条斑紫菜锰超氧化物歧化酶基因克隆与序列分析

为研究紫菜抗逆抗病的分子机制,以本实验室建立的条斑紫菜表达序列标签(EST)和全长cDNA富集文库,结合PCR技术,克隆了条斑紫菜编码锰超氧化物歧化酶(Mn-SOD)的cDNA及基因组DNA全长序列,并进行了序列特性相关分析.研究结果表明:该基因cDNA序列全长为958个核苷酸,包含一个完整Mn-SOD基因的ORF,编码224个氨基酸和终止密码子;该基因在基因组中序列长度为1416bp,包含4个外显子和3个内含子,这既不同于高等植物的6个外显子和5个内含子,也不同于人的5个外显子和4个内含子;该基因编码区密码子的平均GC含量为60.9%,第三位密码子的GC含量高达84.9%;序列中包含4个与Mn2 的结合位点及一个保守的金属结合结构域,预测分子量为24469.09Da,等电点为5.99;条斑紫菜Mn-SOD与人的相关蛋白具有类似的空间结构,都有6个跨膜α螺旋结构域;由cDNA序列推导的氨基酸序列与莱茵衣藻相似性为57.7%,系统发生分析表明条斑紫菜Mn-SOD与绿藻莱茵衣藻和硅藻海链藻的亲缘关系较近.这是该基因在红藻门中的首次报道.     

基于高光谱反射率的藻类水体基线荧光峰高度与叶绿素a浓度关系研究

采用现场实测和室内培养两种方式测定了甲藻、赤潮异弯藻、叉角藻赤潮和新月菱形藻、海洋蓝绿藻、叉鞭金藻、塔胞藻、扁藻和小球藻等非赤潮藻类光谱曲线。采用度量太阳激发的叶绿素荧光峰高度的基线荧光高度法 ,建立了不同藻类基线荧光高度与叶绿素浓度的关系。基线荧光高度法所用的 3个荧光高度波段分别为 6 6 5nm、6 80nm和86 5nm。在采用线性方程对不同藻类水体基线荧光高度与叶绿素浓度进行回归分析时 ,不同藻类产生了明显不同的结果。其中赤潮异弯藻、海洋蓝绿藻和甲藻为负相关 ,其余为正相关。在正相关的藻类中 ,小球藻最低 ,为 0 .4 6 92。结果偏差主要来自于两个方面 :一是藻类荧光峰位置变化影响 ;二是浮游植物红光和近红外波段高反射率的影响     

基于表面反射率的赤潮卫星荧光线高度算法比较

采用现场实测和室内培养两种方式测定了甲藻、赤潮异弯藻和叉角藻等赤潮藻以及新月菱形藻、海洋蓝绿藻、叉鞭金藻、塔胞藻、扁藻和小球藻等非赤潮藻类光谱曲线。采用的各卫星(MERIS,GLI,MODIS)的荧光波段数据按照其中心波长,从实际测定的高光谱反射率曲线提取而来,并按照荧光高度的计算公式得到其荧光高度。同时,采用统计分析方法建立荧光高度与叶绿素浓度的关系。10种藻类水体的荧光线高度与叶绿素α的回归分析结果显示了良好的线性关系,但部分藻种出现了负相关的结果。因为在高叶绿素浓度即赤潮条件下,浮游植物在荧光波段(685nm附近)和近红外波段(700～750nm)复杂的光谱行为,使得采用星载遥感器的叶绿素荧光波段探测某些藻类的赤潮时会出现偏差。同时,由于不同藻类的荧光高度与叶绿素浓度的关系也不一致,本文建议针对单独的赤潮种类应建立特定的荧光算法。相关问题还需要在实测的基础上进行更深入的研究。     

海带栽培品系和长海带ITS区的PCR扩增及序列分析

对遗传背景清晰且具有显著表型差异的海带6个栽培品系(CUL002,CUL860,CUL1170,CUE017,CUE018,CUL901)和长海带(L．longissia)的ITS区进行了PCR扩增和序列测定,并分析了8个种17个品系(其中7种共10株从GenBank中获得)海带之间的系统进化关系。结果表明：表型各异的6个海带栽培品系ITS区差别很小,其中ITS1 5．8S rDNA序列完全相同,部分品系间ITS2序列有个别碱基差异;进化树显示与日本海带(L．japonica,AF319018)聚在一起,相似性大于98％,其中CUL901、CUL860和CULll70的ITS序列完全相同。长海带(L．longissia)的ITS 5．8S rDNA和日本海带(L．japonica,AF319018)的完全相同。以Undaria peterseniana为外类群,根据ITS 5．8S rDNA序列构建进化树,6栽培品系及长海带与日本海带聚在一起;17株海带基本构成两个大的进化枝。研究结果揭示了我国海域栽培的长海带可能与日本海带(L．iaponica,AF319018)为同一个种。     

藻类线粒体DNA研究进展

系统地研究分析了26种藻类线粒体DNA(mtDNA)全基因组的结构特征,利用细胞色素b基因(cob)对应的氨基酸序列构建了24种藻类和10种高等植物的系统树,并结合国内外mtDNA研究成果,论述和分析了利用mtDNA进行藻类系统进化研究的进展。指出:藻类mtDNA在进化过程中分为"简化起源型"和"原始型"两种类型;根据cob基因氨基酸序列构建系统树显示,绿藻和高等植物聚为一支,而不含叶绿素b的红藻、褐藻等藻类聚为另一支。     

节旋藻硝酸盐转运蛋白基因Amnrt P序列分析

应用生物信息学软件对获得的节旋藻硝酸盐转运蛋白基因(Amnrt P)全长序列进行了结构特征、同源性比较、多序列比对、系统发育学分析等.结果表明:该基因全长为1515 个核苷酸,编码 504 个氨基酸,平均 GC 含量为43.8%,疏水氨基酸的比例为47.6%.该硝酸盐转运蛋白含有 12 个跨膜结构域(Transmembrane domains,Tm),膜拓扑结构与 NRT2 家族的类似,并发现了多个 NRT2 家族的保守序列.同源性搜索显示与属于 NRT2 基因家族的海洋蓝藻的氨基酸序列相似性为75%～89%.采用邻接法(NJ)、最大简约法(MP)和最大似然法(ML)构建了分子系统树,结果表明 3 种树的拓扑结构基本相似,并且在蓝藻中基于硝酸盐转运蛋白基因的系统发育关系与形态学分类结果相一致.所获 Amnrt P 基因属于 NRT2 基因家族,可成为蓝藻系统进化研究的分子标记,并为了解节旋藻中硝酸盐吸收与转运的基因结构和分子机制奠定了一定的基础.     

新型皱纹盘鲍防御素hd-def的cDNA序列分析、基因组克隆及表达研究

从构建的皱纹盘鲍肝肾cDNA文库中筛选到了鲍防御素基因EST.通过序列分析发现该基因的全长cDNA序列编码66个氨基酸残基,其前体由信号肽、前导肽和成熟肽组成.该前体的成熟肽含42个氨基酸(6个Cys),推测分子量为4323Da,等电点为8.02.氨基酸序列同源性分析表明,该多肽与昆虫防御素的相似性较高,最高可达70%.因成熟肽二级结构具有典型的昆虫防御素结构特征,该多肽应属于抗菌肽中的昆虫防御素亚家族,是一种新型抗菌肽,将其命名为鲍防御素hd-def.采用基因组步移法获得了全长4032bp的基因组序列.分析表明,该基因由3个内含子和4个外显子编码组成;3个内含子大小分别为497bp、2357bp和528bp,其中两个内含子存在于编码信号肽的序列中.用鳗弧菌和金黄色葡萄球菌刺激皱纹盘鲍,能诱导hd-def的表达.实验检测了5种组织,发现hd-def基因仅在肝胰腺中表达,具有明显的组织表达特异性;其表达属于诱导型表达,提示该基因可能参与皱纹盘鲍的抗细菌感染.     

茶尺蠖普通气味结合蛋白基因片段cDNA的克隆与序列分析

根据同源性设计简并性引物,采用RT-PCR方法扩增出了茶尺蠖普通气味结合蛋白GOBP1和GOBP2的基因cDNA片段,大小分别为415 bp和352 bp.测序结果在NCBI中经BLAST搜索,结果表明,两者与已报道的鳞翅目昆虫的气味结合蛋白基因片段或全长的同源性分别为79%~83%和78%~90%.根据两个核苷酸片段推导出的氨基酸残基数分别为138个和117个,均具有6个保守的半胱氨酸位点,符合典型的气味结合蛋白的特点.经BLAST搜索,与其他鳞翅目昆虫GOBP1和GOBP2氨基酸序列的同源性分别为62%~82%和76%~88%.     

栉孔扇贝脂多糖葡聚糖结合蛋白(LGBP)基因的克隆及其特征分析

作为模式识别蛋白的脂多糖葡聚糖结合蛋白(Lipopolysaccharide and beta-1,3-glucan binding protein,LGBP)在无脊椎动物的免疫系统中发挥着重要作用。本研究以鳗弧菌作为病原感染栉孔扇贝,构建全个体cDNA的质粒文库,用T3引物对文库进行随机测序得到一个667bp的cDNA片段(编号：c1305ct320cn336),它与普通蚯蚓的体腔裂解因子前体基因、海胆的β-1,3-葡聚糖酶、非洲疟蚊的革兰氏阴性细菌结合蛋白等有同源性。用T7引物对该克隆测序得到其3’末端。通过SMART-RACE技术克隆得到该克隆的全长cDNA序列。栉孔扇贝LGBP基因由1850个核苷酸组成,它有一个poly A尾巴,编码一条440个氨基酸的多肽。该多肽的分子量估计为47159．076Da,等电点为5．095。推导的氨基酸序列与蓝虾、斑节对虾、海胆、非洲疟蚊、淡水螫虾、普通蚯蚓及普通红蚯蚓等无脊椎动物模式识别蛋白具有高度的同源性。经用Garnier法预测,栉孔扇贝LGBL的二级结构包含螺旋构象10％,折叠片构象17％,转角构象21％,无规则卷曲53％,各种构象所占比例与普通红蚯蚓的体腔裂解因子前体相近。     

华根霉(Rhizopus chinensis)前导肽脂肪酶基因的克隆及其在Pichia pastoris中的表达

通过3次PCR程序克隆得到了华根霉(Rhizopus chinensis CCTCCM201021)脂肪酶全基因序列,该基因的开放阅读框长1170bp,不含内含子,编码一个389个氨基酸残基的蛋白质,包括26个氨基酸的信号肽,94个氨基酸的前导序列和269个氨基酸的成熟肽,其推断的氨基酸序列与一些已报道的根霉脂肪酶序列同源性为86%.在巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115中分泌表达前导肽序列.SDS-PAGE分析表明表达蛋白的分子量约37kD.N-端氨基酸序列分析表明该重组蛋白分泌过程中前导序列N-端的67个氨基酸被切割掉,表达的重组脂肪酶由前导序列C-端的27个氨基酸和成熟肽的269个氨基酸组成.发酵132h后上清中重组脂肪酶的表达量最高,蛋白含量约5.4mg/mL,橄榄油乳化法测水解酶活为161U/mL,其比活比野生型华根霉脂肪酶高约43倍.     

致病性鳗弧菌金属蛋白酶基因克隆及序列分析

从我国山东沿海发病的鲈鱼（Lateolabrax japonicus）分离到一株致病性鳗弧菌（Vibrio anguillarum）W-1，该菌的胞外蛋白酶活性为4226u/ml，部分纯化的胞外蛋白酶对海水养殖大菱鲆鱼有一定的毒性。应用PCR扩增，从鳗弧菌W-1染色体DNA扩增出一条长约1.925kb的特异性PCR产物，DNA序列分析表明：克隆的片段含有完整的金属蛋白酶基因阅读框，编码611个氨基酸残基的蛋白质，该金属蛋白酶基因与一株致病性鳗弧菌蛋白酶基因的核苷酸及氨基酸序列同源性为100%，而与解蛋白弧菌（V.proteolyticus)、创作弧菌（V.vulnificus）、霍乱弧菌（V.cholerae)、斑点气单胞菌（Aeromonas punctata），嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila）的氨基酸序列同源性分别为73%、70%、69%、53%、51%。     

大熊猫朊病毒基因克隆与序列分析

根据已报道的哺乳动物朊病毒基因序列设计引物对,采用PCR方法扩增了大熊猫的朊病毒基因,将其克隆到T-Easy载体,序列测定及分析表明所克隆的大熊猫PRNP基因(GeneBank收录号为AF327449)片段为795bp,编码264个氨基酸的前体蛋白,推测其分子量约28．5ku。与已报道的牛(GeneBank收录号为AF455119)、绵羊(GeneBank收录号为AF367623)的相应序列作比较分析,核苷酸序列同源性分别为99％和83％,其编码的氨基酸同源性均为100％。在所克隆的大熊猫PRNP基因中未发现与朊病毒敏感性连锁的氨基酸多态性位点。     

栉孔扇贝热休克蛋白70基因Cdna的克隆与分析

应用表达序列标签法，获得了栉孔扇贝HSP70基因cDNA的部分序列，然后利用锚定PCR技术克隆到了该基因的全长cDNA。克隆到的HSP70 cDNA全长2553bp，编码区全长1902bp，可以编码634个氨基酸。Blast分析表明该序列与其他生物的HSP70基因具有很高的相似性。在该cDNA序列编码的氨基酸序列中含有3个HSP70家族的特征模体，结合Blast分析的结果，可以确认所获得的cDNA序列是栉孔扇贝HSP70的编码序列。该基因的克隆为进一步深入研究栉孔扇贝的抗逆机理以及指导扇贝的遗传选育和遗传改良都具有重要的理论意义。     

Dioxin-binding pentapeptide for use in a high-sensitivity on-bead detection assay

The purpose of this study is to develop a dioxin detection method using a short peptide alternative to an immunoantibody. A full peptide library consisting of 2.5 million possible amino acid combinations was constructed by a solid-phase split synthesis approach using 19 natural amino acids. The peptide beads were subjected to a competitive binding assay between 2,3,7-trichlorodibenzo-p-dioxin and N-NBD-3-(3',4'-dichlorophenoxy)-1-propylamine (NBD-DCPPA) in a buffer containing 20% 1,4-dioxane. Two almost identical pentapeptides, FLDQI and FLDQV, that could bind dioxin were screened from the combinatorial library. NBD-DCPPA and the peptide synthesized on resin beads could be utilized to determine dioxin concentrations. The fluorescence intensity of the beads was measured using fluorescence microscopy to make a calibration curve for the dioxin concentrations. 2,3,7,8-Tetrachlorodibenzo-p-dioxin (2,3,7,8-TeCDD) could also detected in the presence of 30% 1,4-dioxane. To optimize the peptide sequence, a one-amino acid-substituted library was prepared using amino acids including nonnatural amino acids. The internal amino acids, LDQ, could not be substituted by any other amino acids. This result indicates that these three side chains are essential to recognize dioxins. The peptide C terminus substituted by phenylglycine showed a 10 times lower detection limit of 2,3,7,8-TeCDD of 150 pM (50 pg/mL) than the original sequence FLDQV. The cross reactivity of the dioxin binding peptides including the secondary derivatives was investigated. Some polycyclic aromatic hydrocarbons bound to the peptide beads, but nonchlorinated dibenzo-p-dioxin and PCB did not. From these results, we demonstrate the potential of short peptides as a practical sensor material targeting low molecular weight compounds such as dioxin.     

从鳗弧菌M3 Fosmid文库筛选aroA基因

为克隆鳗弧菌aroA基因 (它在细菌中编码合成芳香族氨基酸的关键酶--5-烯醇氏丙酮酰莽草酸3-磷酸(EPSP)合成酶),在实验室中构建了鳗弧菌M3大分子量基因组Fosmid文库,并通过克隆测序获得了部分序列,以此为基础,通过延伸测序获得了ar oA基因序列全长. 该基因全长1281bp,编码427个氨基酸,包含一个11个氨基酸残基的信号肽;编码区GC平均含量为46.8%,推测分子量为46177 Da.相似性分析表明,鳗弧菌的aroA核苷酸和氨基酸序列与其他弧菌的相似性最高,分别在73%～75%和78%～82%;进化树结果也表明鳗弧菌ar oA与其他弧菌的亲缘关系最近.aroA基因的克隆为构建鳗弧菌弱毒疫苗奠定了基础.     

栉孔扇贝C型凝集素基因的克隆与表达研究

C型凝集素作为凝集素家族中的主要成员之一,在识别外来微生物表面碳水化合物基团和激活体液中免疫因子等方面具有重要作用。本研究在EST分析的基础上采用锚定PCR方法克隆得到了该基因的全长cDNA。克隆得到的栉孔扇贝C型凝集素cDNA全长1038bp,编码区684bp,可以编码228个氨基酸。在该编码的氨基酸序列中发现了C型凝集素家族的特征模体和一个C型凝集素的结构域(C-type leetin domain,CTLD)。通过Clustalw和SMART分析在该序列中发现了形成二硫键的4个保守的半胱氨酸,与其他物种C型凝集素的二硫键结构非常相似。结合BLAST分析的结果,可以确认所获得的cDNA序列是栉孔扇贝C型凝集素的编码序列。用RT-PCR技术在鳗弧菌感染前后的血细胞中均可以检测到该基因的表达,但病原刺激前的表达水平相对较低,病原刺激后4h起表达开始升高,并在6h达到最高,随后逐渐开始下降,并于32h恢复到原来水平,该结果表明C型凝集素存在组成型和诱导型两种调控机制,在扇贝防御病原感染的过程中发挥重要作用。     

植物抗体基因工程：Ⅳ．马铃薯Y病毒小鼠中和抗体重链基因的序列分析及其植物表达

序列分析表明，马铃薯Ｙ病毒小鼠中和抗体重链基因（Ｇ９）全长为１５０５个核苷酸碱基（不包括Ｐｏｌｙ（Ａ）尾巴），其中包括５＇端非编码区１６个核苷酸碱基、编码重链信号肽的５７个核苷酸碱基、编码成熟蛋白的１３２９个核苷酸碱基和３＇端非编码区的１０３个核苷酸碱基。与已知的小鼠抗体Ｍｏｐｃ２１的重链基因（γ１）相比，核苷酸的序列同源性为９４．４％，由核苷酸序列所推导出的氨基酸序列同源性为９２．６％，其中可变区内（ＶＨ）的氨基酸序列同源性达７４．５％，这表明二者起源于同一种系基因。将完整的抗体重链基因正向插入植物表达载体ｐＢⅠ１２１中的原ＧＵＳ基因位置上，置于花椰莱花叶病毒３５Ｓ启动子控制之下，获得了能够在植物细胞内表达马铃薯Ｙ病毒中和抗体重链基因的植物表达载体ｐＹＨ。