THI3/BAT2基因缺失酿酒酵母菌构建及其在黄酒酿造中的应用

为探究酿酒酵母支链氨基酸转氨酶编码基因（BAT2基因）和类丙酮酸脱羧酶编码基因（THI3基因）的缺失对黄酒中高级醇的影响,以酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）菌XF1的单倍体XF1a7/XF1α6和THI3基因缺失菌XF1-T的单倍体XF1a7-T/XF1α6-T为原始菌,采用Cre/loxP重组系统构建了BAT2单基因缺失和THI3/BAT2双基因缺失的双倍体酵母重组菌XF1-B和XF1-TB。将XF1、XF1-B和XF1-TB进行黄酒发酵,实验结果表明,重组菌XF1-B、XF1-TB与原始菌XF1的生长性能相似、发酵性能无差异,重组菌XF1-B、XF1-TB酿造黄酒的异戊醇分别降低了18.12%、26.06%,异丁醇分别降低了35.21%、18.83%,正丙醇分别提高了15.42%、32.75%,总高级醇分别为269.59 mg/L、270.77 mg/L,分别降低了15.65%、15.28%。XF1-B和XF1-TB酿造黄酒中异戊醇/异丁醇比值分别为3.24和2.34,降低了27.78%。综上,重组菌XF1-B和XF1-TB都有效降低了黄酒中总高级醇含量,而且XF1-TB与XF1-B相比异戊醇/异丁醇比值显著降低,这能够降低黄酒“上头”的醉度,有效提高黄酒品质。     

BAT2缺失酿酒酵母基因工程安全菌株的构建及其杂交育种

为了获得低产高级醇基因工程安全菌株,首先将带有Cre重组酶编码基因的pGAPZA质粒转入BAT2缺失单倍体突变株A8-B和C22-B中,利用Cre/loxp系统去除G418抗性基因(KanMX),获得酿酒酵母单倍体突变株ΔBAT2a和ΔBAT2α。然后将这2株单倍体杂交成双倍体菌株ΔBAT2,该菌株具有良好的遗传稳定性。以野生菌株AY15和2株单倍体出发菌株为对照,对基因工程安全菌株进行白酒发酵试验,实验结果显示,基因工程安全菌株ΔBAT2与出发菌株相比,CO2失重高,残糖低,乙醇含量高;与野生菌株AY15相比,异丁醇、异戊醇、总高级醇生成量分别降低50.00%、33.40%和30.57%。     

一次敲除BAT2同时过表达Lg-ATF1对啤酒酵母产醇酯的影响

乙酸乙酯和高级醇是啤酒中的重要风味物质,为了探究BAT2基因和Lg-ATF1基因对啤酒酵母产醇酯能力的影响,进而解决啤酒中存在的醇高酯低的问题。本研究通过酶切连接法构建重组质粒p UC-PLABBK,采用醋酸锂转化法和胞内同源重组技术,以多倍体啤酒酵母菌株S5为出发菌株,Kan MX基因作为筛选标记,最终获得过量表达Lg-ATF1基因同时敲除BAT2基因的重组菌株S5-Lg。通过啤酒发酵实验和数字PCR探究重组酵母菌株S5-Lg与出发菌株S5醇酯含量与相关基因表达量的变化。结果显示,与出发菌株相比,S5-Lg的总高级醇生成量降低9.12%,其中异丁醇和异戊醇的生成量分别降低了10.63%和9.55%,乙酸乙酯生成量提升了26.81%,BAT2基因表达量降低45.72%,Lg-ATF1基因表达量大幅提升。BAT2基因和Lg-ATF1基因可以影响啤酒酵母产生高级醇和乙酸乙酯的含量,对改善啤酒风味有重要参考意义。     

BAT2基因缺失葡萄酒酵母的构建及其对葡萄酒高级醇的影响

该研究以葡萄酒酵母BV-0为出发菌,利用融合聚合酶链式反应（PCR）构建BAT2基因敲除组件,通过电转化导入菌株BV-0进行同源重组,获得BAT2单等位基因敲除菌株BV-bk;再由菌株BV-bk产孢分离出两种不同配型的单倍体BAT2基因敲除菌进行杂交融合,获得BAT2双等位基因敲除菌株BV-BK;最后利用Cre/loxP重组系统去除菌株BV-bk、BV-BK的KanMX抗性基因得到菌株BV-b、BV-B。采用菌株BV-0、BV-b及BV-B分别发酵葡萄酒,并测定葡萄酒的基本理化指标及高级醇含量。结果表明,与出发菌株BV-0相比,菌株BV-b和BV-B发酵的葡萄酒的基本理化指标基本一致,异丁醇含量分别下降14.9%、67.0%,异戊醇含量分别下降17.87%、31.10%,且菌株BV-B发酵葡萄酒中正丙醇含量上升36.55%,说明两株BAT2基因敲除菌株可应用于葡萄酒发酵中以降低异丁醇和异戊醇含量,从而降低葡萄酒的苦味和醉度,具有潜在的工业应用价值。     

酿酒酵母苏氨酸合成酶缺失对高级醇生成量的影响

通过构建酿酒酵母苏氨酸合成酶基因(THR4)缺失的工程菌株,研究该基因对酿酒酵母高级醇生成量的影响。以质粒pUC-19为载体,KanMX抗性基因为筛选标记,构建了重组质粒pUC-TABK,经PCR扩增得到YAKanMX-YB重组盒,并以酿酒酵母AY15单倍体α5为出发菌株,通过醋酸锂转化和G418抗性筛选,获得THR4基因缺失的突变株α5-T7。将转化子和亲本菌株分别进行模拟酒精发酵及酒精浓醪发酵,发酵结束后进行发酵性能和高级醇生成量的测定。结果显示,与亲本菌株相比,突变株正丙醇生成量分别提高了1.61倍和2.6倍,异戊醇生成量分别提高了0.27倍和0.24倍,而异丁醇生成量没有明显差异,表明THR4基因缺失会使酿酒酵母高级醇特别是正丙醇生成量提高。     

LEU1基因缺失对酿酒酵母高级醇生成量的影响

LEU1基因编码异丙基苹果酸合成酶,为了研究该基因对酿酒酵母高级醇生成量的影响,以酿酒酵母AY15单倍体A8为出发菌株,通过构建重组质粒p UC-LABK获得LA-Kan MX-LB重组盒,并利用醋酸锂转化法和同源重组技术,筛选出LEU1基因缺失的突变株A-L9。将突变株和亲本菌株分别进行酒精发酵实验,发酵结束后进行发酵性能和高级醇生成量的测定。两种发酵条件下的实验结果表明,与亲本菌株相比,突变株的正丙醇生成量分别提高了0.18倍和0.47倍,异丁醇的生成量分别提高了0.52倍和1.58倍,而异戊醇的生成量则分别降低了0.29倍和0.51倍。     

ATF1过表达和BAT2敲除酿酒酵母发酵性能的研究

以啤酒酵母工业菌株S5为对照,对过表达醇乙酰基转移酶编码基因ATF1同时敲除氨基酸转氨酶编码基因BAT2酿酒酵母工程菌株S5-1进行发酵性能的研究。结果表明,与出发菌株相比,突变株生长状况、发酵速度、酒精度等基本发酵性能没有明显变化,而突变株发酵后的乙酸酯总量有较大程度的提升,为85.44mg/L,提高了6.96倍,高级醇总量有较大程度的下降,为79.25mg/L,降低了27.28%。研究结果为啤酒风味的改善奠定了良好的基础。     

提高乙酸耐受性酿酒酵母JJJ1突变株构建及转录组学分析

目的 构建JJJ1突变株以提高酿酒酵母在发酵过程中的乙酸耐受性,提高发酵效率。方法 本研究采用CRISPR-Cas9基因编辑技术构建酿酒酵母JJJ1Δ突变株,检测突变对酿酒酵母菌株的乙酸耐受性影响,基于转录组学分析突变株耐受乙酸的分子机制。结果 在含有5 g/L乙酸的液体培养基中,酿酒酵母JJJ1Δ存活率是野生型菌株的4.44倍,发酵72 h后酿酒酵母突变株JJJ1Δ的细胞生物量是野生型菌株的1.15倍,酿酒酵母JJJ1Δ的生长延滞期比野生型菌株缩短了30 h;转录组学研究表明,敲除JJJ1基因增强酿酒酵母的代谢、生物调控、膜流动性以及转运活性和电子转移活性,减少酿酒酵母细胞生理过程、细胞连接和拟核功能以及细胞结合功能。结论 敲除JJJ1基因的酿酒酵母突变株通过提高能量代谢和氨基酸合成,降低核糖体生物发生减少细胞生理活动,增强酿酒酵母菌株乙酸耐受性。     

酿酒酵母高级醇合成路径及关键基因

高级醇是在酒精发酵过程中由酿酒酵母代谢产生,在酿酒酵母细胞质和线粒体中由基因编码相关的酶催化α-酮酸脱羧还原而成,是酒的重要香气成分,对酒的香气和口感有重要影响。该文综述了高级醇代谢的相关途径及部分关键基因及功能,以期深入分析了解高级醇并为通过分子生物学方式构建适用于工业生产的低产高级醇的酵母菌株提供理论参考。     

本土酿酒酵母发酵进程中异戊醇的合成代谢

为解析酿酒酵母发酵进程中的异戊醇合成代谢规律,以本土酿酒酵母LFE1225为对象,模拟葡萄汁发酵,分析其在发酵对数前期、对数中期和对数末期的异戊醇产量及合成速率、氮源利用情况、转录组学差异等。结果显示:异戊醇合成与积累主要发生在对数期;发酵初始阶段异戊醇合成速率最大,其与乙醇合成速率、高级醇合成速率、糖消耗速率呈极显著的正相关。酿酒酵母LFE1225在发酵初始阶段大量利用YAN,并合成一定量的亮氨酸;进入对数期后,亮氨酸被快速利用。发酵对数期内,酿酒酵母LFE1225的LEU2、BAT1/2、ILV5、LEU9、PDC6、THI3、ADH6等异戊醇代谢相关基因的表达下调,与该时期异戊醇合成速率降低的趋势一致;BAP2、ILV2、PDC1和SFA1等4个异戊醇代谢相关基因与GAT1、ADR1、UPC2、GCN4、RPN4、RFX1、CUP2、RIM101、RLM1、SUM1、TYE7、GAL4、RME1和USV1等14个转录因子具有相同的转录表达趋势,这些转录因子可能参与酿酒酵母LFE1225异戊醇代谢的调控。本研究为深入了解酿酒酵母异戊醇的代谢机制提供了参考,为低产/高产异戊醇菌株的定向育种提供依据。     

Hypolipidemic and Anti-Obesity Effect of Anserine on Mice Orally Administered with High-Fat Diet via Regulating SREBP-1, NLRP3, and UCP-1

To investigate the efficacy of anserine on antiobesity, C57BL/6 mice are orally administered with a high-fat diet (HFD) and different doses of anserine (60, 120, and 240 mg/kg/day) for 16 weeks. Body weight, lipid, and epididymal fat content in mice are measured, and their liver damage is observed. The results display that the body weight, epididymal fat content, and low-density lipoprotein cholesterol (LDL-C) content in anserine groups are decreased by 4.36–18.71%, 7.57–35.12%, and 24.32–44.40%, respectively. To further investigate the antiobesity mechanism of anserine, the expression of SREBP-1, NLRP3, NF-κB p65 (p65), and p-NF-κB p65 (p-p65) proteins in the liver and peroxisome proliferator-activated receptor gamma coactivator 1α (PGC1-α) and UCP-1 proteins in brown adipose tissue (BAT) is analyzed by Western blot. Results show that anserine can significantly decrease the expression of the NLRP3, p65, p-p65, and the SREBP-1 proteins and increase the expression of the PGC1-α and UCP-1 proteins. This study demonstrates that anserine lowered blood lipids and prevented obesity; its antiobesity mechanism may be related to the activation of brown fat by inflammation.     

BAT与BOC模式的CO2压缩制冷机组的比较与改进

对BAT与BOC两种模式的CO2压缩机和制冷机组的工作原理、性能进行了分析比较,并提出了BAT模式的压缩机的改进措施:将L型压缩机改为D型压缩机,由3级压缩改为同一台压缩机的高压级压缩和低压级压缩;制冷系统的改进措施:将冷凝后的CO2液体储存在集液器内,通过压差返回工艺罐。     

基于16S rRNA基因与相关基因序列分析格氏乳球菌亲缘关系

通过PCR扩增7株分离自传统发酵乳制品中的格氏乳球菌的dnaA、rpoB、recA基因,将扩增产物测序,测得的序列构建系统发育树,进行分类鉴定.同时,比较了这三个基因位点与16S rRNA基因揭示的格氏乳球菌种内菌株间以及其与乳酸乳球菌种间的亲缘关系的远近.结果表明,dnaA、rpoB、recA基因能够有效的鉴定出格氏乳球菌,且比16S rRNA基因更清晰地揭示了格氏乳球菌菌株间以及其与乳酸乳球菌种间的亲缘关系,特别是将3个管家基因联合起来,亲缘关系更明确,验证了多个管家基因是研究细菌亲缘关系的有力工具.     

金黄色葡萄球菌生物被膜基因型的分子鉴定

本文选用常见的典型食源性微生物金黄色葡萄球菌,从食品微生物安全角度出发,采用生物被膜菌落结晶紫染色法定量检测58株金黄色葡萄球菌菌株生物被膜的形成能力。并对金黄色葡萄球菌生物被膜相关基因型进行分型研究,包括ica调控子分型(ica A、ica D、ica BC)与粘附特性分型(agr、atl E和aap)研究。结果显示,所有检测菌株均能生成生物被膜,其中3株能生成强粘附性生物被膜,占5.2%;生成中等生物被膜能力菌株有23株,占39.7%;32株金黄色葡萄球菌生成弱粘附生物被膜,占55.2%。实验所用的58株菌株中有48株能扩增出ica A基因,56株扩增出ica D基因,57株扩增出ica BC基因,56株扩增出agr,分别有53株和57株染色体中存在aap和atl E基因。本实验的结论:ica操纵子为金黄色葡萄球菌生物被膜形成所必须,aap基因可能作为促进金黄色葡萄球菌生物被膜形成的一个独立因素。而atl E,agr基因是金黄色葡萄球菌生物被膜粘附过程中形成所必须的调节因子。     

Evolutionary journey and characterisation of a novel pan-gene associated with beer strains of Saccharomyces cerevisiae

The sequencing of over a thousand Saccharomyces cerevisiae genomes revealed a complex pangenome. Over one third of the discovered genes are not present in the S. cerevisiae core genome but instead are often restricted to a subset of yeast isolates and thus may be important for adaptation to specific environmental niches. We refer to these genes as “pan-genes,” being part of the pangenome but not the core genome. Here, we describe the evolutionary journey and characterisation of a novel pan-gene, originally named hypothetical (HYPO) open-reading frame. Phylogenetic analysis reveals that HYPO has been predominantly retained in S. cerevisiae strains associated with brewing but has been repeatedly lost in most other fungal species during evolution. There is also evidence that HYPO was horizontally transferred at least once, from S. cerevisiae to Saccharomyces paradoxus. The phylogenetic analysis of HYPO exemplifies the complexity and intricacy of evolutionary trajectories of genes within the S. cerevisiae pangenome. To examine possible functions for Hypo, we overexpressed a HYPO-GFP fusion protein in both S. cerevisiae and Saccharomyces pastorianus. The protein localised to the plasma membrane where it accumulated initially in distinct foci. Time-lapse fluorescent imaging revealed that when cells are grown in wort, Hypo-gfp fluorescence spreads throughout the membrane during cell growth. The overexpression of Hypo-gfp in S. cerevisiae or S. pastorianus strains did not significantly alter cell growth in medium-containing glucose, maltose, maltotriose, or wort at different concentrations.