海蚯蚓蛋白酶基因的原核表达及其抗肿瘤活性

目的原核表达海蚯蚓蛋白酶基因,探讨其对肿瘤细胞增殖的抑制作用。方法根据环节动物门蚯蚓和单环刺螠丝氨酸蛋白酶c DNA序列多重比对获得的保守序列设计引物,从海蚯蚓肠道组织提取总RNA,经3′RACE和5′RACE技术分别克隆海蚯蚓蛋白酶c DNA序列的3′端和5′端,并进行拼接,对其编码的蛋白质作生物信息学分析;将海蚯蚓蛋白酶成熟肽的编码序列亚克隆至原核表达载体p ET-21a(+),转化大肠埃希菌BL21(DE3)进行诱导表达,采用组氨酸亲和层析柱纯化;MTT法检测重组蛋白的抗肿瘤活性。结果经3′端RACE技术获得约250 bp的海蚯蚓蛋白酶基因c DNA 3′端序列,再经5′RACE技术扩增获得约770 bp的c DNA 5′端序列,拼接可得海蚯蚓蛋白酶c DNA序列全长为880 bp,其编码蛋白含270个氨基酸,具有高度保守的GDSGGP序列;重组蛋白相对分子质量为27 000,主要以包涵体形式表达,约占菌体总蛋白的30%,上清纯化后纯度可达95%;重组蛋白酶对人肿瘤细胞增殖具有明显的抑制作用。结论原核表达了海蚯蚓蛋白酶,可明显抑制人肿瘤细胞的增殖,为抗肿瘤基因工程药物的研发提供了实验依据。     

人Leptin基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

目的克隆Leptin基因,构建其重组表达菌株,并对表达产物进行免疫学鉴定。方法利用RT-PCR方法从脂肪细胞RNA中扩增出人瘦素前体(pre-Leptin)的cDNA片段和去信号肽序列的Leptin成熟基因片段,并插入pET32a中,转化大肠杆菌BL21(DE3),获得表达重组人瘦素(rh-Leptin)的菌株。结果DNA序列分析显示获得的pre-Leptin和成熟基因片段的序列与预计序列一致,菌株诱导后经SDS-PAGE检测,rh-Leptin表达量达菌体总蛋白的40%以上。Western blot分析显示重组Lep-tin具有免疫学活性。结论已获得高效表达Leptin的重组菌株。     

以长链PCR为基础利用融合PCR扩增乙型脑炎病毒全长cDNA

目的以长链PCR(Long-PCR)技术为基础,应用融合PCR方法扩增乙型脑炎病毒(JEV)全长基因组。方法根据GenBank中收录的JEV全长基因组序列设计引物,分别扩增JEVSA14-14-2株的5′和3′半长分子,在5′端上游引物中引入T7启动子核心序列。利用细胞培养增殖病毒,提取病毒RNA,逆转录后采用Long PCR方法得到JEV的5′和3′两个半长分子,在此基础上进行融合PCR,得到JEV全长cDNA分子,克隆入pGEMT-easy载体,酶切鉴定并测序。结果扩增出均6000bp的JEV的5′和3′两个半长分子及约11000bp的全长cDNA片段,其二级结构丰富的非编码区未发生缺失。JEV全长cDNA分子与GenBank中收录的相关毒株的的核苷酸序列同源性最高达99%,其氨基酸序列同源性最高达96.3%。其E蛋白基因与野毒株和减毒株进行比较,核苷酸序列同源性高达98%～99%,氨基酸序列也未出现较大差异。结论已获得了乙型脑炎病毒SA14-14-2株全长基因组,为进一步构建感染性克隆奠定了基础。     

长春地区猪十二指肠贾第鞭毛虫感染的分子流行病学调查

目的调查长春地区猪十二指肠贾第鞭毛虫(简称贾第虫)感染的分子流行病学特征。方法选择长春地区两个猪场,随机采集60份猪粪便样品,根据贾第虫磷酸丙糖异构酶(triose phosphate isomerase,TPI)基因设计巢式PCR引物,以提取的猪粪便基因组DNA为模板进行巢式PCR扩增,PCR产物经测序及序列比对,并建立贾第虫系统进化树。结果 60份样品中,27份为阳性,阳性率为45%(27/60),基因型均为人兽共患型集聚体A。结论长春地区两个猪场存在较严重的贾第虫感染,基因型均为集聚体A,有较大的散播风险,需加强猪场卫生监督管理,以避免疫病流行。     

NIRF蛋白对妊娠早期绒毛滋养细胞增殖、凋亡的影响及其作用机制

目的观察NIRF蛋白对妊娠早期绒毛滋养细胞增殖、凋亡的影响及其作用机制。方法取正常妊娠妇女人工流产绒毛组织(8~10周),按常规分离方法获得滋养细胞,进行原代培养。通过上/下调NIRF在滋养细胞中的表达后,采用qRT-PCR法检测p53基因mRNA的转录水平;Western blot法检测p53蛋白的表达水平;MTT法检测滋养细胞的增殖能力;Annexin V/PI双染色法检测细胞凋亡情况。结果与未转染组比较,NIRF上/下调后,p53基因m RNA转录水平差异无统计学意义(P0.05);NIRF上调,p53蛋白表达水平明显下降(P0.05),早期绒毛滋养细胞增殖能力显著增强(P0.05),凋亡率差异无统计学意义(P0.05);NIRF下调,p53蛋白的表达水平明显升高(P0.05),早期绒毛滋养细胞增殖能力明显减弱(P0.05),凋亡率明显上升(P0.05)。结论 NIRF在蛋白水平上抑制了p53的表达,促进了滋养细胞的增殖。     

鼠抑铁素2蛋白的原核表达及鉴定

目的表达鼠抑铁素2(lcn2)蛋白,并检测表达产物的生物学活性。方法从小鼠RAW264.7巨噬细胞提取总RNA,逆转录合成cDNA,以cDNA为模板,PCR扩增lcn2基因片段,插入原核表达质粒pET-32a(+),转化大肠杆菌BL21(DE3)plysS,用IPTG诱导表达。表达产物经His-tagin-gel stain鉴定后,采用Ni2+-NTA亲和层析纯化,并检测其生物学活性。结果经核苷酸序列测定和酶切鉴定,表明重组质粒pET-32a(+)-lcn2构建正确。表达的重组蛋白经SDS-PAGE分析,相对分子质量约为21000,表达量占菌体总蛋白的35%,主要以包涵体形式存在。纯化后蛋白浓度为1.0g/L,并对大肠杆菌和乙型链球菌生长有一定的抑制作用。结论成功地在原核细胞中表达了重组lcn2蛋白,且表达的蛋白具有一定的抑菌作用。     

环状RNA作为微小RNA海绵在肿瘤进展中的作用

环状RNA(circular RNA,circRNA)是一类共价封闭的内源性非编码RNA,无5'端帽和3'端多聚A尾,具有组织特异性,广泛存在于人类细胞中.circRNA于包括肿瘤在内的多种疾病相关组织及细胞中存在差异表达,提示circRNA对某些疾病具有调节作用,如circRNA可作为微小RNA(microRNA,m...     

人体β-防御素-3突变基因的克隆及在大肠杆菌中的表达

目的对人体β-防御素-3基因进行定点突变,并在E.coli中表达。方法从人正常皮肤组织中提取总RNA,经RT-PCR扩增编码β-防御素-3成熟肽的cDNA,测序正确后,设计含突变位点的引物,用PCR重叠延伸法对β-防御素-3成熟肽cDNA进行定点突变,将突变产物克隆至pUC18,并在E.coli中融合表达。结果测序结果表明,经RT-PCR所得的β-防御素-3成熟肽序列与GenBank中报道的序列完全一致。经过突变,β-防御素-3成熟肽第29位谷氨酰胺密码子由CAG突变为精氨酸密码子CGA,其余核苷酸序列均未发生变化。将突变β-防御素-3基因在E.coli中诱导表达后,可见突变β-防御素-3蛋白表达。结论已成功克隆并表达了β-防御素-3突变体基因。     

重组人BAFF_(134～285)的克隆及在大肠杆菌中的高效表达

目的克隆人TNF家族的B细胞激活因子(BcellactivatingfactortotheTNFfamily,BAFF)胞外区cDNA,并进行高效表达和纯化。方法提取人新鲜扁桃体组织总RNA,经RTPCR扩增编码人BAFF胞外区134～285氨基酸残基cDNA,经序列测定后,克隆至pQE80L载体中,并转化大肠杆菌DH5α,经IPTG诱导表达及Ni2+NTA柱层析纯化目的蛋白,最后经SDSPAGE和Westernblot检测。结果RTPCR扩增得到了459bp的cDNA片段,序列分析与GenBank中报道的编码人BAFF134～285的cDNA序列一致,SDSPAGE及Westernblot证实表达蛋白确实为6×HisBAFF134～285融合蛋白,并存在于包涵体中。结论利用大肠杆菌可高效表达rhBAFF134285,为进一步研究其生物学活性奠定了基础。     

产肠毒素大肠杆菌987P菌毛蛋白FasA亚单位的原核表达及其免疫原性

目的表达、纯化产肠毒素大肠杆菌(Enterotoxigenic Escherichia coli,ETEC)987P菌毛蛋白FasA亚单位,并检测其免疫原性。方法将去掉5′端信号肽序列的fasA基因克隆至原核表达载体pQE-30中,构建重组表达质粒pQE-30-fasA,转化E.coli M15,0.5 mmol/L IPTG诱导表达。表达的融合蛋白6×His-FasA经Ni-Agarose His纯化和复性后,经皮下多点注射免疫BALB/c小鼠,每次100μg,共免疫3次,间隔2周,末次免疫10 d后,摘除小鼠眼球取血,分离血清,采用间接ELISA法检测抗血清效价。结果重组表达质粒pQE-30-fasA经PCR、双酶切和测序证实构建正确;表达的6×His-FasA融合蛋白相对分子质量约为18 500,主要以包涵体形式表达,表达量占菌体总蛋白的30%;纯化的蛋白纯度可达95%,浓度为0.6 mg/ml,免疫小鼠所得抗血清效价为1∶125 000。结论已成功在E.coli M15中表达了6×His-FasA融合蛋白,纯化的融合蛋白免疫原性良好,为进一步研制以双歧杆菌为表达系统的新型ETEC亚单位口服疫苗奠定了基础。     

Evaluation of bacterial RNase P RNA as a drug target

RNA has gained increasing importance as a therapeutic target. However, so far mRNAs rather than stable cellular RNAs have been considered in such studies. In bacteria, the tRNA-processing enzyme RNase P has a catalytic RNA subunit. Fundamental differences in structure and function between bacterial and eukaryotic RNase P, and its indispensability for cell viability make the bacterial enzyme an attractive drug target candidate. Herein we describe two approaches utilized to evaluate whether the catalytic RNA subunit of bacterial RNase P is amenable to inactivation by antisense-based strategies. In the first approach, we rationally designed RNA hairpin oligonucleotides targeted at the tRNA 3'-CCA binding site (P15 loop region) of bacterial RNase P RNA by attempting to include principles derived from the natural CopA-CopT antisense system. Substantial inactivation of RNase P RNA was observed for Type A RNase P RNA (such as that in Escherichia coli) but not for Type B (as in Mycoplasma hyopneumoniae). Moreover, only an RNA oligonucleotide (Eco 3') complementary to the CCA binding site and its 3' flanking sequences was shown to be an efficient inhibitor. Mutation of Eco 3' and analysis of other natural RNase P RNAs with sequence deviations in the P15 loop region showed that inhibition is due to interaction of Eco 3' with this region and occurs in a highly sequence-specific manner. A DNA version of Eco 3' was a less potent inhibitor. The potential of Eco 3' to form an initial kissing complex with the P15 loop did not prove advantageous. In a second approach, we tested a set of oligonucleotides against E. coli RNase P RNA which were designed by algorithms developed for the selection of suitable mRNA targets. This approach identified the P10/11-J11/12 region of bacterial RNase P RNA as another accessible region. In conclusion, both the P15 loop and P10/11-J11/12 regions of Type A RNase P RNAs seem to be promising antisense target sites since they are easily accessible and sufficiently interspersed with nonhelical sequence elements, and oligonucleotide binding directly interferes with substrate docking to these two regions.     

连续3次基因抓捕构建人EEF1A1-人凝血因子Ⅶ杂合基因座

目的利用人类真核翻译延伸因子1A1(Human eukaryotic translation elongation factor 1A1,hEEF1A1)基因座完整的上下游调控序列和人凝血因子Ⅶ(Human coagulation factorⅦ,hFⅦ)基因组序列构建hEEF1A1-hFⅦ杂合基因座。方法首先构建连入6个同源臂的pBR322作为连续3次基因抓捕的载体;然后通过Red同源重组系统,在大肠杆菌内进行缺口修复。第一步将hEEF1A1基因3′端侧翼序列亚克隆至抓捕载体上,第二步将hFⅦ完整基因组序列亚克隆至抓捕载体上,第三步将hEEF1A1基因5′端完整侧翼序列亚克隆至抓捕载体上。结果经3次基因抓捕,3个基因片段在抓捕载体上无痕连接,形成一条长约50 000 bp的hEEF1A1-hFⅦ杂合基因座。经PCR、酶切及测序验证,构建的hEEF1A1-hFⅦ杂合基因座中,原hEEF1A1基因组编码序列从起始密码子到终止密码子被hFⅦ基因组序列精确置换。结论成功构建了hEEF1A1-hFⅦ杂合基因座,为哺乳动物细胞表达大载体的制备提供了实验依据。     

人蛋白C cDNA突变体的设计、克隆与序列分析

目的 通过对人蛋白C cDNA的定点突变,构建人蛋白C突变体cDNA,以期实现从哺乳动物细胞中直接表达出具有生物活性的人蛋白C产物。方法 针对人蛋白C cDNA序列设计引物以引入突变序列,采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)和重组PCR方法,从人胎肝总RNA中分别钓取人蛋白C的重链和轻链,经重组PCR反应将两者连接,然后将其克隆入pGEM-T载体中,经酶切和PCR鉴定后进行测序。结果 经RT-PCR和重组PCR扩增获得大小为1374 hp的cDNA片段,并成功构建了人蛋白C cDNA突变体的克隆质粒pGEM-T/mhPC,序列分析证实所引入的编码8个氨基酸短肽的核苷酸序列突变位点正确取代了人蛋白C的活性肽,获得人蛋白C突变体cD-NA的克隆。结论 已成功进行了人蛋白C cDNA的突变,获得了人蛋白c cDNA突变体的克隆,为进一步进行人蛋白C突变体cDNA的表达和活性鉴定奠定了基础。     

Sabin1型脊髓灰质炎病毒在人二倍体细胞适应过程中5′端非编码区序列变异与滴度的关系

目的　探索Sabin 1型脊髓灰质炎病毒在人胚肺二倍体细胞适应过程中 5′端非编码区序列变异及其与病毒感染性滴度的关系。方法　将Sabin 1型脊髓灰质炎病毒疫苗株在人胚肺二倍体细胞KMB17中连续传 11代 ,检测连续传代后感染性滴度 ,并检测 11个代次 5′端非编码区序列。结果　随着传代次数的增加 ,感染性滴度逐渐升高 ,在第 7代达到最高 ,为8 12 5LgTCID50 ml。在传代过程中 ,从第 3代起 5′端非编码区 74 2个核苷酸只出现 1个位点发生变异 ,第 6 39位由A变为G。结论　Sabin 1型脊髓灰质炎病毒经KMB17细胞传 11代 ,已适应KMB17细胞。Poliovirus 5′端非编码区与毒力直接相关的第4 80位核苷酸未发生回复突变。     

miR-451靶向调控肾小球系膜细胞Ywhaz基因的表达

目的探讨miR-451对肾小球系膜细胞Ywhaz基因表达的靶向调控。方法应用生物信息学技术对miR-451的靶基因进行预测,PCR法扩增靶基因3′UTR全长片段,插入荧光素酶报告载体pmiR-RB-REPORTTMvector中,构建荧光素酶报告质粒pmiR-Ywhaz-3′UTR。将miR-451 mimics和NC mimics分别转染高糖培养条件下的小鼠系膜细胞,将miR-451 inhibitor和NC inhibitor分别转染低糖培养条件下的小鼠系膜细胞,采用Real-time RT-PCR和Westernblot法检测miR-451和Ywhaz的表达水平;将miR-451 mimics和NC mimics分别与pmiR-Ywhaz-3′UTR共转染高糖培养条件下的小鼠系膜细胞,miR-451 inhibitor和NC inhibitor分别与pmiR-Ywhaz-3′UTR共转染低糖培养条件下的小鼠系膜细胞,检测各组细胞荧光素酶活性。结果 Ywhaz基因3′UTR区有11个碱基与miR-451种子序列匹配,其中7个碱基呈高度保守性;荧光素酶报告质粒经测序鉴定构建正确;miR-451在miR-451 mimics组呈高表达,在miR-451 inhibitor组表达降低;miR-451可抑制Ywhaz的蛋白表达;荧光素酶活性检测发现,miR-451可通过与Ywhaz3′UTR的结合,抑制Ywhaz的表达。结论 miR-451可直接靶向糖尿病相关基因Ywhaz,抑制其蛋白表达,为进一步研究miR-451调控早期糖尿病肾病发生发展的机制提供了依据。     

籽鹅卵巢产蛋性能相关基因全长cDNA序列的克隆与分析

目的克隆并分析籽鹅卵巢产蛋性能相关基因EST1的全长cDNA序列。方法利用实时荧光定量PCR技术对EST1基因在籽鹅产蛋前期与产蛋期卵巢中mRNA表达水平进行检测,并采用RACE(Rapid amplification of cDNAends,RACE)技术对该基因全长cDNA序列进行克隆,应用生物信息学预测方法对其编码的蛋白质进行分析。结果籽鹅产蛋期卵巢组织中EST1基因mRNA的表达水平显著高于产蛋前期(P<0.05)。经RACE技术获得EST1基因全长cDNA序列长1715bp,具有单一的完整开放阅读框(ORF,14～1318bp),推测编码蛋白含434个氨基酸残基,相对分子质量为107100,等电点为5.00。该蛋白为细胞质内蛋白,含3个跨膜螺旋,蛋白序列中含1个信号肽切割位点。结论经分子生物学软件进行蛋白质功能预测,初步确定EST1基因为籽鹅α-烯醇化酶蛋白基因,推测该基因可能参与籽鹅产蛋性能的分子调控。     

Serratia marcescens非特异性核酸内切酶的原核表达及其应用

目的在大肠杆菌中表达Serratia marcescens非特异性核酸内切酶(SMNE),并进行纯化、活性检测及应用。方法合成smne基因,应用PCR技术在基因的5′端引入6个组氨酸标签序列,将其插入分泌表达载体pET-20b(+)中,转化大肠杆菌BL21(DE3)pLysS,IPTG诱导表达。表达产物经镍离子螯合琼脂糖凝胶一步纯化后,检测其活性并计算比活。将纯化的SMNE用于重组腺病毒的制备,对外源性核酸进行降解,并采用Southern blot对外源性DNA残留量进行测定。结果重组表达质粒pET-20b-smne经PCR、双酶切和测序证明构建正确。重组蛋白的表达量为8.0 mg/L,纯化后纯度达95%,比活达1.1×106 U/mg。在重组腺病毒制备过程中使用后,成品中的外源性DNA残留量≤10 ng/5.0×1011 VP。结论已成功地在大肠杆菌中表达了SMNE,纯化的SMNE活性高,有望应用于重组生物制品制备过程中外源性核酸的去除。     

人乙酰胆碱酯酶(AchE)cDNA克隆及真核表达载体的构建

目的　克隆人乙酰胆碱酯酶 (AchE)cDNA并构建真核表达载体。方法　根据GeneBank中hAchE核苷酸序列 ,设计并合成 1对特异性扩增hAchE的引物 ,从 18周龄引产的胎儿大脑组织中提取RNA为模板 ,利用RT PCR技术扩增出hAchEcDNA片段 ,并与pGEM T载体连接 ,转化大肠杆菌DH5α中 ,经IPTG X gal诱导培养 ,筛选白斑提取重组载体 ,经酶切和PCR鉴定及序列测定与分析 ,并构建hAchE真核表达载体pcDNA3 .1(+) hAchE。结果　已克隆的hAchEcDNA片段全长约 1.9kb ,其测序结果与基因文库中的人乙酰胆碱酯酶cDNA序列相符。结论　在国内首次利用RT PCR成功地克隆了hAchEcDNA全长 ,并构建了hAchE真核表达载体pcDNA3 .1(+) hAchE ,为进行hAchE的结构与相关功能研究和基因工程生产奠定了基础。