纳豆芽孢杆菌发酵菜用大豆中纳豆激酶的提取及其性质分析

以菜用大豆为原料,直投式纳豆芽孢杆菌作为发酵剂,纳豆激酶活力作为评价指标,通过单因素和正交试验优化纳豆激酶发酵工艺条件;通过盐溶、硫酸铵分段盐析、二乙氨乙基（DEAE）阴离子交换柱分离纯化纳豆激酶,并采用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）确定其分子质量,并进行酶学性质和体外溶栓效果分析。结果表明,菜用大豆发酵生产纳豆激酶的最佳条件为：每100 g蒸煮菜用大豆接入1.15×1011 CFU/g直投发酵剂,发酵温度37 ℃、发酵时间36 h、后熟时间18 h时,此时纳豆激酶活力可达2 326.60 IU/g。纳豆激酶的分子质量介于25～35 kDa之间,最适作用温度、pH值分别为37 ℃、8.0,当温度低于40 ℃、pH值在6.0～8.0时较稳定;体外溶栓实验表明纳豆激酶具有良好的体外溶栓效果。     

嗜热链球菌发酵改良纳豆工艺优化

采用嗜热链球菌为改良菌种,通过二次发酵改良纳豆。熟制灭菌后的大豆在纳豆菌接种量2%、发酵温度37℃、发酵时间24 h条件下进行一次发酵。以嗜热链球菌的发酵温度、发酵时间、接种量为因素,以感官评分、纳豆激酶酶活为指标,通过单因素和响应面实验,研究嗜热链球菌二次发酵改良纳豆的最佳工艺条件。结果表明:在发酵温度42℃、发酵时间18.6 h、接种量1.5%时改良效果最佳,得到的感官评分为8.0分,纳豆激酶酶活为1964 U/g。改良效果较好,纳豆臭味下降,纳豆激酶酶活提高。     

纳豆激酶与豆豉纤溶酶酶学性质比较研究

研究对纳豆激酶和豆豉纤溶酶的酶学性质进行了分析和比较,结果发现,二者最适pH值范围和温度基本一致,分别为pH7.0~9.0、50℃;纤溶酶活性在60℃以上迅速下降;纳豆激酶在pH6.0~10.0、豆豉纤溶酶在pH7.4~12.0时稳定性好;Mg2+对2种酶均有激活作用,Mn2+、Fe2+、Fe3+、Zn2+有不同程度的抑制作用,Cu2+的对纳豆激酶的有显著抑制作用。     

产纳豆激酶菌株液体及固体发酵工艺初步研究

对纳豆菌株ZN-4(Bacillus natto)的液体深层发酵和固体浅盘发酵两种发酵工艺分别进行了初步研究,比较了两种工艺对该菌株产纳豆激酶的影响.结果表明,纳豆菌株ZN-4液体深层发酵的最佳培养基配方为:2%的葡萄糖,1%的大豆蛋白胨,Na2HPO40.6%,NaH2PO40.1%,MgSO40.05%,CaCl20.02%;最佳培养基起始pH为7.0,最佳接种量为3%,最适发酵温度为35℃,最佳发酵时间为56h,在此条件下,摇瓶发酵酶活最高可达到1903U/mL;以无机盐溶液浸泡过夜的优质东北大豆为发酵基料的固体浅盘发酵中,初步研究了不同接种量、发酵温度和发酵时间对该菌株产纳豆激酶的影响,结果表明,纳豆菌株ZN-4固体浅盘发酵的最佳接种量为10%,最适发酵温度为37℃,最佳发酵时间为48h,在此条件下,固体发酵酶活最高可达到2200U/g.     

响应面法优化鹰嘴豆发酵纳豆工艺

鹰嘴豆作为纳豆发酵原料,以纳豆激酶(Nattokinase,NK)活性为指标,在单因素实验的基础上,利用Box-Behnken实验设计以及响应面分析优化纳豆发酵工艺。研究结果表明,鹰嘴豆的最佳发酵工艺条件为:基质含水量50%,接种量6%,发酵温度34℃,发酵时间48h,后熟时间20h;对优化的工艺条件进行验证,纳豆激酶活性为986.324IU/g,与预测值接近。     

混菌固态发酵花生粕的工艺优化

采用纳豆芽孢杆菌和红曲霉混合菌株固态发酵花生粕,以纳豆激酶的活力和γ-氨基丁酸的含量为指标,通过单因素实验和正交试验对发酵的温度、时间、料水比、菌种比例、接种量进行优化,确定最佳工艺参数为:温度31℃,发酵时间46 h,料水比为1:0.4 g/mL,菌种比例(纳豆芽孢杆菌:红曲霉)2:1,接种量6%,在此条件下测定纳豆激酶的活力为(844.56±13.80) U/g,γ-氨基丁酸含量为(105.25±0.25) mg/g,对羟自由基清除率为68.46%±0.16%,对DPPH·清除率为76.98%±0.95%,铁还原力的OD值为0.481。     

保加利亚乳杆菌异源表达纳豆激酶的性质研究

目的:研究保加利亚乳杆菌中异源表达来自纳豆芽孢杆菌的纳豆激酶酶学性质及其体外溶栓作用。方法:从纳豆激酶的最适温度、热稳定性、最适pH值、pH值稳定性和金属离子及化学试剂等方面研究该酶的酶学性质,通过体外试验研究其溶血栓作用,并通过灭活纤溶酶原的方法分析其溶解纤维蛋白的作用方式。结果:保加利亚乳杆菌异源表达纳豆激酶的最适温度为40℃,在低于40℃时热稳定性较好,最适pH 7.0,pH值在6.0~8.0范围内较稳定。Ca~(2+)、Mn~(2+)、Fe~(2+)促进酶活的效果随浓度的变化而不同,其中Cu~(2+)、Hg~(2+)对该酶起明显的抑制作用,Ag+随浓度的增加抑制效果逐渐显著,而蛋白抑制剂PSMF对纳豆激酶具有明显的抑制作用,说明纳豆激酶为丝氨酸蛋白酶。体外试验表明:该酶溶解纤维蛋白的方式是直接溶解,而非通过激活纤溶酶原,且该酶具有明显的体外溶栓作用。结论:为纳豆激酶的应用及开发新型功能性乳制品提供了理论基础。     

响应面法优化红豆纳豆的发酵工艺

以红豆为原料,应用响应面法优化红豆纳豆的发酵工艺。以纳豆激酶的酶活力、感官评分为评价指标进行单因素试验,并在单因素试验基础上,选取接种量、接种种龄、发酵时间为影响因素。采用Box-Behnken中心组合试验设计建立数学模型,进行响应面分析。结果表明,红豆纳豆最佳发酵条件为接种量6%、接种种龄18 h、发酵时间21.5 h,在此发酵工艺条件下,感官评分为97.7分,纳豆激酶酶活力为1 140 U/g。     

纳豆激酶在腐乳储藏条件下稳定性初探

利用纤维蛋白平板法测定纳豆激酶活性,探究其活性影响因素及腐乳汤料环境对纳豆激酶的影响,为开发纳豆激酶强化腐乳做准备。结果表明:纳豆激酶在4~30℃性质稳定,30~40℃短时间内活性增高;pH 7.0~9.0为活性最高范围;质量分数8.0%~12.0%的氯化钠及体积分数10%~20%的乙醇均抑制纳豆激酶活性,处理后活性保留率分别为45%~55%和65%~70%;添加0.01 mol/L的Ca2+能提高其28%活性,Fe3+,Al 3+,Fe2+对纳豆激酶具有强烈抑制作用;山梨醇、海藻酸钠等物质对纳豆激酶影响不大;腐乳香辛料有利于纳豆激酶活性的稳定;腐乳条件下保存70天,纳豆激酶发酵液与汤料以2∶1比例混合,最有利于其活性稳定,活性保持90%以上。     

解淀粉芽孢杆菌诱变菌株NCU116-1的生物学特性及其酶系分析

以解淀粉芽孢杆菌诱变菌株NCU116-1为出发菌,对其生物学特性和培养特征进行研究。并用国标法、羧甲基纤维素糖化法等对该突变株的主要酶系的发酵时间和酶学性质进行分析测定。结果表明,淀粉酶、糖化酶和纤维素酶的最佳发酵时间是40 h;中性蛋白酶最佳发酵时间是44 h,果胶酶最佳发酵时间是42 h。中性蛋白酶在50℃时活力最高,Mn2+对其有激动作用,最适宜酶解温度为40~45℃、适宜酶解p H为8;糖化酶在35℃时活力最高,Cu2+、Fe3+和Mn2+对其有激动作用,最适宜酶解温度为35℃左右、适宜酶解p H为8.0;果胶酶在40℃时活力最高,Mn2+和Ca2+对其有激动作用,最适宜酶解温度为35~40℃、适宜酶解p H为6.0;纤维素酶在50℃时活力最高,Ca2+和Cu2+对其有激动作用,最适宜酶解温度为40~45℃,适宜酶解p H为7.0。该菌株生产的胞外酶符合水酶法提取植物油脂复合酶制剂的要求,本文为该类菌株的应用奠定理论基础。     

亲和层析法分离纯化纳豆激酶

目的：以纳豆激酶的作用底物纤维蛋白为配基制备亲和层析胶,分离纯化纳豆激酶。方法：纳豆杆菌发酵液经硫酸铵分段盐析、透析得粗酶,在4℃条件亲和层析法分离纯化,利用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)对酶纯度进行检验。结果：经亲和层析得纳豆激酶为电泳纯,纯化倍数为8.3,回收率43.9%。纯酶的最适pH值和温度分别为pH7.0～9.0、50℃;温度高于60℃纤溶酶活性迅速下降;在pH6.0～10.0范围内稳定性好;Mg2＋对其有微弱激活作用,Cu2+有显著抑制作用。结论：以琼脂糖包埋纤维蛋白制备的层析胶可用于纳豆激酶的快速分离纯化。     

鹰嘴豆纳豆优良发酵菌株的筛选与初步鉴定

分别从五个品牌的纳豆样品及树林土样中分离出27、23株芽孢杆菌（Bacillus spp.）,这50株菌经过菌落形态观察和酪蛋白 平板筛选后,分别从土壤和纳豆样品中筛选出了10株和3株共计13株分解酪蛋白能力较强的芽孢杆菌。 采用这13株菌进行鹰嘴豆 纳豆发酵对比,并对成品进行感官评价及纳豆激酶活性的测定。 结果表明,从土壤中分离出的菌株S-18产纳豆激酶活力最高,为（3269.38±52.59） U/g,具有鹰嘴豆纳豆发酵良好的应用前景。     

纳豆激酶的纯化及性质研究

从固态发酵培养的纳豆中提取纳豆激酶 ,采用盐析、疏水层析、离子交换层析等方法 ,对提取液进行纳豆激酶的分离纯化。经SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定 ,活性酶蛋白为单一组分 ,并测得其分子质量为 2 8ku。纳豆激酶在pH5 0～ 1 0 0 ,4～ 3 7℃范围内具有较好的稳定性 ,其纤溶活性可被 0 1mmol/L的PMSF完全抑制。体外溶栓实验表明 ,纳豆激酶为纤溶酶而不是纤溶酶原激活剂。     

中式纳豆制备技术的研究

为探索出符合中国人口味且纳豆激酶酶活力高的中式纳豆加工技术,该研究从市售的4种纳豆中分离出4株纳豆芽孢杆菌（Bacillus natto）,并筛选出一株产纳豆激酶能力最强的菌株NK3。以牛奶培养基替代传统的种子液培养基培养纳豆菌种,通过单因素试验考察发酵温度、时间、接种量、加水量对纳豆激酶酶活力的影响,采用正交试验优化纳豆发酵条件。结果表明,以牛奶为培养基培养的纳豆菌生长良好,在发酵温度27 ℃、发酵时间1.5 d、接种量5%、加水量6%条件下,菌株NK3发酵制备出的纳豆无氨臭味,有淡淡的奶香味,且纳豆激酶酶活力高达668.5 U/g。     

枯草芽孢杆菌筛选及其产纳豆激酶的液态发酵条件优化

为了提高现有纳豆激酶产量,促进其工业化生产与应用,本文从不同产地的鲜纳豆中分离出枯草芽孢杆菌,先后通过菌落形态初筛与酪蛋白平板复筛,选出水解圈与菌落比值较大的菌株,测定其发酵液中纳豆激酶酶活,选定一株酶活相对较高的菌株X3.通过系统16S rDNA测序鉴定和系统发育树对比,确定X3菌株为枯草芽孢杆菌.在单因素试验的基础...     

不同菌种发酵对纳豆激酶活性及黏液成分影响

采用5株不同来源的纳豆菌JLTH-075、JLGZL-018、JLTH-157、JLCC-243、JLLY-214,通过纳豆发酵实验,研究不同菌株对纳豆激酶活力、黏液营养物质的影响,评价其发酵性能,为纳豆工业生产用菌筛选提供借鉴。结果表明,菌株JLGZL-018生产的纳豆激酶活性最高,为4 167 IU/g;其生产的纳豆黏液成分中总蛋白、可溶性总糖含量最高,分别为（17.38±0.54）%、（5.21±0.13）%;水解氨基酸总量适中,为（5.24±0.27） g/100 g,7种必需氨基酸含量最高,为（0.87±0.08） g/100 g;游离氨基酸各成分与其他4株菌无显著差别。菌株JLGZL-018综合发酵性能较好,具有开发应用潜力。     

醋酸菌中乙醛脱氢酶的分离纯化及酶学性质

以实验室筛选得到的醋酸菌(Acetobacter pomorum)为实验菌株发酵产酶,通过细胞破壁,采用(NH₄)₂SO₄沉淀、透析、DEAE-Sepharose 离子交换层析及 Superdex G-75凝胶过滤层析分离纯化得到乙醛脱氢酶的酶液,并考察其酶学性质。该酶分子质量为221.60 kDa,单个亚基分子质量约为54.41 kDa,为四聚体结构;纯酶液比活力20.25 U/mg,纯化倍数为10.16倍,乙醛脱氢酶(aldehyde dehydrogenase,ALDH)的回收率为6.53%。酶学性质研究表明,ALDH促进乙醛分解的最适温度为50 ℃,40~50 ℃相对酶活力稳定性好;该酶的最适pH为7.0,当pH在5.5~7.5内酶活力表现稳定;金属离子对酶活性的影响实验表明,Na+、K+、Zn2+、Ba2+对该酶酶有不同程度抑制作用,而Mg2+、Ca2+、Al3+、Li+、Cu2+具有促进作用;ALDH的最适底物为乙醛,相对偏好直链醛类。ALDH活性较大,为后期表达和深入研究其生物学功能提供理论和数据支持。     

纳豆激酶制剂的研究

以选取的纳豆菌-9号为出发菌株，在最佳摇瓶培养条件基础上通过5L发酵罐扩大培养，确定最优发酵培养条件，纳豆激酶活力较摇瓶培养提高2．05倍；发酵液经真空冷冻干燥得到纤溶活性较高的纳豆激酶干粉，并对纳豆激酶干粉的部分酶学性质进行了研究。