基因疫苗用质粒DNA生产下游工程的概述

<正> 基因治疗的研究和基因疫苗的开发被认为是人类医学史上的两大突破。第一批基因治疗药品很快将要面市,预计到2010年,此类药品的市场收益将达到45000000$。这两种技术都需要通过载体将外源基因导入宿主细胞并整合在宿主基因上,通常使用的载体有病毒载体和质粒DNA载体,其中病毒载体在安全性方面存在不少隐患,例如可能激活致癌基因,因此人们将开发的重点放在质粒DNA载     

辛德毕斯病毒载体的研究进展

辛德毕斯病毒(Sindbis virus,SINV)是一种具有广泛宿主嗜性的正链RNA病毒,能够在许多脊椎动物和无脊椎动物细胞中有效复制。其单股基因组RNA被分成两个开放阅读框(ORF),第1个ORF编码非结构蛋白,负责病毒RNA的转录和复制;第2个ORF在亚基因组启动子控制下编码病毒结构蛋白,负责病毒RNA的包裹和病毒粒子的组装。近年来,许多基于SINV的复制子载体已被开发,这些载体能够自我复制,但只有在与表达结构蛋白的辅助RNA共转染时,才能包装成病毒样粒子。目前,SINV复制子载体已广泛应用于疫苗开发和癌症基因治疗,能够激发有效的体液免疫和细胞免疫反应。本文就SINV载体的研究进展作一综述。     

miRNA调控病毒与宿主细胞相互作用的研究进展

病毒是专性细胞内寄生物,其复制很大程度上依赖于宿主细胞。病毒与宿主细胞的相互作用对二者均具有重要意义。微小RNA(miRNA)是在多细胞真核生物中新近发现的一类重要的基因表达转录后调控分子,其作为关键的效应分子,在复杂的病毒与宿主相互作用网络中发挥重要作用。病毒和宿主细胞均可编码miRNA。病毒编码的miRNA能够直接改变宿主环境,包括免疫系统分子构成;而细胞编码的miRNA能够直接影响病毒的复制周期。本文主要对miRNA调控病毒与宿主细胞相互作用的最新进展作一综述。     

非复制性痘病毒载体研究进展

以症病毒为载体表达外源基因，用于制备免疫制剂的研究，目前有三条技术路线：一、增殖性重组痘苗病毒减毒活疫苗[1]；二、以痘菌病毒为载体的亚单位疫苗[2]；三、非复制性痘病毒表达载体疫苗[3,4]。众所周知，痘苗病毒作为一种预防天花的有效制剂，已被人类使用了近ZOO年，但其神经毒性和其它副反应仍是重组活疫苗发展和使用的重要障碍[5,6]；亚单位疫苗由于外源基因表达量有限，难以规模化生产；而非复制性痘病毒载体兼有免疫原性强、反应弱、无传染性等长处，因而日益受到人们的广泛关注。本文从几个方面讨论了非复制性痘病毒载体的研…     

慢病毒载体及其应用的研究进展

与其他载体相比,慢病毒载体具有携带基因片段容量大、转染效率高、可感染分裂细胞及非分裂细胞、目的基因可在宿主细胞中长时间稳定表达以及安全性好等诸多优点,现已成为转移目的基因的理想载体。本文主要就慢病毒载体及其在基因治疗、生物医药与科学研究等领域的研究进展作一综述。     

外源蛋白在大肠杆菌中的可溶性表达策略

长期以来,大肠杆菌一直是表达外源蛋白的首选表达系统. 但由于外源蛋白在表达过程中容易被宿主细胞蛋白酶降解或者形成包涵体,其应用受到了限制. 本文综述了在大肠杆菌中表达可溶外源蛋白的策略和进展,以期提高具有生物活性的外源基因的表达水平.     

应用重组痘苗病毒发展活疫苗的前景

<正> 痘苗病毒曾被用于消灭天花。近年来,由丁分子病毒学和基因工程技术的进展,痘苗病毒作为表达外源基因的载体,又重新受到科学界的注意。在实际工作中,重组痘苗病毒可被用作体外或体内表达载体:前者系在细胞培养中表达所需产物,经提纯后用于医学目的。与其他表达系统相比,本法似无     

细丝蛋白A shRNA慢病毒载体的构建及其干扰效率的检测

目的 构建细丝蛋白A(filamin A,FLNa)shRNA慢病毒载体,并检测其在肝癌细胞Hep G2和Huh7中的干扰效率。方法 通过合成干扰基因片段,插入至shRNA慢病毒载体GV298中,构建FLNa shRNA慢病毒载体shRNAFilamin1和shRNA-Filamin2,转染Hep G2和Huh7细胞,荧光显微镜下观察红色荧光表达,Western blot法检测Filamin A干扰效率。结果 构建的FLNa shRNA慢病毒载体经测序证明构建正确;转染24 h后,Hep G2和Huh7细胞可见红色荧光;转染48 h后,shRNA-Filamin1和shRNA-Filamin2的干扰效率在Hep G2细胞中分别约为45.4%和63.7%,在Huh7细胞中分别约为76.5%和78.3%。结论 成功构建FLNa shRNA慢病毒载体,在Hep G2和Huh7细胞中干扰效率较高;可与多种病毒的受体蛋白相互作用,从而参与病毒的复制周期,为今后病毒复制及其致病机理的研究提供了新的思路。     

酵母中表达基因工程重组蛋白药物的研究进展

本文主要从酵母载体系统的选择、酵母表达宿主的选择、多拷贝菌株的构建、高密度发酵培养酵母细胞、应用酵母系统表达外源基因的研究现状、酵母表达系统的缺陷及对策等几个方面综述了近年来酵母表达体系在基因工程重组蛋白药物开发方面的研究进展。     

细菌空胞及其免疫学应用

细菌空胞是没有胞质成分但保持完整细胞形态和天然表面抗原结构的细胞外膜。空胞是由革兰氏阴性细菌表达噬菌体X174基因E产生溶菌所形成的。细菌空胞可作为疫苗使宿主产生强烈的免疫反应。细菌空胞具有内在佐剂特性,可作为外源抗原、DNA和药物的载体,用于制备新型疫苗。     

HIV-1 Tat蛋白的生物学特性及其致病效应

Tat蛋白是HIV-1编码的重要调控蛋白,在病毒复制和感染致病中起重要作用。在感染细胞内,Tat蛋白与多种细胞分子相互作用,启动病毒基因组的转录,促进转录延伸,从而激活和促进病毒复制;分泌和释放至细胞外的Tat蛋白,具有独特的穿膜功能,可到达宿主多个部位,作用于多种细胞,产生多样的Tat蛋白胞外活性,如参与免疫抑制、神经系统损伤及卡波济肉瘤形成等致病过程,被称为"病毒毒素"。本文对Tat蛋白的生物学特性及其致病效应作一综述。     

重组水痘-带状疱疹病毒疫苗的研究进展

水痘-带状疱疹病毒(varicella-zoster virus,VZV)疫苗的安全性、有效性及应用价值已得到广泛认可。由于该疫苗的不良反应小,副作用轻微,且病毒基因组庞大,可容纳较大外源基因,因此,VZV株可作为一种安全的重组疫苗载体。由于可在VZV株的复制非必需区中插入单个或多个不同的抗原基因构建重组疫苗,VZV疫苗作为重组载体时,不仅可预防水痘和带状疱疹的发生,还可防治多种儿童及中老年人传染性疾病。本文就重组水痘-带状疱疹病毒(recombination VZV,r VZV)疫苗的构建及其免疫效果的研究进展作一综述。     

离子注入介导外源基因转导研究综述

低能离子对细胞表面的刻蚀和溅射作用为外源 DNA的进入提供了通道,同时离子注入又对宿主细胞的DNA产生一定的损伤,这就有可能通过选择不同的离子、离子能量和剂量实现外源DNA在受体细胞中的转导。初步论述了离子束介导外源基因转导的基本原理及其在植物、微生物转基因的应用。     

冠状病毒非结构蛋白的研究进展

近20年来,动物冠状病毒(coronavirus,CoV)变异并传播于人,引起严重的烈性传染病,在全球造成巨大的经济损失.因此,对CoV进行基础研究非常重要.CoV的非结构蛋白(non-structural protein,NSP)在病毒复制过程中发挥着重要作用,如抑制宿主的固有免疫、帮助病毒逃避宿主细胞感应、形成复制...     

法氏囊病毒B87株A节段cDNA定点突变及真核表达载体的构建

<正>分子病毒学研究领域中的反向遗传操作技术(reverse genetics),或被称为病毒拯救(the rescue of virus)技术,解决了RNA病毒基因组难以操作这一困扰研究者多年的难题。通过对病毒在cDNA分子水平上的改造,如基因突变、缺失、插入等,可对RNA病毒的基因复制与表达调控机理、病毒与宿主间的相互作用关系以及新型疫苗开发等深入研究。本文     

狂犬病病毒糖蛋白真核表达载体的构建及其在COS-7细胞中的表达

目的构建狂犬病病毒糖蛋白基因的真核细胞表达载体,并在COS-7细胞中表达。方法培养狂犬病病毒,提取负链RNA,采用RT-PCR的方法扩增糖蛋白基因,并将该基因克隆到真核表达载体pcDNA3.1(A)上,通过脂质体介导的方法,转染COS-7细胞,用ELISA及间接免疫荧光法检测狂犬病病毒糖蛋白在COS-7细胞中的瞬时表达。结果成功构建了真核表达载体pcDNA3.1(A)/G,转染COS-7细胞后,在其培养上清中未检测到狂犬病病毒糖蛋白的表达。间接免疫荧光试验表明,pcDNA3.1(A)/G能有效地表达狂犬病病毒糖蛋白于转染的COS-7细胞膜上。结论真核细胞表达载体pcDNA3.1(A)/G能够在COS-7细胞中表达狂犬病病毒糖蛋白,为开发狂犬病病毒糖蛋白基因工程疫苗奠定了基础。     

狂犬病病毒糖蛋白基因重组慢病毒载体的构建及鉴定

目的构建狂犬病病毒SRV9株糖蛋白基因重组慢病毒表达载体,并进行鉴定。方法将狂犬病病毒SRV9株糖蛋白基因克隆至慢病毒载体pLVX-ZsGreen-IRES上,筛选阳性重组克隆。将质粒pLVX-ZsGreen-IRES-SRV9G、包膜质粒pMD2.G和包装质粒psPAX2共转染293T包装细胞系,通过荧光显微镜观察报告基因表达情况。收集上清,经浓缩后接种293T细胞,进行重组慢病毒感染细胞的鉴定;用限制性内切酶切除质粒pLVX-ZsGreen-IRES-SRV9G绿色荧光蛋白基因,采用直接免疫荧光试验检测狂犬病病毒糖蛋白的表达情况。结果重组慢病毒表达载体经酶切和测序证明构建正确。荧光显微镜下可见重组慢病毒感染的293T细胞有大量绿色荧光出现,病毒滴度为3×107 IU/ml;直接免疫荧光检测表明,糖蛋白基因在293T细胞内获得有效表达。结论成功构建了狂犬病病毒SRV9株糖蛋白基因重组慢病毒载体,为狂犬病基因工程疫苗的研制奠定了基础。     

病毒的顿挫感染与免疫

病毒作用于宿主细胞时，可以表现为感染性和非感染性两种类型，在某些情况也可以介于两者之间，表现为一种半感染状态，即病毒基因在细胞内仅有不完全的复制和表达，因而能产生部分病毒结构蛋白成分，甚或全部成分，但却不能常规地装配起来，我们称此种情况为病毒的顿挫感染或夭折感染，还有些作者称之为流产性或非生产性感染等‘’－‘’一、细胞纳受性与整合基因组某些细胞感染了病毒后，在一定情况下病毒遗传成分可以逾越各种排斥，最终进入细胞核内，并部分或全部地与细胞基因组整合为一体，构成整合基因组。此病毒基因组可被宿主细胞视…     

用于癌症免疫疗法的慢病毒载体的研究进展

近年来,得益于对癌症免疫监视和逃逸机制理解的不断深入及基因转运载体的发展,免疫疗法在临床上取得了一系列的成功。本文将介绍包括慢病毒载体(lentivirus,LV)的基本结构和生活史在内的发展历程。LV应用中的最主要安全性风险来源于具有复制能力的慢病毒载体(replication competent LV,RCL),针对这一问题发展出了一系列新的LV和相应的辅助手段。目前作为癌症免疫疗法主流的过继细胞传输法包括T细胞受体(T cell receptor,TCR)-T细胞和嵌合抗原受体(chimeric antigen receptor,CAR)-T细胞疗法,其中LV已被广泛应用。此外本文还针对LV应用中的一些监管方面的问题及LV的未来发展方向进行探讨。     

肠道病毒71型2A、3C、3D蛋白的研究进展

肠道病毒71型(Enterovirus type 71,EV71)感染是引起神经系统紊乱、肺水肿、肺出血等严重疾病的主要原因。非结构蛋白2A、3C、3D是EV71在宿主细胞内完成复制和存活的基础,具有不同于肠道病毒其他成员的结构和作用机制。2A和3C蛋白可抑制宿主细胞蛋白的表达,从而促进细胞凋亡,3C蛋白还可抑制天然免疫,3D蛋白与病毒的耐高温和高度变异适应性有关。一些小分子物质可在病毒入侵的不同阶段抑制EV71感染。本文就2A、3C、3D蛋白在EV71复制过程中的结构与功能特点以及一些小分子物质在病毒复制中的抑制作用作一综述。