饱和突变提高肌酸酶热稳定性

为提高肌酸酶(Creatinase,EC 3.5.3.3,CRE)的热稳定性,通过序列比对的方法确定了Arthrobacter nicotianae 23710 CRE热稳定性相关位点K195,并对其进行饱和突变。与野生酶相比,突变体K195V、K195T、K195C和K195L在50℃下的半衰期分别提高260%、 230%、60%和20%;其中,K195V和K195C比酶活分别提高80.7%和88.2%,其他突变体比酶活无明显变化;突变体K195V、K195T、K195C和K195L的催化效率(k_(cat)/K_m)分别提高131%、 218%、 83%和100%。结构分析发现,突变体K195V、 K195T、 K195L较野生酶分别增加了7、12和13个氢键。结果表明:对Lys195的突变可有效改变CRE的热稳定性及催化效率,且分子内部氢键的增加可能是CRE热稳定性提高的重要原因之一。     

黑曲霉内切β-1,3(4)-葡聚糖酶的基因克隆与酶学特性分析

基于黑曲霉CBS 513.88的基因组信息,以黑曲霉CICIM F0510为出发菌株,提取其总RNA,反转录得到c DNA,成功将其3个内切β-1,3(4)-葡聚糖酶的基因(en3g A、en3g B、en3g C)在毕赤酵母中进行了克隆与表达。获得了3个重组菌GS115(p PIC-en3g A)、GS115(p PIC-en3g B)和GS115(p PIC-en3g C)。在摇瓶水平上,这株重组菌的酶活分别为1.3、8.5和10.1 U/m L。重组酶En3g A、En3g B和En3g C的最适作用温度分别为65、50和55°C;最适作用p H分别为5.0、5.0和3.5。此外,3种重组酶对羧甲基纤维素钠(sodium carboxymethylcellulose,CMC-Na)和凝结多糖都具有典型的内切水解作用。这3个重组β-1,3(4)-葡聚糖酶具有良好的温度和p H稳定性,可为其在啤酒制造以及饲料加工过程中的应用奠定基础。     

菊粉外切酶的异源表达、纯化及酶学性质

将菊粉降解菌Paenibacillus sp. Lfos16的菊粉外切酶基因克隆至表达载体p ET-28a (+),转入Escherichia. coli BL21(DE3)中实现了异源表达。利用镍柱亲和层析纯化重组菊粉外切酶,并进行SDS-PAGE检测。重组菊粉外切酶的表观分子质量为87 k Da,经纯化后,重组菊粉外切酶的比酶活为348.30 U/mg。重组菊粉外切酶作用菊粉和蔗糖的酶活分别为259.37 U/m L和592.16 U/m L,I/S值为0.438,且重组酶水解菊粉的主要产物为果糖。重组菊粉外切酶最适作用温度为40℃,且当温度低于30℃时酶活较稳定;最适作用pH为6。Ag~+、Cu~(2+)、Mn~(2+)、Zn~(2+)、Hg~(2+)、Fe~(3+)具有显著抑制作用。重组菊粉外切酶对菊粉的K_m为19. 28 mg/m L,Vmax为0.18 mg/(min·m L)。     

重组极耐热内切葡聚糖酶Cel12B的诱导条件及酶的纯化

构建重组菌(JM109/pET-20b-Cel12B)生产极耐热内切葡聚糖酶,研究了不同表达宿主、IPTG诱导时间、IPTG浓度、重组菌生长不同阶段添加IPTG对重组菌生产极耐热内切葡聚糖酶的影响。结果表明:最佳诱导时间是OD值为1.0,IPTG浓度从0.5到3.0对酶活表达影响不大,诱导8h后极耐热内切葡聚糖酶表达量基本不变,优化后重组菌(E.coliBL21-CodonPlus(DE3)-RIL/pET-20b-Cel12B)表达酶活比原来菌株(E.coliJM109(DE3)/pET-20b-Cel12B)提高了53.9%,经过热处理和亲和层析得到电泳纯的蛋白条带。     

表面偶极离子亲水磁珠固定化异柠檬酸裂解酶及其表征

比较两种亲水磁珠固定化结核分枝杆菌异柠檬酸裂解酶(Mycobacterium tuberculosis isocitrate lyase,Mt ICL)并优化,为天然产物中Mt ICL先导抑制剂的亲和富集筛选提供适用的固定化酶。构建6×His-pET28a-ICL,经E.coli BL21(DE3)重组表达、Ni²⁺-NTA柱纯化和酶学性质表征获得Mt ICL(重组蛋白质)。用羧基功能化和Ni²⁺-NTA功能化制备两种表面偶极离子亲水磁珠固定化Mt ICL,比较其固载量、酶活力、稳定性及对已知抑制剂的响应。羧基磁珠固定化酶表观保留比活显著高于Ni²⁺-NTA固定化酶。当羧基磁珠与重组蛋白质加样质量比为60∶1时,固定化酶表观保留比活可达游离酶的85%,此时羧基磁珠对Mt ICL表观固载量为(7.2±0.2) mg/g(以磁珠质量计,n=3)。羧基磁珠固定化Mt ICL对衣康酸的亲和力与游离酶无显著差异(P>0.05),且稳定性更强。此羧基磁珠固定化Mt ICL可望作为磁分离、亲和富集筛选天然产物中Mt ICL抑制剂...     

Paenibacillus puldeungensis LK18普鲁兰酶基因的克隆表达及酶学性质研究

本研究根据类芽孢杆菌的普鲁兰酶基因的保守区设计兼并引物,从Paenibacillus puldeungensis LK18中扩增出普鲁兰酶基因(pul A),将其连接至p ET-28a(+)载体上,构建出重组表达载体p ET-28a(+)-pul A,转入到EscherichiacoliBL21(DE3)中,成功地表达了重组普鲁兰酶。结果表明:该普鲁兰酶基因全长1968 bp,编码655个氨基酸。通过Ni柱亲和层析纯化出重组蛋白,测定其比酶活为508.8 U/mg,分子量约为76.95 ku。该重组酶的最适反应温度为45℃,在35℃～40℃下保温120 min后剩余酶活达60%以上;最适作用p H为6.0,在p H 6.0～8.0条件具有较好的稳定性;10 mmol/L的K+和Mg~(2+)对该重组普鲁兰酶有激活作用,而Zn~(2+)、Mn~(2+)、Ni~(2+)、Fe~(2+)、Cu~(2+)、Co~(2+)、Ca~(2+)等对其有不同程度的抑制作用。本研究成功地构建出一株可高效表达普鲁兰酶的重组菌株,具备一定的工业应用价值。     

嗜热真菌单宁酶的克隆表达及在柿子汁中的应用

对嗜热烟曲霉中的单宁酶基因afTanA在毕赤酵母中进行异源表达,分析重组酶的酶学性质及其对柿子汁抗氧化性的影响。研究表明,afTanA基因由1 767 bp碱基组成,编码588个氨基酸和一个终止密码子,存在1个Kex2酶切位点(Lys315-Arg316),其催化活性位点为Ser202、Asp455和His501。重组菌株经48 h诱导,重组AfTanA酶活力达到678U/mL。AfTanA的最适反应温度为40℃,最适pH5.0。不同金属离子浓度对酶活力的影响存在差异,在低浓度(1mmol/L)条件下,Zn2+使AfTanA酶活力提高49.65%,而Cu2+和Fe3+使该酶活力分别降低约78%和98%;在高浓度(5mmol/L)条件下,Zn2+使AfTanA酶活力降低47.12%,Cu2+和Fe3+能够完全抑制AfTanA活性。柿子汁经重组单宁酶AfTanA处理后,其抗氧化性能力显著提高,DPPH、ABTS自由基和·OH清除率分别提高15.79%,12.78%,3.4%。单宁酶AfTanA在毕赤酵母中实现了高效表达,并在果汁加工工业中具有良好的应用潜力。     

嗜酸芽孢杆菌普鲁兰酶在大肠杆菌中的表达及发酵优化

为了在3L发酵罐水平上提高重组菌E.coli BL 21(DE3)/pET20b(+)-BapulA的普鲁兰酶的表达量和胞外分泌,将嗜酸芽孢杆菌普鲁兰酶(Bacillus acidopullulyticus)在大肠杆菌中进行重组表达,并在3L发酵罐水平上对重组菌进行发酵优化,考察了发酵条件对重组酶表达的影响。重组菌发酵的最佳条件为:发酵前期菌体生长温度和pH分别为30℃和7.0,当菌体浓度OD_(600)达到50时,发酵温度降低至25℃,此时调节pH为6.2,同时开始流加乳糖[0.4g/(L·h)]进行诱导;在发酵过程中,当菌体浓度OD_(600)依次达到15,45,75时,分别加入浓度为1.5g/L的甘氨酸,当菌体OD600为105时,再加入浓度为3g/L的甘氨酸。发酵结束后普鲁兰酶的胞外酶活达659.0U/mL,最高总酶活达1 910.1U/mL,与摇瓶的初始总酶活(41.1U/mL)和胞外酶活(6.5U/mL)相比,分别提高了45.4倍和100倍。     

重组发酵火腿中生物胺含量的变化

采用3种方法加工重组火腿分别为:传统非酶重组工艺(Ⅰ组),嫩化酶酶解后将其钝化、再与交联酶协同工艺(Ⅱ组)和嫩化酶酶解后不将其钝化、与交联酶协同工艺(Ⅲ组)。通过液相色谱串联三重四级杆质谱仪分析检测,从3种工艺的重组火腿中生物胺含量变化得知:在酶处理不加抑制剂的重组火腿组(Ⅲ组)中的生物胺总量最低,各处理所含生物胺均是亚精胺所占比例最高;在发酵0、7d和14d的所有样品组中,组胺、酪胺、亚精胺含量随着发酵的进行呈先升后降趋势;在最终产品中,组胺在传统工艺产品含量最高17.86μg/kg,酶解两种工艺含量相当,亚精胺在不加抑制剂工艺产品中含量最高2328.99μg/kg;腐胺和色胺均未检出。     

Thermoanaerobacter sp. X514嗜热脂肪酶LipTX的异源表达与酶学性质研究

本文克隆表达了来源于嗜热细菌Thermoanaerobacter sp.X514的嗜热脂肪酶Lip TX基因(Teth514_0029),利用亲和层析纯化了脂肪酶Lip TX,并详细研究了该脂肪酶的酶学性质。采用PCR技术扩增脂肪酶Lip TX基因,克隆到载体p ET15b中,构建重组载体p ET15b-Lip TX;将重组载体转入大肠杆菌BL21(DE3)中并利用IPTG诱导表达目的蛋白,经70℃热处理和Ni-NTA亲和层析两步纯化,得到纯化的重组酶。SDS-PAGE结果表明,脂肪酶Lip TX分子量为28 ku。酶学性质研究表明,该酶最适反应温度和pH分别为70℃和7.5;通过水解底物特异性和动力学实验,发现LipTX可以水解不同长链酰基(C_8-C_(12))的对硝基苯酚酯底物,对硝基苯酚癸酸酯是该酶最适合底物;同时该酶能够水解链长在C_4到C_(16)范围的三甘油酯底物,其中以甘油三丁酸酯为底物的酶活力最高。该酶对非极性有机溶剂(甲醇、乙醇、丙酮、DMF、DMSO和正己烷和氯仿)和变性剂(SDS、Tween-20和Triton X-100)具有较强的抗性,因此在生物催化和有机化学合成中具有广阔的开发应用前景。