基于16S rDNA序列、MALDI-TOF-MS和VITEK的沙门氏菌和金黄色葡萄球菌的鉴定

沙门氏菌和金黄色葡萄球菌广泛存在于食品及环境中,对食品安全造成一定的威胁。在食源性致病菌检测过程中,选择合适的方法不仅可以缩短时间,节省人力物力,还能更好地溯源。选取210株沙门氏菌和18株金黄色葡萄球菌,使用16S rDNA序列测定、基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)和VITEK全自动细菌鉴定系统对其鉴定,使用R软件包(v3.6.1)对鉴定结果进行统计和相关性分析,比较3种方法的鉴定水平和效率。结果表明:3种方法均可将210株沙门氏菌(100.0%)鉴定到属水平;16S rDNA序列测定方法可将18株(100.0%)金黄色葡萄球菌鉴定到属水平,可将其中15株(83.3%)菌鉴定到种水平;MALDI-TOF-MS和VITEK可将18株金黄色葡萄球菌(100.0%)鉴定到种水平。除16S rDNA序列测定方法外,其余2种方法对金黄色葡萄球菌和沙门氏菌的鉴定水平相同,而MALDI-TOF-MS鉴定所需时间最短、效率最高。     

朝鲜族传统大酱中乳酸菌的分离及其抑菌特性分析

为了分析朝鲜族传统酱类中乳酸菌分布及其功能特性,对不同地区家庭制作的朝鲜族大酱进行乳酸菌的筛选和分离纯化,并进行抑菌性能的研究。结果,从26种样品中共分离出86株乳酸菌,其中48株菌株对蜡样芽孢杆菌有抑制作用,47株菌株对鼠伤寒沙门氏菌有抑制作用,55株菌株对大肠杆菌有抑制作用,12株菌株对金黄色葡萄球菌有抑制作用。通过16SrRNA基因序列分析对代表菌株进行鉴定,鉴定出3种乳酸菌种类,分别为戊糖片球菌、乳酸片球菌、植物乳杆菌。     

16S与gyrB基因联合建树快速鉴定一株蜡样芽孢杆菌

开发一种可用于保守序列相似度较高的菌群快速鉴定的方法,并用其鉴定一株从土壤采集的芽孢杆菌。从厦门市同安国家农业科技园区施用动物肥的种植区采集土壤,稀释涂布平板,分离纯化菌株后,扩增16S与gyrB基因序列并测序,在Genbank选择序列相似的ATCC菌株进行比对,将16S序列与gyrB序列线性拼接后,利用Paup* 4.0构建进化树,通过生理生化实验对鉴定结果进行验证。在16S序列与gyrB基因序列单独建树均无法鉴定到种的情况下,通过16S与gyrB碱基线性拼接序列联合建树,将土壤中分离得到的芽孢杆菌HX2016002鉴定为蜡样芽孢杆菌,该方法所构建的进化树自展值高,鉴定结果与生理生化实验一致。对Genbank中已知的蜡样芽孢杆菌序列建树分析表明,该方法在蜡样芽孢杆菌中具有普适性。利用16S与gyrB基因拼接序列联合建树,在保守序列相似度高的属内菌种鉴定中具有进一步研究的价值。     

原桃胶中1株芽孢杆菌的分离鉴定及其主要抗菌物质

从天然原桃胶分离到1 株产抑菌活性物质的芽孢杆菌TJ12。其发酵产物对金黄色葡萄球菌（Staphylococcusaureus）、藤黄微球菌（Micrococcus luteus）、蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus）和串珠镰刀菌（Fusarium moniliforme）有抑菌活性。结合菌落形态、生理生化指标、16S rRNA序列和gyrB序列将TJ12菌株鉴定为地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）。通过硫铵沉淀、有机溶剂萃取、羟丙基葡聚糖凝胶、高效液相色谱分离纯化,得到其主要活性物质。该物质对pH值、温度和3 种蛋白酶（胰蛋白酶、蛋白酶K、胃蛋白酶）有较好的稳定性。经电喷雾电离质谱分析,初步鉴定该株地衣芽孢杆菌TJ12的主要抗菌物质为杆菌肽A。     

3种致病菌多重real-time PCR检测方法的建立及其在散装即食肉制品中的应用

建立一种同时快速检测沙门氏菌、金黄色葡萄球菌和蜡样芽孢杆菌的三重实时聚合酶链式反应(real-time polymerase chain reaction,real-time PCR)方法.以沙门氏菌invA基因、金黄色葡萄球菌Sa442基因和蜡样芽孢杆菌Cereolysin AB基因为靶基因设计引物和TaqMan探针...     

西藏雪莲中酵母菌的分离鉴定及抑菌活性的研究

西藏雪莲发酵所产生的乳制品具有良好的保健作用.本实验对从西藏雪莲发酵乳液中分离得到的酵母菌进行了研究,经过生理生化鉴定确定为毕赤氏酵母属.以麦芽汁为培养基,探讨毕赤氏酵母发酵液对大肠杆菌,金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、蜡样芽孢杆菌和单核增生李斯特菌五株指示菌的抑菌活性,均具有抑菌活性,发酵液中抑菌物质具有一定的热稳定性,加热处理后,其抑菌效果有所降低;经不同pH处理后,毕赤氏酵母分泌的抑菌物质的抑菌活性变化不大.     

16SrRNA序列分析在沙门氏菌鉴定分型中的应用

目的建立103株28种血清型沙门氏菌16SrRNA的进化树,了解沙门氏菌进化关系,为基于16SrRNA序列分析对沙门氏菌鉴定分型提供理论基础。方法使用细菌基因组DNA提取试剂盒提取细菌DNA,聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)扩增16SrRNA基因片段后进行测序,将序列提交到Genebank和RDP核糖体数据库进行比对,下载相关参考序列,使用MegAlign软件Clustal-V法构建进化树。结果根据16SrRNA同源性能够把103株沙门氏菌聚类成不同群,部分菌株可以鉴定到血清型,部分菌株可以在血清型内进一步区分,虽然与传统血清学分型不能一一对应,但是能形成独立的分型系统。结论 16SrRNA基因序列分析是对沙门氏菌进行鉴定分型及溯源分析的有效方法。     

2015年内蒙古地区31批保健食品中污染菌的分离与鉴定

目的 对保健食品中的污染菌进行分离和鉴定。方法 按照GB 4789《食品安全国家标准 食品微生物学检验》对31批次保健食品进行检验, 采用全自动细菌鉴定系统对污染菌进行鉴定。结果 从31批次的保健食品中分离、鉴定出64株污染菌, 在沙门氏菌、志贺氏菌、金黄色葡萄球菌和溶血性链球菌的检验中未检出目的菌, 但分离得到致病菌和条件致病菌, 分别是阴沟肠杆菌、肺炎克雷伯菌、气味沙雷菌、温和气单胞菌、赫氏埃希菌、阪崎肠杆菌、非脱羧勒菌、泛菌属、缓慢葡萄球菌、浅绿气球菌、哥伦比亚肠球菌、腐生葡萄球菌、产色葡萄球菌、溶血葡萄球菌、铅黄肠球菌、屎肠球菌、以及枯草/解淀粉/萎缩芽孢杆菌、死谷芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌以及蜡样/苏云金/蕈状芽孢杆菌。结论 各种致病菌及条件致病菌的检出, 对消费者健康存在潜在的风险。通过分析污染菌的来源及危害, 提出提高保健食品卫生质量的建议, 为保健食品的生产、消毒灭菌、卫生学检验及监督管理等方面提供参考。     

基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱法鉴定食品中金黄色葡萄球菌

目的评价基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(matrix assisted laser desorption ionization time of flight mass spectrometry,MALDI-TOF MS)对食源性金黄色葡萄球菌的鉴定效果。方法应用MALDI-TOF MS对210株食源性金黄色葡萄球菌进行鉴定,与传统的生化鉴定结果进行比较,并用SPSS19.0软件分析鉴定结果。结果 MALDI-TOF MS将210株金黄色葡萄球菌鉴定到种、属水平分别为98.10%和1.43%,与VITEK 2鉴定方法无差异(P0.05)。结论 MALDI-TOF MS具有简便、快速、准确等优点,适用于对食源性金黄色葡萄球菌进行高通量、低成本的快速鉴定。     

糙米中蜡样芽孢杆菌的分离鉴定及其毒力基因与药敏性检测

本文从一份糙米样品中分离纯化出5株细菌,分别命名为BR1、BR2、BR3、BR4和BR5,对其进行形态学观察、生理生化鉴定、16S rRNA及gyrB基因测序鉴定,并对其毒力基因及药物敏感性等生物学特征进行研究。结果表明,5株分离菌株生化特性符合蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus）的特性,结合16S rRNA及gyrB基因测序结果,菌株BR1和BR4鉴定为蜡样芽孢杆菌。毒力基因的PCR检测结果表明,菌株BR1和BR4携带肠毒素基因（hbl、nhe、entFM和bceT）和细胞毒素K基因（cytK）,未检测到呕吐型毒力基因（cer和ces）。菌株BR1和BR4对青霉素、氨苄西林和头孢噻肟等药物耐药,对阿莫西林中度敏感,对诺氟沙星、环丙沙星和庆大霉素等药物敏感。本研究通过分离鉴定糙米源蜡样芽孢杆菌,发现分离菌株携带多种毒力基因,并且对青霉素类、头孢菌素类及磺胺类等药物耐药,表明糙米中的蜡样芽孢杆菌有引起食源性疾病的风险。     

金黄色葡萄球菌基质辅助激光解析电离-飞行时间质谱的鉴定与聚类分型

目的 建立基质辅助激光解吸电离-飞行时间质谱法(matrix assisted laser desorption lonization-time of flight mass spectrometer, MALDI-TOF MS)快速鉴定金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus, S. aureus)并自建数据库, 进行聚类分型。方法 基于MALDI-TOF MS技术, 对经全自动微生物分析仪(VITEK2 COMPACT)鉴定为S. aureus的25株分离株和1株标准菌株(ATCC 25923)进行鉴定。并进一步采集26株S. aureus特征性蛋白质指纹图谱, 使用flex Analysis软件进行分析, 汇总成标准图谱并构建本地分离株S. aureus的鉴定数据库, 命名为Staphylococcus aureus。结果 经标准菌株ATCC 25923验证, 自建数据库对S. aureus鉴定结果的可信度较设备自带数据库明显提高, 鉴定分值由2.251提高到了2.845。自建数据库进一步对26株S. aureus进行聚类分型, 在差异水平100时, 24株不同来源S. aureus被聚类成24个分支, 将食品中不同来源分离的S. aureus分为24个型。结论 MALDI-TOF MS作为一种快速、准确、高通量的全新微生物鉴定技术, 实现了对S. aureus的特异性快速鉴定与分型, 能够满足公共安全卫生、突发食品安全事件和口岸快速通关方面的需求。     

基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱与VITEK和rpoB基因测序三种方法对食品中葡萄球菌鉴定效果的比较

目的 比较基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flightmass spectrometry,MALDI-TOF MS)、rpoB基因测序和VITEK 2 Compact三种方法对葡萄球菌的鉴定效果.方法 同时采用三种...     

预包装食品中金黄色葡萄球菌3种鉴定方法的比较

目的 比较国家标准方法(GB 4789.10-2016)、VITEK2 Compact全自动微生物鉴定系统、基质辅助激光解吸电离-飞行时间质谱法对预包装食品中金黄色葡萄球菌的鉴定效果。方法 使用金黄色葡萄球菌(ATCC 25923)人工污染12种不同种类的预包装食品,按照GB4789.10-2016进行样品前处理和增菌,通过上述三种方法对上述样品中分离的疑似金黄色葡萄球菌进行鉴定,并对鉴定结果进行比较。结果 三种方法均能够对12种不同种类的人工污染预包装食品中分离的金黄色葡萄球菌进行准确有效的鉴定。相对于国标法,两种仪器鉴定方法无需进行后续溶血分析和血浆凝固酶试验,对操作人员技术要求更低,能够在更短的时间内获得鉴定结果。结论 两种仪器鉴定方法快速、可靠且操作简单,可以作为国标法的有效补充。     

食品中沙门氏菌快速检测技术方法对比结果分析

目的比较VITEK2COMPACT、基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱法(matrixassistedlaser desorption ionization time of flight mass spectrometry, MALDI-TOF-MS)、实时荧光PCR法(real-time PCR)、环介导等温扩增法(loop-mediated isothermal amplification, LAMP)4类方法,分析其对沙门氏菌的快速检测效果。方法挑取12株阳性野生菌株复苏,配以1株标准菌株作为对照,分别用VIKEK2COMPACT、MALDI-TOF-MS、Real-timePCR、LAMP四类方法对其进行检测,并比较4类方法的结果差异。结果 Real-time PCR与LAMP单对通用引物能鉴定到属水平,此外, LAMP测定沙门氏菌时会有假阴性的情况出现;VITEK2生化鉴定能将少数沙门菌株鉴定到种的水平;质谱方法能鉴定到亚种水平,同时会出现鉴定不准确的情况。结论基于沙门氏菌属水平上, 4类方法都能快速准确鉴定沙门氏菌,但在使用快速检测技术时均应考量该方法的优点对实际工作的帮助以及缺点对检验结果的影响,才能提高检测效率。     

金黄色葡萄球菌鉴定方法研究

目的 为了筛选出能够快速准确鉴定金黄色葡萄球菌的方法。方法 利用国标法、VITEK 2 Compact生化鉴定、16s rDNA序列分析和PCR鉴定等4种方法对酱卤肉制品中分离出的典型菌落进行鉴定。结果 国标法检测结果显示菌株为革兰氏阳性菌,血平板上有明显的透明溶血圈且血浆凝固酶试验结果为阳性,符合金黄色葡萄球菌判定标准。VITEK 2 Compact生化鉴定结果中不吻合的典型生化谱仅有1项（dMAL）,判定菌株为金黄色葡萄球菌（98%概率）,为极好的鉴定。16s rDNA序列比对分析及以邻接法构建的进化树均显示典型菌落为金黄色葡萄球菌。以耐热核酸酶基因（nuc）设计的引物能扩增出单一的清晰条带,能快速准确的识别出金黄色葡萄球菌。结论 4种方法均能准确鉴定出金黄色葡萄球菌,但耗时都比较长,通过改进实验方法,缩短DNA提取时间,PCR鉴定将表现出较大优势。     

唐菖蒲伯克霍尔德氏菌三种鉴定方法的比较

以食品及环境样品中初步分离的13株疑似唐菖蒲伯克霍尔德氏菌（Burkholderia gladioli）为研究对象,通过比较生理生化检 测法、基质辅助激光解析电离飞行时间质谱（MALDI-TOF-MS）法和recA序列分析法,得到快速准确鉴定唐菖蒲伯克霍尔德氏菌的方 法。 结果表明,13株疑似菌株经MALDI-TOF-MS法和recA序列分析法鉴定为唐菖蒲伯克霍尔德氏菌,而VITEK 2 COMPACT生理生 化法鉴定8株（62%）为唐菖蒲伯克霍尔德氏菌,其他5株为栖稻假单胞菌（Pseudomonas oryzihabitans）。 在唐菖蒲伯克霍尔德氏菌的鉴 定方法中,MALDI-TOF-MS法和recA序列分析法鉴定结果一致且准确,而VITEK 2 COMPACT生化检测法存在缺陷。 相比传统生理 生化鉴定方法,MALDI-TOF-MS法和recA序列分析法在唐菖蒲伯克霍尔德氏菌鉴定中更为快速、准确。     

Use of oligonucleotide array for identification of six foodborne pathogens and Pseudomonas aeruginosa grown on selective media

Identification of presumptive foodborne pathogens grown on selective media may take one to several days and requires a different battery of biochemical tests for each microorganism. A molecular identification method was developed in which universal primers were used to amplify the 16S to 23S rDNA intergenic spacer of target microorganisms, and PCR products were hybridized to a panel of species-specific oligonucleotides that were immobilized on a nylon membrane. The seven target microorganisms were Bacillus cereus, Escherichia coli, Listeria monocytogenes, Pseudomonas aeruginosa, Salmonella, Staphylococcus aureus, and Vibrio parahaemolyticus. After testing a large collection of target bacteria (29 to 51 strains) and nontarget bacteria (> 500 strains), the performances (sensitivity and specificity) of the oligonucleotide array were as follows: B. cereus (100 and 77%), E. coli (100 and 100%), L. monocytogenes (100 and 90%), P. aeruginosa (100 and 100%), Salmonella (100 and 100%), S. aureus (100 and 100%), and V. parahaemolyticus (100 and 94.2%). Other species in the B. cereus group cross-hybridized to the probes used for identification of B. cereus, and positive results should be confirmed by additional morphological observation of colonies. Listeria innocua cross-reacted with probes used to identify L. monocytogenes, but a simple hemolysis test was used to differentiate the two species. Some strains of Vibrio harveyi and Vibrio mimicus cross-hybridized with probes used for identification of V. parahaemolyticus and caused false-positive reactions. The advantage of the array is that a common protocol was used to identify the seven target microorganisms and multiple different microorganisms could be simultaneously identified on a single array.     

感官异常番茄酱和杏酱中腐败细菌的快速鉴定

目的采用微生物快速质谱鉴定法快速鉴定新疆感官异常番茄酱和杏酱中的细菌。方法对感官异常番茄酱和杏酱中的细菌进行分离培养获得9株细菌菌株,运用Vitek MS微生物快速质谱鉴定仪对分离的细菌菌株进行鉴定,同时采用VITEK2微生物鉴定仪鉴定菌株。结果番茄酱中获得的5株菌分别为:解淀粉芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、沃氏葡萄球菌、粪肠球菌;杏酱中获得的4株菌分别为巴氏葡萄球菌、粪肠球菌、沃氏葡萄球菌、浸麻类芽孢杆菌。结论本研究快速鉴定结果与化学鉴定结果基本一致。     

芽孢杆菌LWM1的分离鉴定及其对蜡样芽孢杆菌的抑制作用

从土壤样品中分离出10株芽孢杆菌（Bacillus spp.）,以蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus）为指示菌株,采用牛津杯扩散法筛选出一株具有较强抑菌活性的菌株LWM1。综合形态学、生理生化试验、基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）及16S rDNA基因序列同源性分析,菌株LWM1被初步鉴定为一株解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）,并研究了其在马铃薯葡萄糖水（PDW）和营养肉汤培养基（NB）中发酵上清液对蜡样芽孢杆菌的抑制效果。结果表明,PDW培养基更有利于菌株LWM1生长和抑菌物质产生。因此,可利用PDW培养基为主要底物大规模发酵制备菌株LWM1的抑菌物质。     

鉴定乳制品中厌氧芽胞杆菌的3种方法比较

鉴定乳制品中的革兰氏阳性厌氧芽胞杆菌。方法 采用生化鉴定、基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)鉴定和16S rDNA测序三种方法,对乳制品中5株革兰氏阳性厌氧芽胞杆菌进行鉴定。结果 生化方法鉴定出3株菌,而飞行时间质谱鉴定和16S rDNA测序法对5株菌都给出了鉴定结果。3种方法仅对其中1株菌的鉴定结果一致；飞行时间质谱鉴定和16S rDNA测序的鉴定结果一致性程度高,共有4株菌的鉴定结果一致；而生化方法的鉴定结果与这两种方法差异较大。结论 飞行时间质谱鉴定和16S rDNA测序可作为生化方法的补充,用于革兰氏阳性厌氧芽胞杆菌的快速鉴定。