一株产γ-氨基丁酸屎肠球菌的筛选和发酵条件优化及其益生特性分析

为拓宽产γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid,GABA)微生物资源,以四川泡菜为分离源从中筛选高产GABA乳酸菌菌株,并对高产乳酸菌菌株进行生理生化、分子生物学鉴定,高产GABA发酵条件优化及其益生特性分析。结果表明:采用高效液相色谱对菌株产GABA能力分析发现菌株AB157的GABA产量最高为1.08 g/L。生理生化和16S rRNA鉴定菌株AB157为屎肠球菌(Enterococcus faecium)。通过单因素实验和响应面优化,确定屎肠球菌AB157的最佳培养条件为L-谷氨酸钠底物浓度5.2 g/L、发酵温度31 ℃、初始pH7、发酵时间70 h,在此条件下,屎肠球菌AB157的GABA产量达到1.60 g/L。屎肠球菌AB157的益生分析表明,其在pH2.0和3 g/L的胆盐环境中的存活率分别为39%和59%,胆固醇的脱除量为18.09 μg/mL,说明该菌株具有良好的耐酸和耐胆盐特性以及较强的降胆固醇能力,可作为潜在功能性乳酸菌资源进行后续研究开发。     

732阳离子交换树脂对屎肠球菌谷氨酸脱羧酶活性的促进作用

通过对732阳离子交换树脂对屎肠球菌谷氨酸脱羧酶（glutamate decarboxylase,GAD,EC4.1.1.15）活性的影响进行探讨,构建了732阳离子交换树脂-细胞GAD复合转化体系。结果表明：经含0.2?mol/L?L-谷氨酸（L-glutamic acid,L-Glu）的0.2?mol/L乙酸-乙酸钠缓冲液（pH?4.2）平衡的732阳离子交换树脂可显著提高屎肠球菌细胞GAD的转化活性,γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid,GABA）产量较对照组增加了32.30%;L-Glu/谷氨酸一钠（monosodium glutamate,MSG）（2∶1）固体混合物能有效调节反应体系的pH值和维持反应液的底物浓度,显著增加GABA产量,当添加量为30?g/L时,GABA产量较不添加L-Glu/MSG（2∶1）固体混合物的对照组提高了52.40%;732阳离子交换树脂与L-Glu/MSG（2∶1）固体混合物对细胞GAD的转化活性具有协同促进作用,适宜的732阳离子交换树脂-细胞GAD复合转化体系组成为732阳离子交换树脂10?g、0.3?mol/L?MSG溶液（溶于0.2?mol/L乙酸-乙酸钠缓冲液,pH?4.2）10?mL、100?mg/mL屎肠球菌细胞悬液10?mL和L-Glu/MSG（2∶1）混合物30?g/L。在该反应体系下,80?r/min、40?℃水浴振荡器反应24?h,GABA产量为（4.57±0.11）mmol,较对照组GABA产量（（2.29±0.08）mmol）提高了99.56%。     

米糠中产γ-氨基丁酸细菌分离及其接种发酵研究

利用薄层层析初步筛选出米糠中产γ-氨基丁酸（GABA）能力较强的菌株,对其16S rDNA序列进行分析,确定菌株种类;用氨基酸自动分析仪进一步筛选出高产GABA菌株;将高产GABA菌株接种到米糠进行发酵试验。结果表明,陈米糠更有利于分离到高产GABA菌株;筛选到产量较高的菌株16S rDNA序列分别与屎肠球菌（Enterococcus faecium）、棉子肠球菌（Enterococcus raffinosus）、大肠埃希氏菌（Escherichia coli）、短乳杆菌（Lactobacillus brevis）和宋内志贺杆菌（Shigella sonnei）相似性最高;接种单菌种发酵不能明显提高米糠中GABA含量,但混合接种地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）DY和乳酸菌L-44A可以使其含量达到184.6 mg/100 g（干质量）;利用蛋白酶处理米糠后接种乳酸菌L-44A可以使米糠中GABA含量达到245.8 mg/100 g（干质量）。     

双向单因素与田口法优化屎肠球菌产谷氨酸脱羧酶培养基

采用双向单因素试验法及田口法,对屎肠球菌产谷氨酸脱羧酶（glutamate decarboxylase,GAD）的培养基进行了优化。结果表明,在筛选的4 种培养基中,蛋白胨-蔗糖-牛肉膏（peptone-sucrose-beef extract,PSB）培养基最利于屎肠球菌产GAD,但其配方中的CaCl2、K2HPO4和柠檬酸铵对GAD合成不利,蛋白胨、蔗糖、乙酸钠和谷氨酸一钠（monosodium glutamate,MSG）对GAD合成影响极显著（P＜0.01）,而牛肉膏对GAD合成影响不显著（P＞0.10）。Minitab软件预测培养基的最优用量组合为蛋白胨15g/L、牛肉膏10g/L、蔗糖12.5g/L、乙酸钠6.0g/L、MSG10g/L、吐温801.0g/L,预测300mL发酵醪产GAD总活力为（399.30±12.51）U。经验证,GAD总活力为（384.26±10.32）U,与预测值没有显著性差异（P＞0.05）。改良的PSB培养基的组分较优化前的PSB培养基显著减少,并更有利于GAD的合成,总酶活提高了45.71%。     

基于基因组挖掘技术的新型谷氨酸脱羧酶基因挖掘及表达鉴定

采用基因组挖掘技术,以来源于Lactobacillus brevis活性较高的谷氨酸脱羧酶（glutamate decarboxylase,GAD）LbGAD为探针,从乳酸菌（Lactococcus lactis、Lactobacillus senmaizukei）和肠球菌（Enterococcus sulfureus）的基因组中挖掘到了3 个假定的GAD基因（LlGAD、LsGAD和EsGAD）。借助pET28a质粒分别实现了这4 个基因在大肠杆菌BL21中的表达,其中LsGAD和LlGAD的表达产物可溶性较好,相应发酵液中GAD活力分别为34.17、38.91 U/mL。LsGAD的比活力、温度特性、pH值特性和Kcat/Km值也明显优于其他几个酶。此外,初步研究了全细胞催化L-谷氨酸制备γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid,GABA）的工艺,6 g/L的L-谷氨酸经过24 h转化后,GABA得率最高可达58%。本研究实现了GAD从基因组数据到真实酶的跨越,获得了1 个性能优良的GAD,并初步实现了GABA的生物合成,为实现GABA低成本、规模化的生物合成提供了科学依据。     

Lactococcus raffinolactis Y-12产γ-氨基丁酸发酵条件优化

为提高乳球菌产γ-氨基丁酸的能力,采用响应面法优化棉籽糖乳球菌Y-12产γ-氨基丁酸发酵条件。在单因素试验结果基础上,选择发酵温度、发酵时间和初始p H为自变量,以GABA产量为响应值,运用Box-Behnken法设计3因素3水平响应面设计。结果表明,响应面模型与实际情况拟合良好,能够较好预测GABA产量。获得最佳发酵条件为接种量4%、发酵温度34℃、发酵时间73h和初始pH 6.0,在此条件下GABA产量为4.06 g/L,与理论值(4.153 g/L)相比,相对误差仅为2.29%。     

732阳离子交换树脂对全细胞谷氨酸脱羧酶活性的促进机制

通过对全细胞和纯酶的对比分析,从732阳离子交换树脂对细胞转化体系pH、产物效应和底物效应的影响,对732阳离子交换树脂促进屎肠球菌全细胞谷氨酸脱羧酶(glutamate decarboxylase,GAD,EC4.1.1.15)活力的机制进行了探讨。结果显示:γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid,GABA)对全细胞GAD活性具有抑制作用,而L-谷氨酸(L-glutamic acid,L-Glu)却无此现象,并且当L-Glu浓度达到200 mmol/L以上时,全细胞GAD活性才达到最大;在pH4.2~5.8条件下,GABA解离为阳离子较L-Glu多,可与树脂平衡时所结合的L-Glu和H+发生离子交换,补充游离L-Glu,减少游离GABA,稳定反应体系pH。研究表明,732阳离子交换树脂可以通过离子交换作用而释放H+、L-Glu和结合GABA,增加反应液游离底物浓度和降低游离产物浓度,并调节反应液pH,增大细胞内外浓度差,加快细胞内外物质运送速度,从而提高全细胞GAD的表观活力。     

屎肠球菌B13产乳酸菌素的发酵条件优化

为提高屎肠球菌B13乳酸菌素的产量,以接种量、培养基初始pH值和发酵温度为考察因素,在单因素试验的基础上,利用Box-Behnken中心组和试验设计原理进行三因素三水平的响应面优化分析,优化后的最佳培养条件为:接种量4.4%、培养基初始pH 5.3、发酵温度33℃。在此条件下,乳酸菌素的抑菌效价达5.32×10^8 IU/mL,比优化前提高1.44倍,为屎肠球菌B13乳酸菌素的开发利用提供参考依据。     

粪肠球菌(Enterococcus faecalis)和屎肠球菌(Enterococcus faecium)产生物胺交互作用研究

粪肠球菌和屎肠球菌是发酵香肠中常检出的2种主要的产酪胺和苯乙胺微生物。将粪肠球菌和屎肠球菌按照不同比例进行混合接种培养,发现在48h连续培养过程中,当粪肠球菌和屎肠球菌以1∶9比例混和接种培养时,体系pH值、细菌数量和酪胺生成量均显著低于其他各处理组;粪肠球菌有很强的产苯乙胺能力而屎肠球菌产苯乙胺能力较弱,当两者混合接种培养时,各混合体系的产苯乙胺水平相当,屎肠球菌产苯乙胺能力不受影响,而粪肠球菌产苯乙胺能力显著降低。     

响应面法优化产细菌素屎肠球菌BC-3发酵培养基

响应面分析法优化屎肠球菌BC-3产细菌素的培养基。采用不同的培养基对屎肠球菌BC-3进行培养,筛选出最适培养基。结合单因素法和响应面分析法,优化出最适屎肠球菌BC-3产细菌素的发酵培养基配比。结果表明:屎肠球菌BC-3产细菌素的最佳培养基为蛋白胨27.11g/L,牛肉膏51.65g/L,磷酸氢二钾4.78g/L,在此条件下,细菌素的产量最高,抑菌圈达到最大,为13.21mm,比优化前提高了42.81%。     

产γ-氨基丁酸乳酸菌的分离鉴定及其发酵条件优化

以浆水作为菌株分离源,分离筛选产γ-氨基丁酸（GABA）乳酸菌,采用薄层层析法和高效液相色谱法定性定量分析GABA,并对筛选菌株进行形态学观察、生理生化试验及分子生物学种属鉴定、发酵特性分析及发酵条件优化。结果表明,共分离筛选出21株乳酸菌,具有产GABA能力的有6株,经鉴定其中5株为植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）,1株为发酵乳杆菌（Lactobacillus fermentans）。选取GABA产量最高的一株植物乳杆菌,编号为2,通过单因素试验及响应面试验确定其最适发酵条件为：初始 pH值5.8,发酵温度36 ℃,发酵时间60 h。在此优化条件下,GABA产量可达0.78 g/L,比优化前产量（0.22 g/L）提高约3.5倍。     

多菌种分步发酵提高辣木籽粕蛋白含量及酶活

以辣木籽粕为底物,探究使用屎肠球菌（Enterococcus faecium）、米根霉（Rhizopus oryzae）和黑曲霉（Aspergillus niger）联合发酵辣木籽粕改善其粗蛋白、酸溶蛋白含量及蛋白酶活性的最优条件。结果表明,接种顺序对发酵效果有显著影响,最优条件为先接种黑曲霉和米根霉,发酵36 h后,再接种屎肠球菌,在培养基含水量50%,总接种量20%的条件下30 ℃发酵3 d。在此优化条件下,发酵辣木籽粕的粗蛋白含量、酸溶蛋白含量、酸性蛋白酶活性和中性蛋白酶活性分别达到46.78%、11.30%、77.06 U/g和711.93 U/g,粗蛋白和酸溶蛋白比发酵前分别提高了32.22%和121.57%,该方法可提高辣木籽粕的营养价值和消化性能。研究结果将为辣木籽粕的深加工开发提供参考依据。     

响应面法优化发酵乳杆菌产γ-氨基丁酸的培养条件

γ-氨基丁酸（GABA）是一种广泛分布于自然界的非蛋白质氨基酸,其在生物体内主要由谷氨酸经谷氨酸脱羧酶的作用下脱羟生成,是目前研究较深入的一种重要抑制性神经传递物质。为了提高发酵乳杆菌（Lactobacillus fermentum）SD2112的GABA产量,该研究通过单因素及响应面法优化了菌株SD2112转化谷氨酸生成GABA的发酵条件。结果表明,菌株SD2112产GABA的最佳发酵条件为：底物谷氨酸添加量50 mmol/L、pH值5.0、接种量5%、37 ℃恒温培养72 h。在此优化条件下,GABA产量为2.97 g/L,相比于优化前提高了2.6倍。     

表达谷氨酸脱羧酶重组枯草芽孢杆菌的构建及其发酵条件的优化

谷氨酸脱羧酶(GAD)是生物合成γ-氨基丁酸(GABA)的关键酶,本研究通过基因工程构建了一株产GAD的重组枯草芽孢杆菌,并对其产GAD的发酵条件进行优化。分别通过单因素法、正交实验、极差分析和响应面法确定了最佳培养基成分(g/L)及发酵条件为:蔗糖23.5,豆粕10、乙酸铵为8.5、磷酸二氢钾4.1、七水硫酸镁0.5,p H7.0,培养温度37℃。在优化条件下GAD酶活达到0.413 U/m L,与优化前的GAD酶活0.143 U/m L相比,酶活提高了188.8%。本研究有助于后续开发枯草杆菌生产γ-氨基丁酸的工艺,以克服现在γ-氨基丁酸生产工艺中,大肠杆菌安全性的问题和乳酸菌成本过高的问题。     

生物转化γ-氨基丁酸酿酒酵母的筛选及其在桑葚酒酿造中的应用

为获得产γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric,GABA)并酿造桑葚酒性能良好的酵母菌,采用纸色谱定性分析从四川泡菜中分离筛选出3株产GABA酵母菌,经生理生化和18S r RNA测序分析,菌株JM009和JM037被鉴定为酿酒酵母(S.cerevisiae),菌株JM024被鉴定为C.tanzawaensis。通过高效液相色谱对酵母菌GABA表达能力评估发现,酿酒酵母JM037发酵产GABA的能力较强,达670 mg/L。进一步对其进行耐受性和桑葚发酵性能分析,结果表明,酿酒酵母JM037对酒精、SO2、葡萄糖和pH的综合耐受性良好,并在发酵桑葚果汁后,乙醇产量在168 h达到38.36 g/L,残糖质量浓度在216 h降至3.06 g/L,GABA质量浓度在144 h提高到1 145 mg/L,以安琪酵母为参考,乙醇产量和残糖质量浓度差异不大,但酿酒酵母JM037具有独特的产GABA能力。因此,酿酒酵母JM037具有酿制富含GABA桑葚酒的潜力。     

纯种发酵对小米淀粉分子结构及老化特性的影响

利用自然发酵液中对淀粉老化特性起主要作用的菌种发酵,研究发酵对小米淀粉分子结构及老化特性的影响。采用0.2 g/100 m L的NaOH溶液提取发酵后的小米淀粉,研究不同菌种发酵后对小米淀粉颗粒特性、官能团、分子质量、糊化及老化特性的影响。结果表明:发酵未改变淀粉的偏光十字;植物乳杆菌、戊糖片球菌和屎肠球菌发酵后小米淀粉表面被侵蚀,酿酒酵母及芽孢菌发酵后淀粉颗粒表面侵蚀迹象变重,孔道加深且数量增多;酿酒酵母及芽孢菌发酵后小米淀粉官能团区的峰位未变,但特征峰强度减弱,植物乳杆菌、戊糖片球菌及屎肠球菌发酵后小米淀粉指纹区图谱部分消失;植物乳杆菌发酵后Ⅰ区、Ⅱ区的重均、数均分子质量较小米淀粉降低。戊糖片球菌、屎肠球菌、酿酒酵母发酵后Ⅰ区的重均分子质量升高,数均分子质量降低,Ⅱ区重均、数均分子质量降低。芽孢菌发酵后Ⅰ区的数均分子质量略有升高,Ⅱ区重均、数均分子质量降低。植物乳杆菌、戊糖片球菌及屎肠球菌发酵后淀粉的糊化温度、回生值及最终黏度降低,热焓值升高。酿酒酵母发酵后糊化温度及回生值降低,最终黏度及热焓值升高。发酵使淀粉的分子结构、支链淀粉及直链淀粉分子发生改变,短期抗老化性能提高。     

谷氨酸脱羧酶基因的挖掘、表征及全细胞制备γ-氨基丁酸的研究

γ-氨基丁酸是一种重要的生物活性因子,通过谷氨酸脱羧酶（GAD）使L-谷氨酸脱羧而合成。作者首先将酿酒酵母谷氨酸脱羧酶基因进行克隆并实现其在大肠杆菌中表达。通过亲和层析纯化获得了比活力高达66.55 U/mg的重组酶ScGAD。进一步酶学性质分析结果表明,ScGAD最适反应温度为60 ℃,最适反应pH 为4.0,且在30~50 ℃、pH 4.0~9.0时表现出优越的稳定性;其动力学参数Km为14.28 mmol/L,对L-谷氨酸具有较好的亲和力。最后通过全细胞制备γ-氨基丁酸（GABA）的最适条件探究,得到GABA生成效率最高的条件为60 ℃、pH 4.0,在此条件下,100 mmol/L底物L-谷氨酸经全细胞催化可合成GABA 35.9 g/（g·h）。该研究为GABA高效生产提供依据。     

乳酸菌发酵香菇柄酶解物产γ-氨基丁酸的研究

为了提高香菇柄的功能性,研究了香菇柄酶解产谷氨酸的工艺,并在此基础上以酶解物为培养基,进行了乳酸菌发酵产γ-氨基丁酸的试验。结果表明:香菇柄酶解最优工艺条件为酶解温度55℃,加酶量0.35%,酶解时间60min,固液比1:20,该工艺下谷氨酸含量达到6.982mg/m L;产GABA的最佳发酵条件为接种量4%,发酵温度37℃,发酵初始p H值6.0,发酵时间60h,在此条件下,GABA产量为84.34mg/L,是发酵前GABA产量的2.65倍。研究结果为今后开发新型功能性香菇制品提供了基础。     

产γ-氨基丁酸乳酸菌的发酵条件优化

为了发掘特色酸乳中的优质乳酸菌资源,提高菌株的γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid,GABA）产量,对前期一株分离自传统酸乳中的产GABA戊糖乳植杆菌（Lactiplantibacillus pentosus,L.pentosus）Z6-15,通过单因素试验及响应面设计法优化其GABA发酵工艺。结果表明,菌株的最佳发酵工艺：葡萄糖20 g/L、酵母粉10 g/L、蛋白胨11.5 g/L、乙酸钠 5 g/L、L-谷氨酸钠（sodium hydrogen glutamate,L-MSG）4.5 g/L、K2HPO42 g/L、柠檬酸三铵 2 g/L、MnSO40.05 g/L、MgSO40.2 g/L、吐温-80 0.1%、初始pH值5.5,接种量4%、装添量175 mL,此优化条件下,菌株于37℃、160 r/min发酵培养72 h后,其GABA产量为3.96 g/L,较优化前提高了39.63%。     

酵母浸出物对屎肠球菌活菌数的影响

屎肠球菌(Enterococcus faecium)发酵饲料中的活菌数是保证其功能特性的关键因素,为了提高屎肠球菌发酵过程中的活菌总数,本研究以屎肠球菌为试验菌株,选用4种不同特性的酵母浸出物来考察其对屎肠球菌活菌数的影响。通过单因素试验,确定以酵母浸出物为唯一氮源培养屎肠球菌的活菌数,根据酵母浸出物检测指标找出影响屎肠球菌活菌的关键因子。试验结果表明,培养基中主要提供生长因子和微量元素的酵母浸出物对屎肠球菌的活性有明显的影响,其中游离核苷酸的含量是影响屎肠球菌发酵活菌数重要因子,通过外源添加一定量的游离核苷酸,厌氧培养12 h,获得的最终活菌数为176×10~8 CFU/m L,与未添加游离核苷酸相比,活菌数提高了将近40%。结果显示,在培养基中添加一定量的游离核苷酸可提高屎肠球菌在发酵液中活菌数量,为工业化生产高活菌数的饲用屎肠球菌提供参考和借鉴。