食物来源和食源性疾病来源的副溶血性弧菌的生物学特性比较研究

目的了解温州市平阳县食物来源和食源性疾病来源的副溶血性弧菌的血清群分布特点以及耐热直接溶血素(TDH)和TDH相关溶血素(TRH)检出情况。方法以59株副溶血性弧菌食品风险监测分离株和39株副溶血性弧菌食源性疾病监测分离株为研究对象,用标准血清进行血清学分群,应用实时荧光定量聚合酶链式反应(PCR)法检测tdh基因和trh基因。结果食品风险监测分离株检出9个血清群,无优势菌群;食源性疾病监测分离株检出O1、O3和O4;以O3和O4为主,分别占48.7%(19/39)和46.2%(18/39)。食源性疾病监测分离株的毒力基因检测结果为38株仅含有tdh基因,1株仅含有trh基因,而食品风险监测分离株仅检出1株只含有tdh基因的菌株。结论平阳县食品风险监测中分离的副溶血性弧菌菌株与分离自食源性疾病监测的副溶血性弧菌菌株的主要血清型、毒力基因都存在差别。本研究为预防和快速检验副溶血性弧菌引起的食源性疾病提供了科学依据。     

食品中副溶血性弧菌toxR和tdh基因双色荧光PCR检测方法的建立

目的 建立对副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus）特异性检测toxR（跨膜转录激活蛋白）基因和tdh（热稳定性直接溶血素）毒力基因的Taqman探针双色荧光PCR检测方法。方法 根据副溶血性弧菌toxR基因和tdh基因,分别设计引物和探针,建立Taqman探针双色荧光PCR扩增体系,进行特异性、灵敏度试验;对副溶血性弧菌分离菌株实施检测,了解其tdh基因和tdh基因分布情况。结果 结果表明,副溶血性弧菌标准菌株和3株从食物中毒患者中分离获得的分离株均出现toxR基因和tdh扩增曲线,而溶藻弧菌、单增李斯特菌等31株弧菌属其他菌株和肠杆菌科的菌株未见扩增曲线。从食品中分离的37株副溶血性弧菌分离株均未携带tdh毒力基因。副溶血性弧菌检测灵敏度可达到3.6×102 cfu/mL。结论 该方法可用于同时检测食品中副溶血性弧菌的特异性和毒力基因。     

不同来源的副溶血性弧菌生物学特性研究

为掌握浙江省不同来源的副溶血性弧菌的血清型分布及毒力基因携带情况，采用血清凝集试验对333株副溶血性弧菌进行血清型分型，采用PCR技术检测副溶血性弧菌的毒力基因TDH。临床副溶血性弧菌菌株血清型分布于7个O抗原群，以O3为主，占临床菌株数的71.81％；04血清型与往年相比有所上升，占到了16．60％。海产品菌株的血清型分布于8个O抗原群，以O5为主，占所有海产品菌株的47．30％。临床菌株的TDH检出率为95．65％。海产品菌株的TDH检出率为6．06％。血清型相同但来源不同的菌株的TDH检出率不同。浙江省从海产品中分离出的副溶血性弧菌菌株与分离自食源性疾病患者的副溶血性弧菌菌株的主要血清型、毒力基因TDH都存在差别。该工作为预防副溶血性弧菌引起的食品中毒提供了科学依据。     

基于环介导等温扩增法(LAMP)检测上海市售贝类产品中副溶血性弧菌的毒力菌株

基于环介导等温扩增法(LAMP)对上海市8-10月市售贝类产品中副溶血性弧菌毒力菌株(tdh和trh毒力基因)进行检测分析,共检测贝类样品180份,6个常规品种,实验同时采用PCR测定方法进行对比。结果表明,含tdh和trh毒力基因的副溶血性弧菌在市售贝类中的检出率分别是12.77%和11.66%,PCR的分析结果为11.11%和7.78%。对分离的毒力菌株进行血清型分型后发现了2株O3:K6型副溶血性弧菌,其中1株为毒力基因双阳性菌(tdh+/trh+)。2株O3:K6型副溶血性弧菌的PFGE条带型相似度较高(相似度90%)。这些结果表明上海市售贝类产品中副溶血性弧菌毒力菌株存在一定的污染,应引起足够重视。双阳性O3:K6型副溶血性弧菌的出现值得关注,应对各血清型菌株尤其是O3:K6型副溶血性弧菌的流行情况加强监测。PCR检测结果对比分析表明,LAMP方法适用于贝类产品中副溶血性弧菌毒力菌株的检测分析。     

海口市市售贝类海产品副溶血性弧菌污染调查及耐药和毒力基因研究

目的了解海口市市售贝类海产品中副溶血性弧菌的污染情况、菌株血清学分型情况以及不同来源菌株的耐药情况,分析海口市市售贝类海产品受副溶血性弧菌污染的特点。方法 2014—2016年,按照GB 4789.7—2013《食品安全国家标准食品微生物学检验副溶血性弧菌检验》和《国家食品污染和有害因素风险监测工作手册》对五类海产品(白贝、排海、毛蚶、蛏子、芒果螺)进行副溶血性弧菌分离鉴定和血清学分型,采用实时荧光聚合酶链式反应(PCR)进行毒力基因检测,采用K-B法对分离菌株进行相关耐药分析。结果五类海产品样品共157份,其中65份样品检出副溶血性弧菌,白贝的检出率最高,为63.6%(21/33)。所分离的65株副溶血性弧菌主要血清群为O3和O5,完全分型26株,总体分型率为40.0%,其中以O1∶K25为主要血清型。65株菌对氨苄西林普遍耐药(95.4%,62/65),对头孢噻肟的中介率较高(33.8%,22/65),对8种抗生素产生了5种耐药谱。65株分离菌株神奈川试验结果均为阴性,且均未检出与致病性相关的耐热直接溶血素(TDH)及耐热相关溶血素(TRH)。结论海口市市售贝类副溶血性弧菌污染较重,应加强养殖区域海水水质的监测力度,预防副溶血性弧菌感染。     

食品来源副溶血性弧菌毒力基因分布及分子分型研究

分析食品中分离获得的副溶血性弧菌主要毒力基因的分布特征、血清型及分子分型特点,为食源性副溶血性弧菌感染暴发的早期预警和疫情溯源提供实验室数据。提取40株副溶血性弧菌基因组,分别用PCR检测VcrD1、Vp1680、VopP和VcrD2基因,荧光PCR检测tdh、trh和tlh基因。对40株菌株进行血清型分型并采用脉冲场凝胶电泳(PFGE)对其进行分子分型。利用BioNumerics软件对图谱进行聚类分析,建立PFGE分子分型数据库。40株菌株均未检测到tdh、trh、Vop P和VcrD2基因,tlh、VcrD1和Vp1680基因阳性检测率为100%。40株菌株中含有16种血清型,其中9株未分型,主要血清型为O_2∶K_(28)和O_5∶K_(17),血清型分布呈多样性。40株菌株共获得39个不同的PFGE带型,PFGE呈现遗传多样性,无优势带型。本实验食品环境中分离的副溶血性弧菌未发现毒力因子,副溶血性弧菌血清型呈分散趋势且菌株之间亲缘关系较远。     

基于弧菌毒力基因多重PCR法的建立及其在副溶血弧菌毒力基因检测中的应用

针对副溶血弧菌常见的11种毒力基因(tox R、Collagenase、tox S、trh、tdh、tlh、Ure R、Fla A、omp W、Asp A、fur),建立了两套六重PCR检测体系,应用于副溶血弧菌环境分离株和水产品分离株的毒力基因分布情况调查。在调查的248株副溶血弧菌中,鞭毛丝蛋白基因Fla A、外膜蛋白基因omp W和铁吸收调节蛋白基因fur的分布最广(100%),其次为碱性丝氨酸蛋白酶基因Asp A(99.60%),胶原蛋白酶基因Collagenase、不耐热性溶血毒素基因tlh以及毒力调控基因tox R和tox S的分布率均在90%以上且tox R和tox S的分布极为相似,尿素酶基因Ure R的分布极少(1.21%),而耐热直接溶血素基因tdh和耐热相关溶血素基因trh在这248株副溶血弧菌中没有检出。本研究建立的多重PCR检测体系能快速、高效地检测多个毒力基因的分布情况,为副溶血弧菌的毒力机制研究和风险评估提供方法和依据。     

副溶血弧菌毒力基因的检测研究

为了解不同来源的副溶血弧菌携带毒力基因的情况,对杭州地区临床和海产品中分离到的174株副溶血弧菌采用ehelex100法提取基因组DNA,并进行溶血素基因tdh和trh的PCR检测.结果显示,Chelex100法能够简单、快速地提取副溶血弧菌基因组DNA,以满足PCR检测条件的需要.在杭州地区副溶血弧菌感染的病例中,tdh阳性和trh阴性菌占主导地位,其中84株临床分离株中携带tdh基因的比例为92.86%,携带trh基因的比例为2.38%;90株海产品中仅检测出1株tdh阳性菌和2株trh阳性菌,分别占1.11%和2.22%,96.67%海产品中未检测出tdh和trh基因;海产品中携带tdh或trh的副溶血弧菌有增长的趋势,是潜在的危险病源.     

实时荧光PCR方法检测副溶血性弧菌的研究

建立了一种快速检测副溶血性弧菌（vibrio parahaemolyticus,VP）的荧光PCR（Real time polymerase chain re-action）方法。首先,从GenBank中获得副溶血性弧菌种特异性基因不耐热溶血毒素基因tl和直接耐热溶血素毒素基因tdh,用Primer Express2.0设计引物和Taqman荧光探针,在Roche荧光PCR上进行荧光PCR扩增,荧光曲线表明该荧光PCR可特异性地检测副溶血性弧菌,而大肠杆菌等其他14种细菌和空白对照都是阴性;检测方法灵敏度达10cfu/reaction。本研究建立的荧光PCR检测副溶血性弧菌的方法快速、特异性强,灵敏度高,稳定性好,可检测出总的和带tdh毒力基因的副溶血性弧菌,适合于大批量样品的检验,可广泛用于出入境检疫和动物防疫监督部门的疫情监测。     

副溶血性弧菌食源性疾病暴发分离株的血清型、核糖型及毒力基因研究

目的 了解目前食源性副溶血性弧菌暴发菌株在上海地区的血清型分布、毒力相关基因的携带情况,及Ribo分型.方法 收集上海市27起食源性副溶血性弧菌暴发事件分离的98株副溶血性弧菌,采用副溶血性弧菌分型血清对所收集的菌株进行血清学分型.利用双重PCR方法扩增tdh,trh两个重要的毒力基因以了解其毒力基因的携带情况.应用Riboprinter系统检测上述菌株的酶切片段杂交多态性.结果 引起27起暴发的98株副溶血性弧菌分为11个血清型,5个Ribo型.优势血清型为03:K6,优势Ribo型为vp-EcorI-002型.全部分离菌株均携带toxR基因,97株携带tdh基因,1株携带trh基因.有多起暴发事件分离到多个血清型的副溶血性弧菌.结论 血清分型和PCR方法检测毒力基因,是副溶血性孤菌暴发事件实验室诊断的有用方法.对于从一起暴发事件中检出的不同血清型的副溶血性弧菌需要确认各菌株与暴发的关系.