一种黑曲霉高耐热β-葡聚糖酶基因的克隆、表达及重组酶性质分析

通过RT-PCR克隆、鉴定了黑曲霉中编码1种葡聚糖酶基因eglA6,所编码的重组酶蛋白命名为AneglA6。通过密码子优化提高了AneglA6在巴斯德毕赤酵母中的表达水平,对重组酶进行纯化并研究酶学性质,重组酶表观分子量约为52 ku。以大麦葡聚糖为底物时,重组酶比酶活为12 450. 6 U/mg;以CMC-Na为底物时,酶活是1 645. 7 U/mg;以酵母葡聚糖等β-1,3-葡聚糖为底物时,重组酶未表现出明显的活力。重组酶最适温度为75℃,在75℃和70℃下半衰期分别为1. 9和4. 6 h。AneglA6最适pH为4. 0,在pH 3. 0～5. 5范围内具有酶活力的50%以上。AneglA6是一种在酸性和高温条件下有较高活力和稳定性的耐热内切-β-1,4-葡聚糖酶。     

黑曲霉DL08内切葡聚糖酶基因的克隆表达及酶学性质研究

通过反转录PCR(RT-PCR)从黑曲霉(Aspergillus niger)DL08中提取内切葡聚糖酶基因(GeneBank No.KJ437592),PCR测序表明该基因全长999个核苷酸,编码332个氨基酸,预测相对分子质量为36.75 kDa,等电点(pI)为4.38,命名eg1。结构域分析表明,该蛋白包括18个氨基酸构成的信号肽和C末端1个糖基水解酶家族5的催化结构域。重组内切葡聚糖酶蛋白通过Ni-NTA亲和层析柱纯化,酶学性质研究表明,以羧甲基纤维素钠为底物时重组酶最适作用pH为5.0,最适作用温度为45℃。通过薄层层析法检测重组内切葡聚糖酶酶解1%羧甲基纤维素钠的产物,主要为连续寡糖。这些特性为纤维素酶酶解纤维素生产生物化学品和可再生生物燃料提供技术参考。     

β-1，4-葡聚糖内切酶基因在大肠杆菌中分泌表达

采用重叠延伸PCR合成技术将乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)分泌蛋白基因序列usp45(81 bp)和瑞氏木霉(Trichoderma reesei)β-1,4-葡聚糖内切酶成熟蛋白序列egl3(657 bp)连接成融合基因usp45-egl3,构建了分泌型重组质粒pMG36e-usp45-egl3及重组大肠杆菌E.coli DH5α/pMG36e-usp45-egl3。分析重组大肠杆菌的表达效果及表达产物降解纤维素的能力。结果表明,重组大肠杆菌DH5α/pMG36e-usp45-egl3经14 h培养能分泌酶活为226 mU/mL的β-1,4-葡聚糖内切酶,并有效地降解了羧甲基纤维素钠。其中分泌的β-1,4-葡聚糖内切酶降解羧甲基纤维素钠生成还原糖的速率为2.35 mg/(h·mL)。     

内切葡聚糖酶基因cel7b 在里氏木霉中的同源表达

用里氏木霉（Trichoderma reesei ）作为宿主同源表达内切葡聚糖酶基因。运用聚合酶链反应（PCR）技术从里氏木霉cDNA中扩增得到内切葡聚糖酶基因cel7b序列,并将其连接到载体p18-m2上构建重组质粒,将重组质粒转化到里氏木霉菌株中,通过筛选获得表达内切葡聚糖酶的重组里氏木霉工程菌。十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）检测显示,发酵液中重组内切葡聚糖酶的分子质量约48 ku。摇瓶发酵结果显示,内切葡聚糖酶在重组里氏木霉中得到分泌表达,发酵液中的内切葡聚糖酶和滤纸酶活分别达到了726 U/mL和28.7 U/mL,分别为出发菌株酶活的2.9倍和1.1倍。玉米芯进行糖化试验结果显示,重组里氏木霉所产酶液糖化玉米芯的酶解得率为81.4%,比出发菌株提高了6.3%。     

阪崎肠杆菌α-葡萄糖苷酶基因克隆、表达及活性研究

目的:利用pET质粒原核表达体系克隆、表达阪崎肠杆菌α-葡萄糖苷酶基因,表达产物进行Ni-NTA柱纯化,利用α-葡萄糖苷酶分解4-硝基苯基-α-D-呋喃型葡萄糖的特性进行表达纯化合的蛋白活性鉴定,为进一步制备阪崎肠杆菌检测用单克隆抗体奠定了基础.方法:从阪崎肠杆菌ATCC29544标准菌株中克隆获得阪崎肠杆菌α-葡萄糖苷酶基因,连接pET22b( )表达载体后转化大肠杆菌BL21(DE3)菌株,利用不同浓度的异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导表达外源基因,分别检测不同诱导时间、不同浓度IPTG作用下表达产物,筛选高表达菌株.表达菌株大量培养后,超声波及蛋白酶K作用破菌,Ni-NTA亲和柱纯化目的蛋白,纯化产物进行酶活性的测定.结果:克隆获得的α-葡萄糖苷酶基因与NCBI收录的基因序列属等位基因,核苷酸位点有多处差异,氨基酸序列也有不同.构建表达载体并诱导表达后,十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)检测,目标蛋白相对分子质量约为65kD,与理论值相符.目标蛋白量约占菌体总蛋白量的18%.同时,由纯化结果可以看出,以500mmol/L咪唑洗脱时的纯化效果最理想,蛋白纯度可达90%以上.对表达产物进行过酶活性初步检测证重组的阪崎肠杆菌α-葡萄糖苷酶能够分解4-硝基苯基-α-D-呋喃型葡萄糖,产生蓝绿色.结论:本研究中克隆获得了阪崎肠杆菌α-葡萄糖苷酶基因,通过构建pET22b( )-Glu表达质粒转化大肠杆菌可获得基因重组的高表达菌株,表达产物具有较好的酶活性,纯化后纯度可达90%以上.     

玉米细菌性枯萎病菌EGase内切葡聚糖酶蛋白纯化研究初探

目的研究玉米细菌性枯萎病菌EGase内切葡聚糖酶蛋白纯化的方法。方法以玉米细菌性枯萎病菌(Pantoea stewartii subsp.stewartii)菌株为材料,分离纯化其内切葡聚糖酶Egase。制备EGase浓缩液,浓缩液经Sephradex~(TM)G-75凝胶过滤层析和DEAE-Sephorose Fast Flow阴离子交换柱层析等提纯步骤,获得了凝胶电泳均一的内切葡聚糖酶。结果经变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测为一条电泳带,纯化后的EGase是单体蛋白,分子量约为72.3 k Da。Egase酶反应的最适温度是60℃,最适pH为5.0。结论本研究从玉米细菌性枯萎病菌中分离得到了一种新的内切葡聚合糖酶,对其部分性质进行了表述,为后续EGase基因的克隆及表达研究提供了研究基础。     

哈茨木霉产水解热凝胶的内切β-1,3-葡聚糖酶的分离纯化

结合多种分离方法,从哈茨木霉(Trichoderma harzianum Rifai ACCC30371)的发酵产物中分离得到一种对不溶性多糖热凝胶具有较高水解活性的内切β-1,3-葡聚糖酶。结果表明,哈茨木霉发酵液经50%饱和度硫酸铵沉淀预处理后,依次经过HiPrep 26/10 desalting层析柱脱盐、QFF阴离子交换层析柱去除杂质蛋白,最终经Superdex 75凝胶柱纯化获得纯度较高的内切β-1,3-葡聚糖酶。最终酶活回收率为6.63%,内切酶比酶活由6.86U/mg提高到133.01U/mg,纯化倍数达到19.39倍。MALDI-TOF-TOF鉴定结果表明,该内切酶与产自绿色木霉的endoglucanase存在较高的同源性。     

朱黄青霉α-1,6-葡聚糖酶在毕赤酵母GS115中的异源表达

目的构建毕赤酵母基因工程菌,以实现朱黄青霉α-1,6-葡聚糖酶的异源高效表达。方法人工合成朱黄青霉HI-4的α-1,6-葡聚糖酶基因ZHdex,克隆到毕赤酵母分泌型表达载体pPIC9K,电转入毕赤酵母GS115。甲醇诱导目的蛋白表达。结果成功在毕赤酵母GS115中对ZHdex基因进行表达,SDS-PAGE表明重组毕赤酵母在66×103附近有目的蛋白表达,与理论值一致。在摇瓶水平,甲醇诱导培养120 h后,α-1,6-葡聚糖酶的最高酶活达28.79 U/mL,蛋白质浓度为0.56 mg/mL。结论获得一株重组毕赤酵母GS115-ZHdex,其产物具备α-1,6-葡聚糖酶活性,成功地实现朱黄青霉α-1,6-葡聚糖酶的异源高效表达。     

绿色木霉葡聚糖内切酶Ⅰ(EGⅠ)基因克隆与表达

绿色木霉Sn-9106是一株分解纤维素能力较强、能利用秸秆固体发酵生产纤维素酶的工业菌株.通常丝状真菌纤维素酶合成受纤维素、槐二糖等的诱导.本研究利用秸秆粉诱导绿色木霉Sn-9106纤维素酶基因,在诱导3.5d时,纤维素酶组分之一——葡聚糖内切酶Ⅰ的mRNA转录达到峰值,收集菌丝提取总RNA,以单链cDNA为模板,PCR扩增获得编码葡聚糖内切酶Ⅰ基因(egl1),去除信号肽序列后构建重组质粒PET-egl1,实现其在大肠杆菌中的表达,所得重组葡聚糖内切酶经组氨酸标签亲和层析纯化得到单一的E-GI蛋白,SDS-PAGE检测为49ku,活力为2.37U/mL.     

一株嗜热梭菌β-1,4-葡聚糖内切酶基因的克隆及表达

以嗜热梭菌(Symbiobacterium thermophilum IAM 14863)基因组DNA为模板克隆了编码葡聚糖内切酶的基因,同时将该酶基因构建于表达载体pET32a(+)中,获得重组表达载体pET32a-Glu,转化至E.coli BL21(DE3)PLYS中并进行表达。结果表明:该基因大小为1 101 bp,共编码366个氨基酸;SDS-PAGE电泳结果表明该基因在E.coli BL21(DE3)PLYS中得到了有效表达,相对分子质量约为60 kDa,纯化后重组酶活力为103 U/mL;酶学性质实验结果表明:酶最适pH值为5左右,最适反应温度为55℃,且此酶具有良好的耐热性(75℃左右)和pH值稳定性。     

Isolation and Purification of Cellulase Produced by Mixed. Fermentation of AspergiUus niger Ⅲ and Trichoderca viride Ⅰ and Their Enzymatic Properties

对黑曲霉Ⅲ与绿色木霉Ⅰ混合发酵所产纤维素酶进行了分离纯化,并对其酶学性质进行了研究。通过硫酸铵分级沉淀、Sephadex G-100凝胶柱层析,得到5个洗脱峰,其中峰2含内切葡聚糖苷酶和外切葡聚糖苷酶,且内切葡聚糖苷酶活最高;峰3含内切酶、外切酶及β-葡萄糖苷酶,酶系较全面;峰5含内切酶和外切酶;峰1和峰4没有纤维素酶活性。采用DEAF FF弱阴离子交换柱层析对峰2进行分离纯化,从中分离纯化得到1种内切葡聚糖苷酶组分,经SDS-PAGE电泳分析,其分子量为61.5 KD。酶学性质研究结果表明,CMC酶活在pH4.0～6.0的条件下,可保持初始酶活的70%～80%,最适酶反应pH值为5.0;温度在30～50℃范围内,酶活较高,最适酶反应温度为50℃,若超过60℃,酶活迅速下降。     

黑曲霉Ⅲ与绿色木霉Ⅰ混合发酵产纤维素酶的分离纯化及酶学性质研究

对黑曲霉Ⅲ与绿色木霉Ⅰ混合发酵所产纤维素酶进行了分离纯化,并对其酶学性质进行了研究。通过硫酸铵分级沉淀、Sephadex G-100凝胶柱层析,得到5个洗脱峰,其中峰2含内切葡聚糖苷酶和外切葡聚糖苷酶,且内切葡聚糖苷酶活最高;峰3含内切酶、外切酶及β-葡萄糖苷酶,酶系较全面;峰5含内切酶和外切酶;峰1和峰4没有纤维素酶活性。采用DEAF FF弱阴离子交换柱层析对峰2进行分离纯化,从中分离纯化得到1种内切葡聚糖苷酶组分,经SDS-PAGE电泳分析,其分子量为61.5 KD。酶学性质研究结果表明,CMC酶活在pH4.0～6.0的条件下,可保持初始酶活的70%～80%,最适酶反应pH值为5.0;温度在30～50℃范围内,酶活较高,最适酶反应温度为50℃,若超过60℃,酶活迅速下降。     

重组极耐热内切葡聚糖酶Cel12B的诱导条件及酶的纯化

构建重组菌(JM109/pET-20b-Cel12B)生产极耐热内切葡聚糖酶,研究了不同表达宿主、IPTG诱导时间、IPTG浓度、重组菌生长不同阶段添加IPTG对重组菌生产极耐热内切葡聚糖酶的影响。结果表明:最佳诱导时间是OD值为1.0,IPTG浓度从0.5到3.0对酶活表达影响不大,诱导8h后极耐热内切葡聚糖酶表达量基本不变,优化后重组菌(E.coliBL21-CodonPlus(DE3)-RIL/pET-20b-Cel12B)表达酶活比原来菌株(E.coliJM109(DE3)/pET-20b-Cel12B)提高了53.9%,经过热处理和亲和层析得到电泳纯的蛋白条带。     

黑曲霉Ⅲ与绿色木霉Ⅰ混合发酵产纤维素酶的分离纯化及酶学性质研究

对黑曲霉Ⅲ与绿色木霉Ⅰ混合发酵所产纤维素酶进行了分离纯化,并对其酶学性质进行了研究。通过硫酸铵分级沉淀、Sephadex G-100 凝胶柱层析,得到 5 个洗脱峰,其中峰 2 含内切葡聚糖苷酶和外切葡聚糖苷酶,且内切葡聚糖苷酶活最高;峰 3 含内切酶、外切酶及 ?-葡萄糖苷酶,酶系较全;峰 5 含内切酶和外切酶;峰 1 和峰 4 没有纤维素酶活性。采用 DEAF FF 弱阴离子交换柱层析对峰 2 进行了分离纯化,从中分离纯化得到一种内切葡聚糖苷酶组分,经 SDS-PAGE 电泳分析,其分子量为 61.5 KD。酶学性质研究结果表明,CMC 酶活在 pH4.0～6.0 的条件下,可保持初始酶活的 70 %～80 %,最适酶反应 pH 为 5.0;温度在 30～50 ℃范围内,酶活较高,最适酶反应温度为 50 ℃,若超过 60 ℃,酶活迅速下降。     

裂褶菌产内切β-1,3-葡聚糖酶的特性研究

对裂褶茵所产内切β-1,3-葡聚糖酶进行有效分离纯化并用电泳法对其纯度进行鉴定,进而研究其酶学特性.结果表明:经过DEAE-Sephadex A-50离子交换层析和Sephadex G-75凝胶过滤分离纯化得到电泳纯分子量约为45 kD的内切β-1,3-葡聚糖酶,其最适pH为5.0,最适温度为45℃;Fe<'2+>、B...     

β-伴大豆球蛋白α-亚基核心区的基因克隆、表达及纯化

利用RT-PCR技术获得了齐黄34大豆种子的全长cDNA,采用自行设计的引物对目的基因αc进行扩增,并将目的基因与载体连接,构建了重组克隆载体pGEM-α_c。重组克隆载体经XhoⅠ/EcoRⅠ双限制酶酶切鉴定后,与载体pET-28a连接构建重组质粒pET-28a-α_c,经菌落PCR、双限制酶酶切及测序判定准确后,将其转入到感受态细胞E.coli BL21(DE3)中,当诱导温度为37℃、菌液OD_(600nm)值为0.8、诱导剂(IPTG)浓度为0.2mmol/L,诱导时间为9h时,重组α-亚基核心区蛋白分子质量为50kU;工程菌pET-28a-α_c-BL21经超声破裂、低温离心后,上清液利用镍离子亲和层析色谱柱经AKTA蛋白纯化系统纯化可以获得较高纯度的目的蛋白。     

黑曲霉内切β-1,3(4)-葡聚糖酶的基因克隆与酶学特性分析

基于黑曲霉CBS 513.88的基因组信息,以黑曲霉CICIM F0510为出发菌株,提取其总RNA,反转录得到c DNA,成功将其3个内切β-1,3(4)-葡聚糖酶的基因(en3g A、en3g B、en3g C)在毕赤酵母中进行了克隆与表达。获得了3个重组菌GS115(p PIC-en3g A)、GS115(p PIC-en3g B)和GS115(p PIC-en3g C)。在摇瓶水平上,这株重组菌的酶活分别为1.3、8.5和10.1 U/m L。重组酶En3g A、En3g B和En3g C的最适作用温度分别为65、50和55°C;最适作用p H分别为5.0、5.0和3.5。此外,3种重组酶对羧甲基纤维素钠(sodium carboxymethylcellulose,CMC-Na)和凝结多糖都具有典型的内切水解作用。这3个重组β-1,3(4)-葡聚糖酶具有良好的温度和p H稳定性,可为其在啤酒制造以及饲料加工过程中的应用奠定基础。     

裂褶菌产内切β-1,3-葡聚糖酶的分离纯化

采用不同饱和度的硫酸铵溶液对内切β-1,3-葡聚糖酶粗酶液进行分段盐析,以确定最佳盐析条件,将盐析处理后的酶液经透析浓缩、DEAE-Sephadex A-50离子交换层析、Sephadex G-75凝胶过滤层析等进一步分离纯化,浓缩纯化后的含酶组分,经过SDS-PAGE电泳分析其纯度并初步确定其分子量。结果显示:经过纯化后的内切β-1,3-葡聚糖酶的比活力由20.90U/mg提高到933.37U/mg,纯化倍数为44.7倍,酶活回收率为11.6%,电泳分析呈单一条带,分子量近似为45ku。     

建鲤组织蛋白酶L的克隆表达、纯化及活性特征鉴定

首先采用TA克隆技术克隆建鲤组织蛋白酶L(Cathepsin L,CAT L)成熟肽基因片段并进行双酶切鉴定,进而构建表达载体CAT L-p ET-30a并转入宿主菌E.coli BL21,经1 mmol/L异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)在37℃诱导2 h表达重组CAT L蛋白。而后经尿素梯度洗涤和镍离子亲和层析纯化目的蛋白,并利用SDS-PAGE检测诱导效果和纯化过程。最后以荧光合成肽底物(Z-Phe-Arg-MCA)测活法鉴定建鲤重组CAT L的热稳定性、p H稳定性,以及鱼糜生产和冻藏中常用添加剂对其活性稳定性的影响。双酶切鉴定结果表明成功克隆了目的基因片段,与鲤鱼CAT L基因序列相似性为99.11%。SDS-PAGE分析表明经诱导、尿素梯度洗涤及亲和层析后,成功获得高度纯化目的蛋白,分子量约28 ku。活性鉴定结果表明重组CAT L在20~50℃及p H3.0~6.5范围内稳定;氯化钠、焦磷酸钠对重组CAT L活性的抑制作用呈现剂量依赖关系,而各浓度蔗糖、山梨醇则对其活性无明显作用。本研究成功克隆、表达和纯化了建鲤CAT L,并阐明了热、p H及鱼糜生产和冻藏中常用添加剂对该酶稳定性的不同影响。     

海洋细菌Pseudoalteromonas sp.NJ631胶原蛋白酶的克隆与表达

对交替假单胞菌Pseudoalteromonas sp.NJ631基因组中潜在的胶原蛋白酶基因进行克隆与表达,并鉴定重组蛋白PNJC的酶活力。根据NJ631基因组序列草图,利用基因组信息发掘方法获得胶原蛋白酶功能提示的编码基因,进而利用高效表达质粒p ET28a构建重组表达系统。经IPTG诱导表达、亲和层析纯化获得重组蛋白纯化产物。以不溶性Ⅰ型胶原蛋白为底物,测定胶原蛋白酶酶活力。对Pseudoalteromonas sp.NJ631基因组信息挖掘,从中发现一条疑似编码胶原蛋白酶的基因序列,命名为Pnjc。该基因全长1 359 bp,GC含量45.62%,编码由452个氨基酸残基组成的约51 000大小的胶原蛋白酶。SDS-PAGE检测表明,胶原蛋白酶PNJC在0.2 mmol/L的IPTG诱导下得到高效表达。经过亲和层析获得纯化重组蛋白PNJC,蛋白质质量浓度约为1 mg/m L。酶活检测表明,PNJC的酶活力为160.34 U/mg,为标准品的70.48%。PNJC高酶活力表明,Pseudoalteromonas sp.NJ631来源的胶原蛋白酶具有重要的研究价值与工业开发潜力。