

目的：通过PFGE和MLST两种方法对进出口食品中不同血清型沙门氏菌的分辨力和应用价值进行了比较研究。方法：采用PFGE和MLST两种方法对进出口食品中分离得到的鼠伤寒及肠炎两种血清型共30株沙门氏菌进行分型研究。结果：两种血清型共30株沙门氏菌经PFGE分型可得到23种型别,DI值为0.9563;鼠伤寒和肠炎两种血清型菌分别经PFGE分型,DI值分别为1.000和0.9048。MLST对30株沙门氏菌分型得到4种ST型,DI值为0.5793;鼠伤寒和肠炎两种血清型菌分别经MLST分型,DI值分别为0.2571和0.1333。结论：在分辨力方面,PFGE更适合于同一沙门氏菌血清型的分型,MLST适合于不同沙门氏菌血清型间的分型。MLST在替代、补充血清型分型方面有潜在的优势,PFGE在溯源研究方面似乎更胜一筹。     

多重PCR技术检测食品中鼠伤寒沙门氏菌3 种毒力基因

该研究建立多重酶链式反应法快速检测鼠伤寒沙门氏菌3 种毒力基因的检测方法。以鼠伤寒沙门氏菌毒力基因mgtC、inva、mogA、sseL、araB 设计合成特异性引物,提取鼠伤寒沙门氏菌的DNA 为扩增模板,通过单重聚合酶链式反应技术（polymerase chain reaction,PCR）验证引物特异性,利用引物特异性、Tm 值等综合因素通过多重聚合酶链式反应技术（multiple polymerase chain reaction,MPCR）检测方法实现沙门氏菌多种毒力基因的检测,并优化MPCR 试验参数,提高检测灵敏性。结果表明,在多对特异性引物中进行MPCR 反应,筛选出mgtC、mogA、araB 3 种毒力基因进行MPCR 反应的特异性强、无交叉污染,且该方法能检测的最低灵敏度为0.0165 ng/μL。成功建立快速检测食品中沙门氏菌3 种毒力基因的方法,该方法检测特异性强、灵敏度高,检测限低。     

基于纳米探针检测食源性肠炎沙门氏菌技术初探

目的建立纳米探针快速、准确检测食源性肠炎沙门氏菌的方法。方法利用二氧化硅磁纳米材料与肠炎沙门氏菌抗体制备纳米探针,将制备后的探针与经过荧光染色的肠炎沙门氏菌结合,并通过荧光显微镜和流式细胞仪对探针捕获的细菌进行检测,并比较2种方法的优劣。结果本方法设计合成了肠炎沙门氏菌纳米探针,通过荧光显微镜可以观察到复合纳米探针结合的5′106 CFU/mL和5′107 CFU/mL浓度的肠炎沙门氏菌,在放大400倍的显微镜视野中成倍递增,该探针结合流式细胞术可以检测到5′105 CFU/mL浓度的肠炎沙门氏菌。结论纳米探针技术结合荧光显微镜、流式细胞术可以更加快速、准确、灵敏地用于食源性肠炎沙门氏菌的定性检测,并有望通过进一步实验实现食源性致病菌的定量检测。     

食品中沙门菌PCR检测方法的建立

为建立食品中快速检测沙门菌的PCR方法。选取沙门菌属侵袭性抗原保守基因invA基因上的靶序列设计一对引物,选择最适Mg 浓度和退火温度,建立最适PCR反应体系,用2%琼脂糖,5μl反应产物(包括EB),100V,40min进行电泳,显像。用该引物对已经传统方法鉴定的22种77株沙门菌和24种24株非沙门菌进行特异性检测,并对人工污染的食品进行检测条件的研究。Mg 浓度和退火温度对该反应体系的影响较小,稳定性较好;经传统方法鉴定的22种77株沙门菌和24种24株非沙门菌验证了该检验方法具有很好的特异性;该检测方法可以在19h内检出含有沙门菌102CFUg的食品(火腿肠、鸡蛋、散装肉馅)。与传统方法比较,该方法快速、敏感、特异,能在较短的时间内对大量样品同时进行检测,适用于食品中沙门菌的快速、敏感、特异检测。     

PCR amplification of the Salmonella typhimurium fimY gene sequence to detect the Salmonella species

This study evaluated the suitability of fimY gene amplification by PCR as an effective means of detecting Salmonella species. Although fimY gene of Salmonella typhimurium is involved in regulating type 1 fimbrial expression, the amino acid sequence of FimY shares very little homology with other known prokaryotic proteins in the GenBank database. Therefore, fimY is a promising target gene to detect the presence of Salmonella species. Herein, two primers internal to the fimY gene of S. typhimurium are used to investigate the distribution of the fimY homologous sequence among 45 Salmonella serovars and 20 non-Salmonella species by using PCR. Experimental results indicated that only Salmonella species possessed the fimY homologous sequence, subsequently generating the specific 526-bp DNA fragments. The sensitivity of the fmY-specific primer set was demonstrated on a Salmonella-free swab sample from a pork carcass surface, which was then artificially contaminated with different concentrations of S. typhimurium. A combining of pre-enrichment step in buffered peptone water and PCR amplification of fimY allowed the detection of S. typhimurium at the concentration of 3.4 x 10(0) CFU/ml from the swab sample. With an additional enrichment step in Rappaport-Vassiliadis (RV) broth, this procedure can also detect pork carcass surface naturally contaminated with Salmonella species in a slaughterhouse. Results in this study demonstrate that fimY is unique to Salmonella species and is an appropriate PCR target for detecting these microorganisms.     

北京市顺义区腹泻病例分离沙门氏菌耐药特征分析

目的 对北京市顺义区腹泻病例分离的沙门氏菌进行耐药特征分析。方法 2个收集2013—2018年北京市顺义区腹泻病例粪便标本,对标本进行沙门氏菌分离培养、生化鉴定和血清分型,使用微量肉汤法对分离的沙门氏菌菌株进行26种抗菌药物的敏感性检测,开展耐药率、非敏感率、多重耐药率和耐药谱分析。结果 腹泻病例沙门氏菌检出率为5.44%(113/2 076),包含26种血清型,其中肠炎沙门氏菌构成比为32.46%(37/114),鼠伤寒沙门氏菌构成比为27.19%(31/114)。沙门氏菌多重耐药率为44.74%(51/114),分布62种耐药谱;肠炎沙门氏菌多重耐药率为67.57%(25/37),分布29种耐药谱。鼠伤寒沙门氏菌多重耐药率为45.16%(14/31),分布20种耐药谱。结论 北京市顺义区分离自腹泻病例的沙门氏菌耐药状况较为严重,耐药谱分布呈现多样性。应持续开展沙门氏菌病原学监测,为沙门菌感染的科学防控和治疗提供依据。     

食源性沙门氏菌分离株致病性研究和毒力相关基因检测

为研究零售鲜肉源沙门氏菌（Salmonella）优势血清型分离株的致病性及相关毒力基因的相关性,本研 究分别取4 种优势血清型S. derby、S. agona、S. enteritidis、S. typhimurium沙门氏菌分离株对SPF级昆明小鼠进行致 病性实验,采用改良寇氏法计算半数致死量,判断4 种血清型沙门氏菌的毒力,并通过聚合酶链式反应检测实验 菌株中9 种毒力相关基因的分布情况并分析其相关性。结果表明,4 种不同血清型的沙门氏菌分离株对小鼠均有 40%～70%的致死率,S. enteritidis、S. agona、S. derby对昆明小鼠的致病力相似,S. typhimurium较弱,且发现致病 力的强弱与毒力岛SPI-2中的sseL基因密切相关。     

TaqMan实时荧光PCR对沙门氏菌能力验证样品的快速检测与鉴定

本研究依据GB 4789.4-2016标准对沙门氏菌ACAS-PT526能力验证样品进行常规培养法检测,同时使用TaqMan实时荧光聚合酶链反应（polymerase chain reaction,PCR）技术对预增菌培养物进行快速检测和鉴定。本研究首先以沙门氏菌特异性基因hut基因为靶基因,设计合成特异性引物和探针,提取各类食源性菌种的核酸DNA进行实时荧光PCR反应,仅沙门氏菌属出现阳性扩增,非沙门氏菌属、阴性对照和空白对照均无扩增信号,验证设计合成的引物探针具有较高的特异性。其次将能力验证样品和加标样品经预增菌、增菌、分离、纯化、生化试验和血清学鉴定,同时将预增菌培养物经实时荧光PCR测定后,18-D319和加标样品有显著的S型扩增曲线,Ct值分别为24.34和26.21,为沙门氏菌阳性,18-M906无显著荧光信号,Ct值>40.00,为沙门氏菌阴性。经API20E试剂条鉴定,18-D319为猪霍乱沙门菌亚利桑那亚种,鉴定百分率为99.90%,T值为0.97,18-M906为大肠埃希氏菌,鉴定百分率为99.80%,T值为0.94。实时荧光PCR检测结果与常规培养法检测结果一致,且更为简单快速,从预增菌到结果判定仅需12 h,结果准确度高,一批次可检测多个样品,可用于大量样品中沙门氏菌的快速筛查和对能力验证样品的检测验证。     

PCR法检测肉鸭屠宰加工生产链中沙门氏菌的污染

为建立肉鸭加工中快速、准确的沙门氏菌PCR 检测方法,并应用于肉鸭屠宰生产加工链沙门氏菌的实时监测。采用Primer Premier 5.0 软件针对沙门氏菌特有的fimY 基因设计合成一对引物5′- GCATTCCGCTCATTAGAT-3′和5′-TGGAGGCTGATAACAAGG-3′,并对沙门氏菌DNA 扩增PCR 体系的退火温度、引物浓度、Mg2+ 浓度和聚合酶浓度进行优化。结果表明：成功扩增出沙门氏菌标准株和分离株的2 7 5b p 目的片段,灵敏度达到了1.2pg;应用建立的PCR 方法对国内某典型肉鸭屠宰厂的肉鸭屠宰链环节进行沙门氏菌污染的检测,发现在屠宰环境、拔毛浸烫水、浸蜡冷却水、清洗池水、宰前毛、食道、粪便和沥水体腔内共有25 个样品中扩增出了275bp大小的特异性片段,而空白对照无扩增条带。