乳酸乳球菌硫胺素转运蛋白ThiT提高酸耐受性的机制

碳代谢引起的酸积累严重影响了微生物细胞的代谢活性。为提高细胞在酸性环境下的耐受性,通过过量表达硫胺素转运蛋白ThiT,研究了重组菌株的酸胁迫耐受性,并在此基础上通过比较转录组学对照菌株和重组菌株在正常和酸胁迫条件下关键基因的转录水平进行了研究。结果表明,经过酸胁迫（pH 4.0） 处理后,重组菌株的最大存活率优势是对照菌株的16.2倍。转录组学的分析发现,过表达ThiT转运蛋白可提高细胞对碳水化合物的转运能力,从而为细胞抵御酸胁迫的耐受性提供更多的能量;此外寡肽、甜菜碱等相关转运基因的显著上调可帮助细胞抵御酸胁迫的损伤。作者探究了在乳酸乳球菌中过表达ThiT转运蛋白提高细胞酸胁迫耐受性的具体作用机制,为ThiT蛋白在其他工业微生物中的应用提供了理论基础。     

植物乳杆菌L. plantarum FS5-5在盐胁迫下的蛋白质组学

L.plantarum FS5-5是一株筛选自东北传统发酵大酱、具有耐盐特性的植物乳杆菌。该研究利用蛋白组学双向电泳技术,比较了其在Na Cl质量浓度分别为0、3 g/d L的MRS培养基中生长至对数生长中期的蛋白组学表达差异情况。结果表明,有16个蛋白质点的表达发生了明显的变化,经过基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱鉴定,其中有12个蛋白质点鉴定出来,包括10个表达增强的蛋白质,分别为UDP-N-乙酰氨基葡萄糖二磷酸化酶、6-磷酸葡萄糖脱氢酶、半胱氨酸氨基肽酶、UDP-N-乙酰胞壁酰丙氨酸-D-谷氨酸连接酶、前噬菌体蛋白、ABC转运蛋白(铁硫聚类组装蛋白)、胆盐水解酶、谷氨酰胺合成酶、6-磷酸葡萄糖脱氢酶、Xaa-蛋白二肽酶;还有2个表达减弱的蛋白质,分别为腺苷酸琥珀酸合成酶,丙酮酸激酶。盐胁迫可诱导乳酸菌产生复杂的盐应激反应,涉及不同的代谢调控途径。     

比较基因组揭示广西酸菜乳杆菌碳水化合物活性酶谱

微生物中的碳水化合物活性酶(carbohydrate active enzymes,CAZymes)具有降解植物组织的作用,相对于真菌,目前对于乳杆菌的CAZymes研究还比较少。该研究从广西酸菜中筛选获得了3株产CAZymes的乳杆菌,并通过二代测序技术比较其编码基因。16S rRNA测序结果表明3株乳杆菌分别是Lactobacillus brevis DC4,Lactobacillus plantarum GLKK1和GLKK2;经液态发酵后,L.brevis DC4产果胶酶、纤维素酶和半纤维素酶分别为(0.40±0.01)、(0.04±0.01)和(0.19±0.01)U/mL。乳杆菌DC4、GLKK1和GLKK2编码序列分别有2615、3355以及3270个,COG注释均集中在碳水化合物转运与代谢、转录、氨基酸转运与代谢等;CAZymes注释均集中在糖苷水解酶(glycoside hydrolases,GHs)、糖基转移酶(glycosyl transferases,GTs)和碳水化合物酯酶(carbohydrate esterases,CEs)。3株乳杆菌包含17种CAZymes共有基因,包括纤维素、半纤维素、果胶、淀粉水解酶和酯酶。此外,L.brevis DC4菌株有10种特有基因,包括GH8、GH30和GH51家族,而L.plantarum GLKK1和L.plantarum GLKK2包含7种特有基因,包括GH39、GH13、CE2和GH78家族。     

保加利亚乳杆菌不同环境胁迫的交互保护作用及其基因表达分析

保加利亚乳杆菌是发酵乳制品常用主要菌种,经常受到多种环境胁迫。为了深入揭示其抗逆保护机制,在确定保加利亚乳杆菌模式菌株ATCC 11842不同环境胁迫(酸、盐、胆盐、氧、冷)下的亚致死与最低致死条件的基础上,通过比较不同环境胁迫亚致死条件处理后的菌体细胞的存活率变化,研究菌体细胞在多重胁迫环境下的交互保护作用。根据前期ATCC 11842菌株在酸胁迫和酸冷胁迫条件下转录组学测序结果,从响应酸胁迫的基因中选取与糖代谢、氨基酸代谢、转运系统、分子伴侣、应激等相关11个基因,利用RT-qPCR技术分析11个基因在不同环境胁迫下转录水平的表达量变化。结果表明:ATCC 11842菌株经酸胁迫和氧胁迫亚致死条件(pH 4.8,40 min;15 mmol/L H2O₂,1 h)预处理后,均可显著提高最低致死条件下的存活率,在ATCC 11842菌株体内响应酸胁迫的11个基因中,有10个基因也响应其它不同环境胁迫,并探明这10个响应酸胁迫的基因(LDB_RS02110、LDB-RS00810、LDB_RS04920、LDB_RS05285、LDB_RS00230、LDB_RS06340、LDB_RS05615、LDB-RS01180、LDB_RS06995、LDB_RS03130)在不同环境胁迫下的表达变化。     

5株发酵食品源乳酸菌的抗药性分析

以实验室前期分离自混合果蔬酵素的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum S)、分离自树莓酵素的植物乳杆菌(L. plantarum WD)和分离自不同奶制品的保加利亚乳杆菌(L. bulgaricus LB-DR)、鼠李糖乳杆菌(L. rhamnosus Lr-05-281)与干酪乳杆菌(L. casei D-400)5株乳酸菌为研究对象,采用平板药敏纸片扩散法、PCR及RT-PCR技术从表型、基因型以及基因表达几个方面分析菌株的抗药性。结果表明5株菌对氨基糖苷类、喹诺酮类、糖肽类抗生素、多粘菌素B均有抗性;对大环内酯类、四环素类、磺胺类抗生素、呋喃妥因均敏感,并有较为相似的耐药谱;而对不同的β-内酰胺类抗生素敏感性不同;5株乳酸菌均含有质粒,供试的12个抗性基因中,在质粒上检测到erm、aph、vanⅠ、aacⅠ4种抗性基因,基因组DNA上检测到aph、erm、vanⅠ、blaⅡ、aacⅠ、aacⅡ6种抗性基因。部分抗性基因在MRS和加抗生素的MRS培养下会表达,不表达的抗性基因在相应抗生素诱导的条件下其抗性基因不表达。L. plantarum WD菌株质粒上因只含一种vanⅠ抗性基因,其应用安全性较好。     

烟草转录因子MYB12基因克隆及表达模式分析

R2R3-MYB转录因子是植物中最大的转录因子家族之一,在植物生长发育和代谢活动中发挥着重要的调节作用。为明确MYB12转录因子在烟草中的生物学功能和调控机制,同源克隆了普通烟草MYB12基因(NtMYB12a和NtMYB12b),利用实时荧光定量PCR表征基因表达模式,结合生物信息学分析对基因功能和调控机制进行了初步预测。结果表明,NtMYB12a和NtMYB12b核苷酸序列一致性为92.91%,氨基酸序列一致性为87.91%。烟草MYB12基因结构高度保守,均由4个外显子和3个内含子组成。进化分析表明,普通烟草中NtMYB12a系由绒毛状烟草MYB12基因进化而来,而NtMYB12b则来源于林烟草。NtMYB12基因表达具有时空特异性,烟草在打顶以及盐、干旱、黑暗和磷饥饿等胁迫处理后,NtMYB12a和NtMYB12b基因表达差异明显,NtMYB12a基因表达水平在打顶处理下呈现上调趋势,在盐、黑暗和磷饥饿胁迫处理下显著下调,而在干旱胁迫下无明显变化;各种胁迫处理均可诱导NtMYB12b基因表达水平的提高,预示着NtMYB12基因在烟草响应各种非生物胁迫中发挥着重要的调控作用。     

干酪乳杆菌Zhang在逆境条件下基因表达的差异分析

为了探讨益生菌干酪乳杆菌Zhang在低温、低pH值胁迫下转录水平上的基因表达差异。本文选取干酪乳杆菌Zhang中与糖代谢、氨基酸代谢、细胞膜脂肪酸以及应激蛋白等相关的12个主要基因为研究对象,将干酪乳杆菌Zhang用MRS液体培养基活化3代后置于4℃条件下进行逆境胁迫,间断性取样,采用反转录PCR对选定基因的表达水平进行动态监测。结果表明,干酪乳杆菌Zhang在低温、低pH值胁迫下,3个糖代谢相关基因(苹果酸乳酸酶基因、6-磷酸葡萄糖脱氢酶基因、UTP-葡萄糖-1-磷酸尿苷酰转移酶)、1个细胞膜脂肪酸相关基因(环丙烷脂肪酸合成酶基因)、1个应激蛋白相关基因(分子伴侣Gro EL基因)共5个基因表达上调;而DNA引发复制酶基因、3个氨基酸代谢相关基因(阳离子转运酶基因、D-谷氨酸代谢基因、ABC转运体ATP结合蛋白基因)、2个细胞膜脂肪酸基因(磷脂合成基因、短链醇脱氢酶基因)、磷酸转移酶系统丝氨酸特异性转运蛋白基因等7个基因表达下降。这为解析干酪乳杆菌Zhang在胁迫条件下的生理、生化特性的改变及其抗性机制提供了参考依据。     

副干酪乳杆菌SMN-LBK在乙醇胁迫下的转录组分析

以分离自新疆塔城地区传统马奶酒中的1株副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)SMN-LBK为研究对象,分别以4%、6%、8%、10%(体积分数)乙醇对其进行胁迫处理,其存活率依次为25.84%、18.39%、10.86%、1.67%;以10%乙醇胁迫对其进行转录组分析,研究其在乙醇胁迫下差异基因在转录水平的表达情况。转录组分析表明:表达显著下调基因有50个,分别为参与丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢1个基因,脂肪酸生物合成2个基因,ATP结合盒式蛋白转运体8个基因,磷酸转移酶系统3个基因,其余基因全为假定蛋白;表达显著上调基因28个,4个参与丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢,其余基因全为假定蛋白。选取6个差异基因进行实时荧光定量聚合酶链式反应验证转录组测序结果,两种方法的基因在表达水平上具有一致趋势。这些基因与细胞壁主要成分肽聚糖、磷壁酸的生物合成相关,其通过提高这些基因表达抵御乙醇对自身的损害。这些基因可能与副干酪乳杆菌SMN-LBK的乙醇胁迫机制密切相关。本研究为进一步阐明乳酸杆菌的耐乙醇机制提供了理论依据。     

转录组测序分析氯化钠对普鲁兰生物合成的影响

考察氯化钠对出芽短梗霉生物合成普鲁兰的影响，结果发现氯化钠有助于提高普鲁兰产量，但不利于将普鲁兰分子质量维持在较高水平。与对照组（0 g/L氯化钠）相比，实验组（3 g/L氯化钠）的普鲁兰分批发酵产量提高了17.6%，而普鲁兰最终分子质量却降低了55.8%。对出芽短梗霉细胞的转录组进行测序和分析，共鉴别出659 个显著性差异表达基因，其中实验组有227 个基因表达上调，有432 个基因表达下调。对这些差异表达基因进行基因本体论（Gene Ontology，GO）功能注释和京都基因和基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）数据库通路富集分析，结果表明氯化钠影响了部分水解酶和具有离子、小分子绑定功能蛋白编码基因的表达水平，这些基因参与碳水化合物代谢、淀粉和蔗糖代谢、糖酵解/糖异生等代谢过程，最终导致普鲁兰产量和分子质量的显著变化。     

基于转录组研究MPEF对毕赤酵母的致死机理

探究微芯片脉冲电场（microchip pulse electric field,MPEF）技术对毕赤酵母的致死效果和致死机理。在400?V电压和80?个脉冲条件下,MPEF技术可以很好地钝化毕赤酵母。借助新一代高通量测序技术对MPEF处理前后毕赤酵母基因的表达水平进行分析,将差异表达基因在基因本体（gene ontology,GO）和京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG）数据库中进行比对。测序结果表明,MPEF组和对照组差异变化显著的基因共794?个,其中上调基因361?个,下调基因433?个;在MPEF作用下,半胱天冬蛋白酶活性、丙酮酸转运等显著上调,而核苷酸代谢、核糖体生物合成、蛋白质转录翻译、RNA聚合酶活性、超氧化物歧化酶活性、跨膜运输调节、维生素代谢等显著下调。采用实时荧光定量聚合酶链式反应对6?个差异基因进行验证,得到与转录组测序结果一致的基因表达量变化趋势。毕赤酵母体内细胞结构的破坏、基因损伤、蛋白质合成和功能受限以及酶活性的改变可能是MPEF处理导致其死亡的主要原因。     

植物乳杆菌在不同盐质量浓度下生长至对数期中期全蛋白SDS-PAGE分析

以耐盐植物乳杆菌FS5-5为研究对象,采用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳技术构建了菌株在NaCl质量浓度分别为0、3、6、9 g/100 mL的培养基中生长至对数期中期的全蛋白表达图谱。通过比较分析,选取了6 个差异蛋白质条带,并采用液相色谱-质谱/质谱联用对差异蛋白质条带进行质谱分析。结果表明：1号样品条带鉴定得到6 种蛋白;2号样品条带鉴定得到11 种蛋白;3号样品条带鉴定得到9 种蛋白;4号样品条带鉴定得到4 种蛋白;5号样品条带鉴定得到15 种蛋白;6号样品条带鉴定得到15 种蛋白。去除相同的蛋白,共有45 种蛋白得到鉴定。这些蛋白大致可以分为4 类：与蛋白质合成有关的蛋白25 种;与代谢相关的蛋白10 种;与核苷酸合成有关的蛋白8 种;未知功能蛋白2 种。可能由于这些蛋白的表达发生变化,才导致菌体中蛋白质合成、能量代谢、DNA复制能够正常进行,最终使植物乳杆菌FS5-5能够更好地在盐环境下生存下去。     

植物乳杆菌分子伴侣蛋白基因在盐胁迫下的表达分析

以一株分离筛选自东北自然发酵大酱中的耐盐植物乳杆菌FS5-5为实验对象,通过实时荧光定量聚合酶链式反应技术,在转录水平上对其分子伴侣蛋白的相应基因在盐胁迫下的表达进行研究。结果表明：在菌体对数生长期,分子伴侣蛋白调控系统中,基因groEL、groES、dnaK、dnaJ、hsp1、hsp2、usp均受MRS培养基中NaCl的诱导而表达上调,并且NaCl的质量浓度越高,基因受诱导表达上调越显著,而hsp3虽受MRS培养基中NaCl的诱导表达有所上调,但其受诱导表达上调显著程度与NaCl质量浓度不呈正相关。     

基于宏基因组技术分析固态发酵枣酒酒醅的微生物多样性及关键风味基因

采用宏基因组技术分析枣酒酒醅的微生物多样性及风味形成的功能基因.结果 表明:酒醅中共鉴定出微生物37个门、1247个属、3937个种,核心菌群主要是来自厚壁菌门、乳杆菌属的布氏乳杆菌(Lactobacillus buchneri)、植物乳杆菌(L.plantarum)、类布氏乳杆菌(L.parabuchneri)等.直...     

低钾胁迫对烟草幼苗碳氮代谢基因表达谱的影响

为探索烟草响应低钾胁迫的分子机制,对K326烟草幼苗进行了0、6、12和24 h的低钾胁迫处理,并利用定制的烟草全基因组芯片,分析了烟草幼苗基因表达谱的变化。结果表明,与0 h相比,6、12和24 h的3个时间点差异表达在2倍以上(p<0.05)的基因总数为3790个。从功能方面看,这些差异表达基因广泛参与了烟草的各种生物学过程,包括抗氧化活性、应激反应、运输活性、发育过程、催化活性、生物调节、代谢过程等。其中包括了硝酸还原酶基因NIA2等10个参与烟草氮代谢的基因,以及UGP等44个参与烟草碳水化合物与糖代谢的基因。本研究结果说明,低钾胁迫对烟草的基因表达产生了广泛的影响,进而可能影响到烟草的碳氮等基础代谢。     

氨基酸对植物乳杆菌KLDS1.0391生长及细菌素合成的影响

为探究氨基酸对植物乳杆菌生长及细菌素合成的影响，调节化学成分确定培养基中的氨基酸组成，培养植物乳杆菌KLDS1.0391，采用高效液相色谱法测定乳酸含量，通过实时聚合酶链式反应（real-time polymerase chain reaction，real-time PCR）分析细菌素和氨基酸合成相关基因的表达。结果表明，天冬氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、脯氨酸、苏氨酸、酪氨酸、天冬酰胺及谷氨酰胺的缺失导致该菌生长能力和细菌素合成量均显著降低（P＜0.05）；谷氨酸、甘氨酸、丙氨酸、半胱氨酸、精氨酸、苯丙氨酸、丝氨酸、色氨酸及缬氨酸的缺失仅影响菌体生长，对细菌素合成无明显影响；而赖氨酸胁迫（缺失及过量）对菌体的生长影响很小，但却显著影响细菌素的合成。色谱结果显示，赖氨酸、酪氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、脯氨酸及苏氨酸单缺失后乳酸含量升高。real-time PCR结果表明，细菌素合成相关基因plnEF、plnD及plNC8HK因赖氨酸的缺失表达显著下调（P＜0.05），而上述基因在外源赖氨酸质量浓度达到2.0 g/L前，上调水平随赖氨酸添加量的增大而增大。氨基酸合成关键基因dapG、yclM 因赖氨酸缺失表达显著上调，相反，上述基因在赖氨酸质量浓度为2.0 g/L时表达量显著下调（P＜0.05）。由上述研究结果推测，当赖氨酸缺失时，菌体通过上调基因dapG 和yclM 的表达以合成多种蛋白质保证其正常生长代谢，赖氨酸可正向诱导该菌细菌素合成，其可能作为细菌素合成底物发挥作用。     

糖酵解途径相关基因与植物乳杆菌生理行为的相关性

研究pgm、fba、gap过表达对植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）LR-1的抗逆性、黏附和生物被膜形成的影响。结果表明，pgm、fba基因的过表达可提高植物乳杆菌LR-1的耐热性、耐酸性和抗胆盐性，这两个基因的过表达促进了该菌株生物被膜的形成和黏附。gap基因的转录水平对植物乳杆菌LR-1的抗逆性、生物被膜形成和黏附没有显著影响。pgm、fba、gap的上调提高了该菌株tuf、luxS的转录水平。这种增加在过表达pgm、fba的重组菌株中比在过表达gap的重组菌株中高。此外，生物信息学分析表明，pgm、fba可与多条途径相关的基因相关联。本研究揭示糖酵解途径相关基因在调节植物乳杆菌的抗逆性、黏附和生物被膜形成中的新作用。     

tuf基因同源超表达对植物乳杆菌LR-1生理行为的影响

采用同源超表达及电转化技术,构建植物乳杆菌LR-1的tuf基因超表达重组菌株,对重组菌株的生长情况、抗胁迫能力、黏附能力及生物被膜形成能力进行分析,并检测tuf基因超表达对其他基因的转录水平的影响。结果表明：tuf基因超表达对菌株LR-1的生长情况无非常显著的影响,但可以增强其耐热性能、黏附性能及生物被膜形成能力,且对糖酵解途径参与基因、II型群感关键基因及核糖激酶编码基因fba、pgm、gap、luxS和rib的转录水平具有上调作用。以上结果对乳杆菌的基因功能研究具有参考意义,同时为基因工程菌株在发酵菌剂或益生菌剂的开发应用领域提供了理论支持。     

基于宏基因组分析酸马奶的微生物多样性及功能基因

酸马奶风味独特、保健功能突出,这与其复杂的微生物构成密切相关.采用宏基因组技术分析酸马奶的微生物多样性,挖掘其功能基因.结果表明:从酸马奶中鉴定出的微生物分属于30个门,331个科,913个属,2692个种.优势菌种为马乳酒样乳杆菌、瑞士乳杆菌、弗氏柠檬酸杆菌、解鸟氨酸拉乌尔菌、柠檬酸杆菌和乳酸乳球菌.在COG、KEG...