野生嗜杀白假丝酵母LFA418的产毒条件优化及其毒素粗提物特性

对1株分离自新疆楼兰葡萄酒厂野生白假丝酵母(Candida albicans)LFA418的嗜杀特征及其粗毒素特性进行研究。结果显示,C.albicans LFA418具有致死克鲁维毕赤酵母(Pichia kluyveri)、贝酵母(Saccharomyces bayanus)、Lachancea thermotolerans和葡萄牙假丝酵母(Candida lusitaniae)的嗜杀性。接种体积分数7%C.albicans LFA418到YEPD液体培养基中,25℃培养32 h,可以获得最大产量的嗜杀毒素;利用截留分子质量为8 000 D的透析袋制备的粗毒素,在温度分别-20、4℃时pH 4.2~4.6和pH 4.2时温度4~20℃具有嗜杀活性的稳定性。     

梅鹿辄葡萄自然发酵酵母菌群研究

利用WL营养培养基对梅鹿辄葡萄自然发酵过程中分离到的98株酵母菌进行初步鉴定,进而对代表性的菌株进行5.8S rDNA-ITS区PCR产物的限制性内切酶酶切分析.结果表明,供试的98株酵母菌属于3属3个种,分别为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、东方伊萨酵母(Issatchenkia orientalis)、克鲁维毕赤酵母(Pichia kluyver),3种酵母菌分别占分离自该葡萄品种总酵母菌株的80.61％、13.26％、6.13％.在自然发酵的初期和中期,酵母菌的比例因是否添加SO2而有所差异,但发酵末期均以S.cerevisiae为优势菌.     

东方伊萨酵母羧酸转运蛋白基因的表达及功能验证

生物降酸是现代果酒绿色酿造的重要发展方向,目前关于部分羧酸转运蛋白及其转运调控机制仍不完整,严重限制了高效降酸菌株的定向选育。本试验以1株自主筛选的具有良好降酸能力的东方伊萨酵母GS1-1为材料,对其羧酸转运蛋白基因进行表达及功能验证。首先,利用NCBI上已有东方伊萨酵母基因组序列与被证明为不同羧酸转运蛋白的编码基因进行BLAST比对,获得5条候选羧酸转运蛋白基因,利用生物信息学进行基因比对、跨膜螺旋预测、构建系统进化树,并采用绿色荧光蛋白定位。构建单倍体酿酒酵母BY4741 ADY2、JEN1羧酸转运蛋白双缺失工程菌,将含候选片段的质粒在酿酒酵母中进行表型验证及特异性验证,发现目的片段4(OUT23260.1)为苹果酸羧酸转运蛋白,目的片段1(XP_029319440.1)是柠檬酸转运蛋白,目的片段发挥功能区域定位于酵母细胞膜上。本研究为探索发酵工程领域中非酿酒酵母降酸机理提供参考。     

鲜食红地球葡萄蒸馏酒的酿造工艺研究

目的:以新鲜红地球葡萄为原料,选用发酵温度、酵母菌种、浸渍条件和是否添加辅料4个因素,探究不同发酵条件对红地球葡萄蒸馏酒品质的影响。方法:设置不同发酵温度(高温25 ℃,低温15 ℃)、接种发酵与自然发酵、浸渍与清汁发酵、添加辅料与不加辅料4组变量,设计12组影响因素试验组合,并组成20组单因素对比实验,研究单因素变化条件下红地球发酵原酒及蒸馏酒的理化指标以及酯类、酸类、酚类、醛类等香气物质的差异,以期对红地球葡萄蒸馏酒的酿造工艺条件进行优化。结果:红地球葡萄在较低的温度和浸渍作用下进行自然发酵,在添加辅料时所得蒸馏酒总酯含量及酸含量较高,高级醇含量相对较低,具有良好的风味和光泽度,蒸馏酒品质良好,香气均衡。结论:蒸馏酒的基酒在发酵过程中受到酵母添加、浸渍作用、发酵温度和添加辅料等多种工艺因素的影响。本试验所得最佳酿造工艺以期解决目前红地球葡萄产量过剩、大量堆积、储藏困难等问题,助力我国葡萄酒产业的经济发展。     

黑比诺葡萄接种发酵过程酵母菌的变化监控

采用WL营养琼脂培养基和Interdella指纹图谱分析以及UPGMA聚类分析,对接种工业酵母RC212的黑比诺葡萄酒发酵过程中分离的63株酵母进行种类区分与鉴定,并对其中的49株酿酒酵母单菌落进行菌株区分,以监控发酵过程中酵母菌的种类和动态变化,明确工业酵母是否主导发酵过程,探讨野生酿酒酵母与工业酵母之间的竞争性,为葡萄酒发酵过程中的微生物控制提供依据.结果表明,接种发酵过程中共分离得4种不同培养类型的酵母菌,分别是葡萄汁有孢汉逊酵母(Hanseniaspora uvarum)、美极梅奇酵母(Metschnikowia pulcherrima)、红冬孢酵母(Rhodotorula mucilaqinosa)和酿酒酵母(Soccharomyces cerevisiae).用Interdelta指纹图谱将酿酒酵母区分为3种基因型,包括2种野生酿酒酵母和已接种的工业酵母RC212.工业酵母在发酵初、中、后期分别占酿酒酵母的6.25%、18.75%、100%.工业酵母在发酵末期才成为发酵优势菌,野生酿酒酵母在发酵初期和中期都位据优势地位,表现出很强的竞争力.     

葡萄酒高级醇检测方法的优化及其在本土酿酒酵母筛选中的应用

该研究在国标GB/T 5009.48—2003《蒸馏酒与配制酒卫生标准的分析方法》的基础上,建立起一种显色稳定、准确性更高的高级醇检测法。结果表明,当葡萄酒酒样在梯度稀释20倍,加样静置1 min,80 ℃水浴30 min且以50%硫酸溶液作为稀释剂的条件下进行检测,精密度试验结果相对标准偏差（RSD）为1.665%,加标回收率为99.11%,均优于国标法;采用气质联用（GC-MS）法对6株本土酵母产高级醇含量进行对比检测,结果显示所测总量无显著差异（P＞0.05）,证明优化法较为准确、可靠。该研究筛选获得了两株低产高级醇菌株LFP529和LFP525,其发酵酒的高级醇含量较对照分别降低了55.44%、58.31%,为解决我国部分产区葡萄酒高级醇含量较高提供了解决方案。     

宁夏甘城子小产区梅鹿辄葡萄酒品质提升的研究

为提升甘城子小产区梅鹿辄葡萄酒的品质,针对影响其质量的四个关键点（分选方式、发酵容器、冷浸渍、循环方式）进行研究。以宁夏甘城子小产区梅鹿辄葡萄为原料,分别进行粒选及穗选,随后对原料进行96 h冷浸渍处理,分别在5 m3小型发酵罐、50 m3直式发酵罐和65 m3嘉尼米德发酵罐中进行酒精发酵,并分别辅助人工压帽、酒泵循环、气体压帽3种循环方式。结果表明,粒选可使原料糖酸比提高至53.8;冷浸渍可提升葡萄酒的色度和单宁含量;5 m3发酵罐配合人工压帽可增加葡萄酒单宁的细腻感。原料经粒选、96 h的冷浸渍后,在5 m3发酵罐中进行发酵,并辅助人工压帽,按照上述工艺生产出的梅鹿辄葡萄酒果香浓郁,单宁口感细腻,感官评分为（90.3±5.2）分。     

丝氨酸对葡萄酒酿造过程中酿酒酵母产H2S的形成研究

为探究丝氨酸对葡萄酒酿造过程中酿酒酵母产H2S的影响,以自主筛选的本土酿酒酵母32y12为研究对象,分别在正常氮源（300 mg N/L）和低浓度氮源（150 mg N/L）条件下,比较了外源丝氨酸的添加对酿酒酵母32y12发酵过程中产H2S的影响。结果显示,相对于正常氮源水平,低氮条件下外源添加140.8 mg/L（5倍）和281.5 mg/L（10倍）丝氨酸时,H2S释放量显著增加,分别达到573.1 μL/L和798.6 μL/L。为了进一步研究酵母自身丝氨酸合成对H2S产生的影响,借助Cre-Loxp系统敲除了丝氨酸合成关键基因SER33,结果发现在不同氮源水平下,基因SER33的敲除均显著降低H2S产量（P＜0.05）,并且外源添加不同浓度丝氨酸也并不会显著增加基因SER33敲除菌株的H2S释放量（P＞0.05）。该结果为工业生产中针对低氮葡萄原料选择发酵助剂提供了理论支持。     

酿酒酵母单倍体的分离及其产高级醇和乙酯类化合物的特性

为了获得低产高级醇和高产乙酯类化合物的单倍体酿酒酵母。对5株野生二倍体酿酒酵母菌株进行随机孢子分离获得单倍体后代,并通过Triple M模拟汁发酵,对其单倍体的高级醇和乙酯类物质产量进行研究。结果表明:5株野生酿酒酵母在KAc产孢培养基上的产孢率均高于50%。与二倍体亲本相比,单倍体菌株的高级醇和乙酯类化合物的产量发生显著改变,产高级醇和乙酯类化合物特性在单倍体后代中发生性状分离。单倍体酿酒酵母中,31y3-15高级醇产量最低,为135.3 mg/L,31y3-29和174y1-26的乙酯类物质生成量均高于650mg/L。研究获得的单倍体酿酒酵母,为研究酿酒酵母产高级醇和产酯特性的遗传基础,以及杂交育种提供了重要材料。     

本土酿酒酵母发酵进程中异戊醇的合成代谢

为解析酿酒酵母发酵进程中的异戊醇合成代谢规律,以本土酿酒酵母LFE1225为对象,模拟葡萄汁发酵,分析其在发酵对数前期、对数中期和对数末期的异戊醇产量及合成速率、氮源利用情况、转录组学差异等。结果显示:异戊醇合成与积累主要发生在对数期;发酵初始阶段异戊醇合成速率最大,其与乙醇合成速率、高级醇合成速率、糖消耗速率呈极显著的正相关。酿酒酵母LFE1225在发酵初始阶段大量利用YAN,并合成一定量的亮氨酸;进入对数期后,亮氨酸被快速利用。发酵对数期内,酿酒酵母LFE1225的LEU2、BAT1/2、ILV5、LEU9、PDC6、THI3、ADH6等异戊醇代谢相关基因的表达下调,与该时期异戊醇合成速率降低的趋势一致;BAP2、ILV2、PDC1和SFA1等4个异戊醇代谢相关基因与GAT1、ADR1、UPC2、GCN4、RPN4、RFX1、CUP2、RIM101、RLM1、SUM1、TYE7、GAL4、RME1和USV1等14个转录因子具有相同的转录表达趋势,这些转录因子可能参与酿酒酵母LFE1225异戊醇代谢的调控。本研究为深入了解酿酒酵母异戊醇的代谢机制提供了参考,为低产/高产异戊醇菌株的定向育种提供依据。