β-甘露聚糖酶产生菌的选育

本论文以魔芋、番鬼芋、土壤、海水等从自然界采集到的样品为实验材料,经过富集培养、分离纯化、选择性平板分离,筛选出产β-甘露聚糖酶的菌株,再经过平板水解圈初筛得到20株酶活较高的菌株,经过摇瓶复筛,选出一株酶活最高的菌株,其酶活为15.66U/ml.对该菌株进行60℃o诱变,经过分离、平板水解圈初筛和摇瓶复筛,得到一株酶活为31.89U/ml的菌株,其酶活是出发菌株的2.04倍.     

产β-甘露聚糖酶的海洋微生物的筛选

以含有2%的NaCl培养基,从海泥、海水样品中用魔芋精粉为碳源,富集和分离产β-甘露聚糖酶的菌株,再经过平板水解圈初筛和发酵复筛得到稳定高产β-甘露聚糖酶的菌株L1。L1菌株的最佳生长条件包括:种龄12h、温度30℃,摇瓶装液量为100mL(250mL三角瓶),接种量为2%,摇床转速为160r/min,培养时间24h,β-甘露聚糖酶活力达到34.31U/mL。     

产β-甘露聚糖酶菌株的筛选及其产酶培养基的优化

从土壤中分离筛选出5株产胞外β-甘露聚糖酶的菌株,其中XB2菌株的摇瓶培养液的粗酶活力达4.81U/mL。通过单因素实验和正交优化实验,确定了菌株产酶最适培养基组成(%)为:魔芋精粉1.5,NaNO3 0.3,MgSO4 0.3、KCl0.5、K2HPO40.1、FeSO4 0.001。此条件下酶活力高达9.12U/ml。     

碳源对地衣芽孢杆菌产β-甘露聚糖酶的影响

以一株分离自亚麻温水沤麻液的β-甘露聚糖酶高产菌株地衣芽孢杆菌HDYM-04为供试菌株,在摇瓶水平对碳源种类进行筛选及优化。结果显示:魔芋粉为最佳碳源,适宜的使用量为1%;葡萄糖次之,其最佳使用量为0.5%;以面粉为碳源,酶活力很低。当以魔芋粉为底物时,其最佳产酶时间为24 h,β-甘露聚糖酶最高酶活力值为(695.84±23.42)U/m L,表明魔芋粉具有良好的诱导产酶作用。此外,正交试验确定混合碳源发酵最佳组合为:0.5%葡萄糖和1%魔芋粉,其最高酶活力可达(789.07±12.34)U/m L,较未优化且仅加入1%魔芋粉时提高13.35%。该研究优化了地衣芽孢杆菌HDYM-04在摇瓶水平生产β-甘露聚糖酶的发酵条件,提高了β-甘露聚糖酶产量,为菌株HDYM-04的进一步研究及工业化应用提供了理论基础。     

异甘露聚糖酶生产菌的诱变育种及固态发酵条件的优化

为了提高异甘露聚糖酶活性,对实验室保藏的一株分泌异甘露聚糖酶的枯草芽孢杆菌K-6(Bacillus subtilis K-6)进行紫外诱变育种,并优化一株正突变株的固态发酵条件。出发菌株枯草芽孢杆菌K-6的酶活力为206.0U/mL,经紫外线诱变处理后,挑选在培养基上透明水解圈较大的菌株进一步复筛,获得枯草芽孢杆菌K-6-9高产突变株,酶活力为349.3U/mL,高于出发菌株69.6%。连续5代发酵,K-6-9的酶活力范围为343.0～350.3U/mL,表明该突变菌株产酶性能稳定。以K-6-9为菌种,采用单因素试验和正交试验进行最佳固态发酵产酶条件的优化,结果表明：该突变株的固态发酵适宜发酵条件为：发酵时间72h、接种量3%、初始pH 7.5、装料量25g/250mL;培养基组成为：酵母细胞壁添加量8%、料液比1:1.2、麸皮添加量40%,此优化条件下固态发酵K-6-9菌株产酶酶活力最高达601.6U/mL。     

β-甘露聚糖酶基因和木聚糖酶基因在毕赤酵母中的共表达

为实现β-甘露聚糖酶基因和木聚糖酶基因在毕赤酵母中的共表达,作者将经SalⅠ线性化的pPIC9K-xynⅡ电转化至工程菌GS115/Anman5A中,经G418浓度梯度筛选后获得能同时高产β-甘露聚糖酶和木聚糖酶的双重重组子GS115/Anman5A-xynⅡ。SDS-PAGE显示目的蛋白的相对分子质量分别约为52 000,24 100。摇瓶发酵筛选出产酶活性最强的转化株,命名为GSMX2,随后对该菌株的表达条件进行初步优化,优化后的表达条件为:诱导时间120 h,培养基起始pH值为7.0,甘油添加量为1.5%,甲醇添加量为1.5%。在此培养条件下,产β-甘露聚糖酶和木聚糖酶的活性分别达到37.1 U/mL和193.6 U/mL。     

碱性β-甘露聚糖酶产生菌的筛选、鉴定及发酵条件优化

为获得具有潜在工业应用价值的碱性β-甘露聚糖酶产生菌株,从自然土样中分离得到1株产酶性状较好的碱性细菌,经形态学和分子生物学分析鉴定为科氏芽孢杆菌(Bacillus cohnii)。粗酶性质研究显示,该菌株所产β-甘露聚糖酶最适作用温度和pH分别在55℃和9. 5。通过单因素和正交设计试验优化后,该菌株摇瓶发酵至36 h时,产酶水平为345 U/L,是优化前产酶水平的4. 3倍。研究结果为碱性β-甘露聚糖酶的放大发酵奠定了基础,为碱性β-甘露聚糖酶编码基因的克隆及异源表达等相关研究提供了良好的菌种资源。     

一株产α-葡萄糖苷酶菌株的鉴定和选育

通过平板初筛和摇瓶复筛,结合酿酒酵母利用可消化性糖和高效液相色谱法,从海泥中分离到一株产α-葡萄糖苷酶菌株YX41,纯化后经形态观察、生理生化特征和26 S rDNA序列及系统发育树分析,鉴定菌株YX41为伯顿毕赤酵母。通过UV-LiCl对出发菌株YX41进行复合诱变处理,获得一株正向突变株ZG36,该突变株经摇瓶发酵,α-葡萄糖苷酶活力达到4.32 U/mL,比出发菌株提高了32%。     

产β-mannanase内生菌的诱变育种和酶学特性研究

以实验室筛选的产β-甘露聚糖酶的黄豆内生菌Bacillus subtilis HD-1(54.6 U/mL)为出发菌株,分别采用紫外线,硫酸二乙酯,紫外线-光复活和紫外线-硫酸二乙酯对其进行诱变,结果表明,以紫外线-硫酸二乙酯复合诱变效果最好,获得一株高产β-甘露聚糖酶的突变菌株Bacillus subtilis UD-20,酶活达89.5 U/mL,比出发菌株提高了63.9%,遗传性能稳定。该β-甘露聚糖酶的最适反应温度和pH分别为50℃和7.0,该酶在50℃以下,pH 5.0~8.0之间稳定性较好,属于中性酶。亚铁离子和钴离子对酶有较强的激活作用,相对酶活分别提高了13.2%和31.7%,但锰离子对酶有强烈的抑制作用,相对酶活仅有对照组的55.6%;金属离子钾、钙、钴和钡都能增强酶热稳定性,其中钴离子的增强效果最为明显,残余酶活约是对照组的1.5倍。     

高产嗜热β-葡聚糖酶菌种的诱变选育研究

以嗜热β-葡聚糖酶产生菌枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis XJ-Li)X-5为出发菌株,采用紫外线(UV)和硫酸二乙酯(DES)复合诱变处理技术,选育出一株产嗜热β-葡聚糖酶性能稳定、活力较高的突变株AS35.在同等摇瓶发酵条件下,其产酶活力达15.83 U/mL以上,较原始出发菌株提高了81.54%.同时,经连续7次传代保存,产酶性能未出现较大的变异,表现出良好的遗传稳定性,极有潜力改良为工业化生产菌种.     

高产β-甘露聚糖酶黑曲霉菌株的分离与鉴定

该研究以采集的河南南阳魔芋种植土壤样品为试验材料,通过富集培养、测定产β-甘露聚糖酶酶活力,分离筛选高产β-甘露聚糖酶的菌株,并通过形态观察、内转录间隔区（ITS）基因和β-微管蛋白基因BenA序列分析对其进行菌种鉴定。结果表明,筛选得到一株高产β-甘露聚糖酶真菌菌株HKS016,其β-甘露聚糖酶酶活力为2.67 U/mL,该菌株被鉴定为黑曲霉（Aspergillus niger）,保藏于中国普通微生物学菌种保藏中心（CGMCC）,保藏编号为CGMCC No.22413。     

产壳聚糖酶菌株选育及产酶条件研究

以淡紫拟青霉BJ2为出发菌株,分别通过亚硝基胍(NTG)和UV(紫外)诱变,采用透明圈法筛选,获得了产壳聚糖酶较高的突变菌株淡紫拟青霉BJ2-3,其所产酶活力达到7.48 U/mL,远高于BJ2的酶活力(1.58 U/mL)。摇瓶实验确定了该菌发酵生产壳聚糖酶的最佳发酵条件:碳源为8 g/L的壳聚糖,氮源为3 g/L的酵母粉,接种量为8%,发酵温度为28℃,500 mL三角瓶装液量125 mL,摇瓶转速180 r/min。在上述培养条件下,84 h时摇瓶中发酵液的最高酶活力达15.20U/mL。     

β-甘露聚糖酶产生菌的筛选和酶学性质研究

从土壤中分离筛选出5株产胞外β-甘露聚糖酶的菌株,其中DK3菌株的摇瓶培养液的酶活力达3.85U/mL。该酶水解葡甘露聚糖的最适温度为37℃,最适pH为6.0,pH稳定范围为5.0～9.0,在低于40℃的温度下基本稳定。Fe2+、Cu2+、EDTA和NH4+对该酶有抑制作用,Na+则有激活作用。     

产β-葡聚糖酶淀粉液化芽孢杆菌的选育

通过对一株淀粉液化芽孢杆菌进行紫外和^60Co逐级诱变，使该菌株产β-葡聚糖酶酶活从80U／mL提高到105U／mL；对突变株进行多次单菌落分离及传代，对其传代稳定性的研究表明：该菌株产酶性能稳定；在5L发酵罐中突变株的产酶水平比摇瓶要高，可达120U／mL，产酶周期比摇瓶缩短了15h．     

ARTP诱变选育中温α-淀粉酶高产菌株及其发酵条件优化

利用常压室温等离子体(ARTP)技术,对产中温α-淀粉酶的枯草芽孢杆菌菌株进行诱变处理,通过平板、深孔板初筛及摇瓶复筛共筛选出3株酶活明显提高的菌株,其中产酶活力最高的突变株BS-12,摇瓶酶活达到了801 U/m L,较出发菌株提高了32.2%。通过单因素试验,得到的最佳发酵条件为接种量6%,温度36℃,发酵时间68 h。在此条件下,摇瓶酶活力达到1 395 U/m L,经30 L发酵罐放大,酶活达到了1 553 U/m L。     

高产β-甘露聚糖酶菌株的分离鉴定及酶学性质研究

通过初筛和复筛从魔芋种植基地土壤样品中分离筛选高产β-甘露聚糖酶菌株。通过形态学观察、生理生化试验及16S rDNA序列分析对菌株进行鉴定,并对其产β-甘露聚糖酶酶学性质进行研究。结果表明,筛选出一株高产β-甘露聚糖酶的菌株,编号为HTGC-10,被鉴定为解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）。菌株HTGC-10在30 ℃、180 r/min条件下液体发酵24 h后,发酵液β-甘露聚糖酶活力为61.75 U/mL。酶学性质的研究结果表明,该菌株所产酶的最适反应pH值为6.0,在中性偏酸环境下稳定性较好,属于偏酸性酶;最适反应温度为55 ℃,热稳定性相对较差;乙二胺四乙酸（EDTA）和金属离子Na+、K+、Mn2+、NH4+、Mg2+、Fe2+、Cu2+、Ca2+对酶活力均有不同程度的抑制作用,其中Cu2+对酶活力的抑制作用最显著。     

枯草杆菌纤溶酶高产菌株的物理化学诱变

以枯草杆菌FM-S2作为出发菌株,经γ-射线和2.5%硫酸二乙酯复合诱变,结合牛奶蛋白平板从2341株存活菌中初筛得到200株诱变菌株,经摇瓶测定纤溶酶活性进行复筛得到7株生产性能较出发菌株显著提高的突变株,它们的纤溶酶活性超过2000UK.U/ml。其中突变株γ-DES36纤溶酶活性最高达到2719.89±242.51UK.U/ml,同时该菌株遗传性能稳定。     

干酪乳杆菌产β-甘露聚糖酶发酵条件优化及在果汁澄清中的应用

为丰富甘露聚糖酶在乳酸菌中的菌株来源，扩大甘露聚糖酶在食品级领域的应用。通过形态观察、API 50 CHL试剂条检测和16S rDNA序列分析，对产β-甘露聚糖酶的乳酸菌进行鉴定。结果表明，鉴定出一株产β-甘露聚糖酶的干酪乳杆菌（Lactobacillus casei）3MP-5-3。采用响应面法获得最优培养基组分为角豆胶5.7 g/L、酵母提取物5.2 g/L、葡萄糖8.0 g/L、蛋白胨10.0 g/L、牛肉膏10.0 g/L、柠檬酸铵3.0 g/L、1 mL吐温80和初始pH值6.1。优化后菌株产甘露聚糖酶酶活从（64.55±0.20） U/mL增加到（75.83±0.31） U/mL，是优化前的1.17倍。β-甘露聚糖酶能提高苹果、橙子、桃子、柿子和蓝靛果5种果汁出汁率和澄清度。其中酶处理组的柿子汁（44.53%）和苹果汁澄清度（73.60%）显著高于离心组（36.86%和64.41%）（P＜0.05），分别提高了17.2%和14.3%。该结果表明干酪乳杆菌3MP-5-3粗甘露聚糖酶在果汁澄清具有经济、简便的应用潜力。     

共表达伴侣蛋白对毕赤酵母产β-甘露聚糖酶发酵过程的影响

通过分别共表达伴侣蛋白PDI和Bip获得β-甘露聚糖酶在毕赤酵母中的高效表达。根据Gen Bank公布的毕赤酵母PDI和Bip序列设计引物,以酵母基因组为模板PCR扩增目的基因片段,插入表达载体p PICZαA,分别整合到β-甘露聚糖酶工程菌中,筛选共表达二硫键异构酶的重组酵母(PM115)和共表达免疫球重链结合蛋白的重组酵母(BM115),在30 L发酵罐水平上分析两种共表达伴侣蛋白菌株与初始菌株(GM115)对β-甘露聚糖酶表达的差异。相同工艺下,PM115与原始菌株相比未有提高,而BM115发酵产酶能力高于原始菌株,最高酶活达到40 900 U/m L,最高总蛋白表达量13.22 g/L,最高比酶活达到3 150 U/mg,分别比初始菌株提高38%,22%和18%。毕赤酵母基因工程菌GM115通过共表达伴侣蛋白Bip,提高了β-甘露聚糖酶的产量和比活力,达到工业化生产水平。     

红曲色素高产菌株的高通量选育

该文结合24深孔板微型化培养和酶标仪检测,建立了红曲色素高产菌株的高通量筛选方法,此法简单、快速、准确且自动化水平较高.确定最佳培养条件为装液量1.2mL/孔(每孔体积为10mL),接种量9％;找出红曲色素最大吸收峰值,确定酶标仪检测波长为530nm;通过紫外-氯化锂复合诱变处理,经过高通量筛选获得9株正突变株,其中菌株D39微孔板发酵色价达42.7U/mL,比出发菌株提高了46.2％;将D39分离纯化并用摇瓶验证,得到纯菌株D39-4的摇瓶发酵色价为206.5U/mL,比出发菌株提高了51.1％,具有很好的工业应用前景.