抗克伦特罗单链抗体基因构建及蛋白结构模拟

目的：构建抗克伦特罗单链抗体(scFv)基因cbl,进行蛋白质结构模拟并对其理化特性进行分析。方法：采用重叠延伸PCR 方法,以能特异性分泌抗克伦特罗mAb 的杂交瘤细胞株5D1 为原料,构建抗克伦特罗scFv 基因cbl,进行测序,采用生物信息软件对氨基酸序列推导并进行结构预测,同时对理化性质进行分析。结果：抗克伦特罗scFv 基因cbl 全长720bp,对应225 个氨基酸,单链抗体分子量约为25826.6,等电点预测值8.78,为碱性蛋白质;二级结构显示抗克伦特罗单链抗体含α螺旋20 处,β折叠99 处,β转角28 处,随机卷曲93 处。cbl 三级结构建模显示重链(VH)和轻链(VL)形成一个疏水的" 口袋",Linker 游离于此结构之外,符合scFv 的结构特点,明显具有抗原结合位点的空间构象,理论上应该具有良好的抗原结合活性。结论：构建一个抗克伦特罗scFv 基因cbl,应用信息学技术所获得的预测和分析结果为抗克伦特罗单链抗体的进一步表达、纯化和活性研究提供信息。     

抗呋喃唑酮代谢物单链抗体基因构建及蛋白结构分析和活性鉴定

从单克隆杂交瘤细胞出发,构建抗3-氨基-2-噁唑烷酮（3-amino-2-oxazolidinone,AOZ）衍生物单链抗体基因,并对其蛋白质进行理化性质分析及结构预测和活性鉴定。首先以呋喃唑酮代谢物AOZ衍生物单克隆抗体杂交瘤细胞1D2为原料,提取总RNA后克隆重链（VH）、轻链（VL）可变区基因,然后使用重叠延伸聚合酶链式反应技术用连接肽(G4S)3将VH、VL基因连接构建抗AOZ衍生物单链抗体基因,经测序后采用生物信息软件对抗体编码的氨基酸序列进行推导并展开生物信息学分析,再将此基因与Plip6/GN表达载体连接后进行表达并采用直接竞争酶联免疫分析法（direct competitive enzyme-linked immunosorbent assay,dcELISA）鉴定其活性。结果表明：抗AOZ衍生物单链抗体基因全长750?bp,编码250?个氨基酸,相对分子质量为27?012.20,理论等电点为9.13,属于碱性氨基酸;其二级结构预测结果显示抗体蛋白含20?处α-螺旋、25?处β-转角、114?处无规卷曲、91?处延伸带结构;三级结构预测的正面俯视图显示重、轻链由连接肽相连形成一个“环桶状”结构,侧面显示为“口袋状”,这与常规单链抗体的结构特征一致,dcELISA结果也显示该抗体具有良好的抗原结合活性。本研究为后续AOZ残留检测免疫分析方法的建立及抗AOZ衍生物单链抗体的改造奠定一定基础。     

抗克伦特罗核糖体展示单链抗体库的构建及鉴定

构建大容量核糖体展示抗克伦特罗单链抗体(single-chain fragment variant,scFv)文库,为进一步筛选抗体奠定基础。用克伦特罗人工抗原免疫小鼠,分离其脾细胞;Trizol法抽提总RNA,反转录成cDNA,PCR及重叠延伸PCR法构建核糖体展示scFv 文库。再通过PCR和重叠延伸PCR在scFv文库序列5＇端添加T7启动子、茎环结构、核糖体结合位点,3＇端添加间隔区序列(T20-V109)、茎环结构构建核糖体展示抗克伦特罗scFv文库。核糖体展示scFv文库与Easy T3载体连接,转化大肠杆菌DH5α感受态细胞,经蓝白斑筛选,挑取5个阳性克隆双酶切和测序鉴定。结果表明：用于建库材料的免疫小鼠效价为1:128000;成功扩增重链可变区基因大约为360bp和轻链可变区基因大约为330pb;核糖体展示scFv文库基因大约1200bp;库容量达1.75×1013;阳性重组质粒均含有1200bp插入片段;利用IMGT/V-QUEST数据库对单链抗体可变区进行序列分析结果表明,重链可变区和轻链可变区基因均由胚系基因重排得到,且与鼠源胚系基因同源率都达84%以上;氨基酸序列比对结果表明,重链可变区氨基酸序列同源率为37.82%,轻链可变区氨基酸序列同源率为39.09%。其中多样性主要发生在VH-CDR3、VL-CDR1、VL-CDR2和VL-CDR3。成功构建了大容量抗克伦特罗单链抗体核糖体展示文库。     

抗黄曲霉毒素单链抗体基因的克隆与表达

为降低黄曲霉毒素抗体制备成本,在已有的能分泌抗黄曲霉毒素单克隆抗体的杂交瘤细胞系8F6的基础上,成功克隆得到了该单克隆抗体的重链（VH）和轻链可变区（VL）基因片段。通过重叠延伸PCR的方法将轻、重链可变区基因连接,并引入连接肽（Linker）编码序列,构建VH-Linker-VL结构的单链抗体（ScFv）基因,并将该基因克隆到噬菌体表达载体pCANTAB 5E上,使单链抗体以噬菌体展示形式在大肠杆菌TG1中表达。间接竞争ELISA方法检测到该ScFv对黄曲霉毒素B1的抑制率（IC50）值为0.57ng/mL,表明该单链抗体与亲本鼠单抗有相同的抗原结合特异性,且具有很高灵敏度。     

抗呋喃它酮代谢物噬菌体单链抗体库的构建

目的：构建抗呋喃它酮代谢物(AMOZ)的衍生物噬菌体单链抗体库。方法：从分泌抗AMOZ 的单克隆抗体的杂交瘤细胞系(BC3-E8)中提取总RNA,经RT-PCR 反转录成cDNA,设计通用简并引物,PCR 扩增抗体重链可变区基因(VH)和轻链可变区基因(VL)。经重叠延伸PCR (SOE-PCR),将VH 和VL 基因用编码(G1y4Ser)3 的linker随机拼接成单链抗体(scFv)基因,然后将其克隆到噬菌粒载体pCANTAB5E 中,转化大肠杆菌(Escherichia coli) TG1 感受态细胞,经辅助噬菌体M13K07 超感染,建立噬菌体单链抗体库。随机挑取10 个阳性克隆,经PCR 和双酶切鉴定,并测序。登陆DNAMAN 软件对序列进行分析、比对。结果：成功扩增VH、VL 及scFv 基因,并得到库容为1.2 × 106 的噬菌体抗体库,噬菌体的滴度为2.0 × 1010PFU,PCR 鉴定及双酶切鉴定文库重组率较高,软件对序列比对结果显示,scFv 基因全长序列之间差异为8.38%,VH 序列差异为3.68%,VL 序列差异为14.34%,且序列差异多集中在CDR 抗原结合区域对应的核酸序列上。结论：已构建抗呋喃它酮代谢物的衍生物噬菌体单链抗体库,为进一步富集筛选并表达抗AMOZ 的衍生物的单链抗体提供参考。     

基于同源建模与分子对接技术构建抗Bt Cry1类毒素单链抗体定点饱和突变库

转基因食品中苏云金芽胞杆菌(Bt)Cry毒素种类较多,对生态环境和食品安全等造成的潜在风险日益受到关注,制备针对多种Cry毒素的高效广谱抗体,进而建立广谱性快速检测方法,是对转Bt基因作物进行监管并确保生态环境和食品安全的基础。本研究利用基因工程抗体易于定向修饰及Cry毒素具有相似结构的特点,以实验室前期获得的人源化抗苏云金芽胞杆菌(Bt)Cry1Ac毒素单链抗体为材料,通过同源建模模拟单链抗体及五种Cry1类毒素的三维结构并利用分子对接技术分析单链抗体与Cry1类毒素结合的关键氨基酸位点;在此基础上利用重叠延伸PCR技术对关键氨基酸位点及其邻近位点进行定向改造,以构建定点饱和突变库,为筛选检测多种Cry1类毒素的广谱特异性抗体提供实验材料。     

抗-Cry2Aa单链抗体分子互作及荧光免疫检测研究

Cry2Aa毒素是一种新型生物农药,分析该毒素与特异性单链抗体分子互作,并建立快速检测毒素残留的方法对保障食品和生态安全有重要意义。本研究以同源蛋白为模板对单链抗体进行建模,并进行了Cry2Aa毒素与单链抗体的分子对接模拟,确定关键结合位点,以此为基础将单链抗体作为检测抗体,建立了间接竞争时间分辨荧光免疫分析方法,对大米样品中Cry2Aa毒素进行了检测。利用生物信息学工具模拟获得单链抗体三维结构模型,分子对接结果显示重链可变区81NY82和121SGNY124区域及轻链可变区的245YSSN248氨基酸残基在与毒素结构Ⅱ区识别过程中起关键作用,为建立高效检测方法奠定基础,进一步基于该单链抗体建立的时间分辨检测方法灵敏度(IC10)为0.08 ng/mL,中抑制浓度(IC50)为7.99 ng/mL,线性检测范围(IC20~IC80)为0.24~263.77 ng/mL,且与常规双抗夹心ELISA法检测呈良好线性关系。     

西维因单链抗体同源建模及与西维因对接模拟研究

抗体的结构决定其功能,由于目前没有西维因抗体结晶结构的解析导致其与抗原结合机理不清楚,严重影响ELISA检测技术中对抗体特异性能的改造。本研究应用分子模拟与对接技术预测西维因单链抗体的三维结构及其与西维因分子的结合模式,采用同源建模方法首先获得西维因单链抗体的三维结构,然后采用分子对接技术将三维结构模型与西维因分子进行对接。结果表明,结合过程中H-CDR2、H-CDR3和L-CDR2形成一个疏水型的凹槽,疏水型的凹槽助推西维因分子与之结合并将西维因分子牢固地卡在里面,可能的结合位点由Ala51、Ser52、Ile51、Gly54、Ser56、Arg98、Gly100等氨基酸残基组成。为深入认识西维因分子与其抗体相互作用机理提供了理论指导,并为下一步西维因单链抗体体外亲和力的成熟奠定基础。     

氧氟沙星单链抗体库的构建、筛选及蛋白结构模拟

利用噬菌体展示技术构建兽药氧氟沙星单链抗体(scFv)库,从中筛选氧氟沙星特异性噬菌体scFv以及模拟其三维结构。将从氧氟沙星杂交瘤细胞提取的总RNA,用RT-PCR反转录合成第一链cDNA,设计以针对鼠源重链可变区(VH)及轻链可变区(VL)基因的兼并引物,通过PCR扩增获得VH和VL可变区基因,采用重叠延伸PCR技术将VH和VL拼接为全长scFv基因片段,将经内切酶EcoRⅠ和HindⅢ双酶切后的scFv基因片段插入到T7噬菌体中,经包装蛋白体外包装后转化宿主菌BLT5403,成功构建库容量为3×105pfu/mL氧氟沙星单链抗体库,经过4轮吸附-洗脱-扩增的富集后,采用直接竞争ELISA筛选得到4个特异性噬菌体scFv,经测序最后运用Expasy软件模拟特异性scFv的三维结构和物理化学性质。为进一步大量表达氧氟沙星单链抗体奠定了坚实的基础。     

链霉菌DDE转座酶基因的克隆及生物信息学分析

从实验室保藏的菌株中筛选出一株产DDE转座酶的菌,经形态及生理生化、16S rDNA及建树分析比对,该菌株属链霉菌属灰褐类群,暂将其命名为Streptomyces labedae sp. X1。从Streptomyces labedae sp. X1基因组DNA扩增一401 bp的DDE转座酶基因,通过Blast和ISfinder数据库进行序列比对,结果显示其与ISAzo13家族转座酶的基因有88%的相似度。通过对其进行生物信息学分析,发现该基因可编码133个氨基酸,且该DDE转座酶的保守的氨基酸三联体分别位于Asp43、Asp49、Glu91上,理化性质结果显示编码产物为稳定的亲水蛋白;二级结构以α-螺旋和无规则卷曲为主,不存在信号肽和跨膜结构域,为非分泌蛋白;有14个磷酸化位点且仅有一个糖基化位点;高级结构以α-螺旋为主;通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳,结果显示在27 ku处出现条带。该研究结果为研究链霉菌DDE转座酶基因的表达机制提供了重要信息,对以后鉴定DDE转座酶活性以及它的结构和功能奠定基础。     

抗孔雀石绿单链抗体-碱性磷酸酶融合表达和活性鉴定

采用重叠延伸的方法成功将抗孔雀石绿（malachite green,MG）单克隆细胞的轻链VL和重链VH用连接肽(Gly4Ser)3连接,形成单链抗体（single chain variable fragment,scFv）基因,并将其酶切连接进入含有碱性磷酸酶（alkaline phosphatase,PhoA）基因的载体plip6/GN中,成功构建重组质粒plip6/GN-MG-scFv。随后重组质粒转入大肠杆菌BL21,经诱导表达后,十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳和Western blotting鉴定结果表明所获得的融合蛋白scFv-PhoA大小约72 kD。利用scFv与MG特异性结合的活性和PhoA催化对硝基苯磷酸二钠的显色机制,经过直接竞争酶联免疫吸附法测定融合蛋白scFv-PhoA的IC50为9.81 ng/mL。本方法操作简单、灵敏度高且检测时间短,这为进一步进行MG免疫法快速检测提供了参考。     

乳酸片球菌素PA-1在大肠杆菌中的表达与纯化

为了实现该细菌素的外源表达,本实验首先利用聚合酶链式反应从乳酸片球菌PAF中扩增出乳酸片球菌素PA-1的结构和免疫基因,然后克隆到表达载体pGEX-6p-1,构建了N端含有GST-His-DDDDK标签的重组质粒pGEX/his-pedAB,然后转化进入大肠杆菌Rosetta（DE3）感受态细胞,经异丙基硫代半乳糖苷诱导,重组乳酸片球菌素PA-1在大肠杆菌胞内成功表达。表达的融合蛋白先经过镍亲合层析柱纯化,然后注入谷胱甘肽S-转移酶亲和色谱柱用肠激酶处理,释放出成熟的乳酸片球菌素PA-1。利用高效液相色谱和质谱技术检测乳酸片球菌素PA-1纯度。以单核细胞增生李斯特氏菌CMCC54004为指示菌,利用琼脂扩散法检验乳酸片球菌素PA-1活性。结果表明,携带GST-His-DDDDK标签的融合蛋白无活性,标签切除后其抑菌活性恢复,且其纯度达90%以上。     

花生过敏原蛋白Ara h 6基因克隆和原核表达

本实验首先从花生中提取总RNA,利用反转录聚合酶链式反应技术克隆了花生过敏原蛋白Ara h 6全cDNA,并以此为模板扩增出Ara h 6目的基因。将目的基因与pMD19-T Simple质粒进行重组后转入BL21（DE3）宿主表达菌中,异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷诱导产物表达,并利用镍离子亲和层析纯化表达产物。DNA测序结果显示Ara h 6基因片段全长为438 bp,编码145 个氨基酸,与已知该蛋白DNA序列97%相同;十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳结果显示表达产物分子质量为24 kD,与融合组氨酸标签的重组Ara h 6蛋白理论分子质量相符;质谱鉴定结果表明重组蛋白的一级结构与天然Ara h 6匹配度为100%;Western blotting结果显示融合蛋白能够为抗Ara h 6多克隆抗体所识别,具有免疫原性。     

假肠膜明串珠菌甘露醇脱氢酶基因的克隆及表达

利用聚合酶链式反应从假肠膜明串珠菌中扩增出甘露醇脱氢酶（mannitol dehydrogenase,MDA）基因的结构基因,克隆入表达载体pETDuet-1,构建了甘露醇脱氢酶表达质粒pETDuet-1-mdh,将其转化进入大肠杆菌BL21(DE3),经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷诱导表达。假肠膜明串珠菌甘露醇脱氢酶结构基因长度为1 017 bp,重组甘露醇脱氢酶基因在大肠杆菌内成功表达,其蛋白质分子质量为36.0 kD;重组甘露醇脱氢酶活力为0.15 U/mg pro,高于假肠膜明串珠菌中甘露醇脱氢酶活力0.03 U/mg pro。     

电化学纳米免疫传感器在食品安全检测中的应用展望

电化学纳米免疫传感器具有检测快速、灵敏、操作简单等优点,在医药、食品、环境及生命科学等领域显 示了巨大的应用潜力。本文分析比较了电化学纳米免疫传感器与分析化学仪器检测、免疫检测、以聚合酶链式反应 为基础的分子生物学测定技术和基于表面等离子共振、生物薄膜干涉技术的检测方法的优缺点,讨论了电化学纳米 免疫传感器本身所面临的免疫结合信号放大处理和商业化应用的两个关键问题,最后,概述了纳米材料在免疫传感 器中的应用及电化学纳米免疫传感器在食品检测中的应用并对其在食品检测领域的未来发展作了展望。     

拉曼光谱法分析凡纳滨对虾冻藏过程蛋白质与水分结构变化

探明冻藏过程中凡纳滨对虾肌肉蛋白质与水分的结构变化有助于揭示蛋白质冷冻变性机理,采用拉曼光谱技术对凡纳滨对虾肌肉蛋白质在不同冻藏温度条件下的二级结构进行分析,并结合重水置换技术表征肌肉蛋白质的氘代动力学,从蛋白质结构和表层水分子角度研究冻藏温度对蛋白质冷冻变性的影响。结果表明：冻藏过程中蛋白质的二级结构由规整转向松散,肽链展开,且－18 ℃冻藏的蛋白质结构松散性比－40 ℃显著;伴随蛋白质结构的展开,表面疏水性增加,蛋白质与表层结合水的相互作用减弱,且冻藏温度越高,相互作用减弱越剧烈,蛋白质结构也越不稳定,水分越容易流失;而冻藏温度越低,蛋白质与水分的相互作用越强,蛋白质结构越稳定,越有利于保持对虾原有品质。     

黑豆脂氧合酶的制备及其酶学活性的鉴定

从黑豆种子中分离纯化1 种黑豆脂氧合酶--bsLOX,对其酶学活性及降解花色苷等性质进行初步研究。采用缓冲液抽提、硫酸铵沉淀、透析、阳离子交换层析及凝胶层析等方法纯化出具有β-葡萄糖苷酶活性的bsLOX;分别以亚油酸钠和对硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷（p-nitrophenyl β-D-glucopyranoside,pNPG）为反应底物鉴定bsLOX的脂氧合酶活性和β-葡萄糖苷酶活性。从黑豆种子中纯化获得的bsLOX在十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electropheresis,SDS-PAGE）图谱显示单一条带,分子质量约为95 kD。酶活性分析表明,纯化的bsLOX以亚油酸钠为底物时,酶活力为13 U/mL;当以pNPG为底物在405 nm波长处检测到了对硝基苯酚的生成,从而推测bsLOX具有β-葡萄糖苷酶活性。高效液相色谱实验结果表明bsLOX可以降解花色苷（矢车菊素-3-O-葡萄糖苷、矮牵牛素-3-O-葡萄糖苷）为花色素（矢车菊素、矮牵牛素）。由于降解作用不完全,继而发现花色素能抑制bsLOX的酶活性。bsLOX是黑豆中的一种兼具β-葡萄糖苷酶功能的蛋白质,而花色素可能是天然的bsLOX抑制剂。     

凡纳滨对虾过敏原结构与性质的研究进展

凡纳滨对虾是一种营养价值高且具有致敏性的水产品,其引发的过敏反应逐渐引起研究者的重视。本文综述了凡纳滨对虾中4 种分子质量在20～80 ku范围的过敏原蛋白（即原肌球蛋白、精氨酸激酶、肌球蛋白轻链以及肌浆结合蛋白）的性质、分子组成、空间结构及其各蛋白的致敏表位等诸多方面,这些将十分有益于更好了解这些过敏原蛋白的致敏机理以及降低过敏原性。