禽流感病毒核蛋白基因的克隆及在大肠杆菌中的表达

目的　以 1株H5N1 亚型禽流感病毒RNA为模板扩增NP全基因cDNA ,并在大肠杆菌中进行表达。方法　提取禽流感病毒RNA ,以RT PCR法扩增编码NP基因cDNA并测序 ,将其克隆到pET 2 8a原核表达载体 ,并在大肠杆菌BL2 1(DE3)plysS中表达 ,用SDS PAGE和Westernblot检测表达产物。结果　所克隆的核苷酸片段包含了核蛋白基因完整阅读框架 ,编码 4 98个氨基酸 ,构建的重组表达载体在大肠杆菌BL2 1(DE3)plysS中表达出相对分子质量约为 5 5 0 0 0的重组蛋白 ,该重组蛋白具有良好的免疫原性。结论　已成功克隆和表达了禽流感病毒核蛋白基因 ,为禽流感新型免疫学诊断试剂的研制奠定了基础     

重组人白细胞介素-10融合表达载体的构建及其在BL21(DE3)pLysE细菌细胞中的表达

目的　构建重组人白细胞介素 10 (recombinanthumaninterleukin 10 ,rhIL 10 )融合蛋白的表达载体 ,并在大肠杆菌中表达。方法　应用RT PCR方法扩增IL 10基因 ,克隆PCR产物 ,构建PCRR○T7/NT TOPOR○ IL 10重组质粒 ,以AppiedBiosystems 370 0DNA分析仪进行分析。构建成功的重组质粒转化大肠杆菌BL2 1(DE3)pLysE细胞 ,经 12 %SDS PAGE鉴定融合表达蛋白。结果　PCRR○T7/NT TOPOR○ 质粒已载入rhIL 10基因 ,其序列与理论设计完全一致 ,表达质粒在BL2 1(DE3)pLysE中得到高效表达 ,产物主要以包涵体形式存在。结论　已成功构建重组PCRR○T7/NT TOPOR○ IL 10质粒载体 ,并在大肠杆菌BL2 1(DE3)pLysE细胞内高效表达     

人Bik基因的克隆、表达与纯化

目的克隆人Bik基因,并进行表达及纯化。方法用PCR方法从HeLa细胞cDNA文库中扩增Bik基因,克隆至pGEX-6P-1表达载体,转化至大肠杆菌BL21(DE3)中,IPTG诱导表达。表达产物进行GST亲和层析纯化。结果PCR扩增得到483bp的DNA片段,重组质粒pGEX-6p-1-Bik经酶切鉴定和测序分析,表明构建正确。表达的重组蛋白占菌体总蛋白的38%,纯化后蛋白纯度达96%。结论已成功克隆并利用原核表达系统表达了人Bik基因,为进一步研究Bik蛋白结构和功能奠定了基础。     

小鼠白细胞介素-18的克隆及在原核细胞中的表达

目的克隆小鼠白细胞介素-18(mIL-18)全长cDNA,并使其在大肠杆菌中表达。方法利用RT-PCR和巢式-PCR,从活化小鼠腹腔巨噬细胞中扩增成熟IL-18的全长cDNA。经双酶切,将该cDNA片断插入表达载体pRSET-C,构建含T7启动子的原核表达载体pRSET-mIL-18。测序鉴定后,将重组体转化大肠杆菌BL21(DE3),在IPTG和/或乳糖的诱导下,使重组质粒获得表达。结果重组质粒读码框及mIL-18的序列与预期一致,表达产物经SDS-PAGE和Western blot分析获得证实。结论已成功构建了原核表达载体pRSET-mIL-18,并使其在大肠杆菌中获得了融合表达。     

人Bid蛋白的原核表达及纯化

目的克隆人Bid基因,原核表达并纯化目的蛋白。方法用PCR方法从HeLa细胞cDNA文库中扩增人Bid基因,克隆至pGEX-6P-1表达载体,构建重组表达质粒pGEX-6P-1-Bid,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达。表达产物经GST亲和层析纯化。结果PCR扩增得到588bp的DNA片段,重组表达质粒pGEX-6P-1-Bid经双酶切鉴定和测序表明构建正确。表达的目的蛋白相对分子质量约48000,表达量约占菌体总蛋白的50%,纯化后纯度可达97%。结论已成功克隆并原核表达了人Bid基因,得到纯度较高的Bid蛋白,为进一步研究其结构和功能奠定了基础。     

重组人成骨蛋白-1基因在大肠杆菌中的克隆和非诱导表达

目的　研究重组人成骨蛋白 -1(rhOP -1)在大肠杆菌中的克隆和非诱导表达。方法　利用RT -PCR技术 ,从正常胎儿肾组织总cDNA中扩增得到rhOP- 1成熟肽基因片段 ,再将rhOP- 1成熟肽基因克隆于原核融合表达载体pGEX- 4T- 2中 ,构建表达质粒pCCBC- OP- 1,并转化到大肠杆菌JM10 9(DE3)中 ,在发酵过程中不添加任何诱导剂。表达产物经SDS -PAGE分析。结果　扩增的目的基因序列与文献报道一致。表达的目的蛋白相对分子质量为 14 0 0 0 ,表达量达到菌体蛋白的 4 0 %。结论　克隆了人OP -1成熟肽基因 ,并实现了rhOP- 1的非诱导高效表达。     

人BimS蛋白的原核表达及纯化

目的克隆人BimS基因,原核表达并纯化目的蛋白。方法用PCR方法从HeLa细胞cDNA文库中扩增人BimS基因,克隆至pGEX-6P-1表达载体,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达。表达产物经GST亲和层析纯化。结果PCR扩增得到327bp的DNA片段,重组表达质粒pGEX-6P-1-BimS经双酶切鉴定和测序分析,表明构建正确。表达的目的蛋白相对分子质量约37000,表达量约占菌体总蛋白的30%,纯化后纯度可达93%。结论已成功克隆并原核表达了人BimS基因,得到纯度较高的BimS蛋白,为进一步研究其结构和功能奠定了基础。     

人白细胞介素18的基因克隆及其在大肠杆菌中的表达

目的　在大肠杆菌中高效表达IL 18。方法　从人外周血中提取RNA ,用RT -PCR方法得到IL 18的cDNA ,双酶切将其插入pET 2 3(b) + 载体中 ,转化大肠杆菌DH5α。筛选阳性菌落 ,提取质粒 ,转化大肠杆菌BL2 1(DE3)中进行表达。结果　所获得人IL 18克隆 ,经测序与GenBank报道的完全一致。所表达的产物经SDS -PAGE显示在相对分子质量 2 0 0 0 0处出现一条特殊条带 ,与预期的分子量一致。结论　已成功获得了人IL 18克隆并在大肠杆菌中表达     

鼠抑铁素2蛋白的原核表达及鉴定

目的表达鼠抑铁素2(lcn2)蛋白,并检测表达产物的生物学活性。方法从小鼠RAW264.7巨噬细胞提取总RNA,逆转录合成cDNA,以cDNA为模板,PCR扩增lcn2基因片段,插入原核表达质粒pET-32a(+),转化大肠杆菌BL21(DE3)plysS,用IPTG诱导表达。表达产物经His-tagin-gel stain鉴定后,采用Ni2+-NTA亲和层析纯化,并检测其生物学活性。结果经核苷酸序列测定和酶切鉴定,表明重组质粒pET-32a(+)-lcn2构建正确。表达的重组蛋白经SDS-PAGE分析,相对分子质量约为21000,表达量占菌体总蛋白的35%,主要以包涵体形式存在。纯化后蛋白浓度为1.0g/L,并对大肠杆菌和乙型链球菌生长有一定的抑制作用。结论成功地在原核细胞中表达了重组lcn2蛋白,且表达的蛋白具有一定的抑菌作用。     

百日咳杆菌腺苷酸环化酶毒素基因的克隆及原核表达

目的克隆百日咳杆菌腺苷酸环化酶毒素(CyaA,ACT)基因,表达并纯化重组CyaA蛋白。方法从百日咳杆菌CS株的基因组DNA中PCR扩增CyaA编码基因,克隆入载体pET30a,构建重组原核表达质粒pET30a/cyaA,转化感受态大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达。表达的重组蛋白经8mol/L尿素变性、透析复性、DEAE阴离子交换柱纯化后,采用Western blot法鉴定其反应原性。结果重组原核表达质粒pET30a/cyaA经PCR、双酶切及测序证明构建正确;表达的重组蛋白主要以包涵体形式存在,表达量约占菌体总蛋白的20%;纯化的重组蛋白纯度达90%左右,可与全细胞百日咳疫苗和无细胞百日咳疫苗免疫血清结合。结论已成功克隆了百日咳杆菌cyaA基因,并在大肠杆菌中表达了重组CyaA蛋白,为进一步开展CyaA的应用研究奠定了基础。     

人体β-防御素-3突变基因的克隆及在大肠杆菌中的表达

目的对人体β-防御素-3基因进行定点突变,并在E.coli中表达。方法从人正常皮肤组织中提取总RNA,经RT-PCR扩增编码β-防御素-3成熟肽的cDNA,测序正确后,设计含突变位点的引物,用PCR重叠延伸法对β-防御素-3成熟肽cDNA进行定点突变,将突变产物克隆至pUC18,并在E.coli中融合表达。结果测序结果表明,经RT-PCR所得的β-防御素-3成熟肽序列与GenBank中报道的序列完全一致。经过突变,β-防御素-3成熟肽第29位谷氨酰胺密码子由CAG突变为精氨酸密码子CGA,其余核苷酸序列均未发生变化。将突变β-防御素-3基因在E.coli中诱导表达后,可见突变β-防御素-3蛋白表达。结论已成功克隆并表达了β-防御素-3突变体基因。     

抗癌胚抗原单链抗体-PE40免疫毒素基因的克隆与表达

目的扩增抗癌胚抗原单链抗体(CEA-ScFv),与绿脓杆菌外毒素(PE40)进行重组及原核表达,旨在进一步研究重组蛋白CEA-ScFv-PFA0的靶向抗肿瘤作用。方法分别扩增抗癌胚抗原单链抗体的重链区、轻链区,用overlap PCR按照VH-VL的顺序连接,克隆至pMD18T载体中。再将VH-VL基因片段与含有.PE40的表达载体pET28a连接,转化B121(DE3),IPTG诱导表达。结果经DNA测序,其结果与设计完全相符。SDS-PAGE分析,在相对分子质量66000处可见明显表达带,表达量可占菌体蛋白总量的13％以上。免疫印迹表明重组蛋白具有PF40的抗原特异性。结论抗癌胚抗原单链抗体-PE40免疫毒素的成功克隆与表达,为进一步研究其生物活性奠定基础。     

嗜人类T淋巴细胞病毒Ⅰ型核心蛋白P24基因的克隆与表达

目的 从感染HTLV-1的中国患者外周血单核细胞（PBMCs）中扩增编码HTLV-1核心蛋白P24的cDNA,并在大肠杆菌中进行表达。方法 提取感染者PBMCs基因组DNA,应用巢式PCR方法扩增出HTLV-1核心蛋白P24的cDNA并测序,与pGEX-20T载体构建重组质粒,在大肠杆菌BL21中表达,采用ELISA和Westernblot分析重组蛋白活性。结果HTLV-1核心蛋白P24基因序列高度保守,构建重组载体后,在大肠杆菌中表达的重组蛋白,经检测具有较强的抗原活性。结论 成功地表达了HTLV-1型病毒的核心蛋白P24基因,为国产诊断试剂和疫苗的研发打下了基础。     

人睫状神经营养因子基因克隆、表达、纯化及其生物活性

［摘 要］目的 克隆人睫状神经营养因子（hCNTF）基因，在大肠杆菌宿主系统中高效表达并纯化，获得具有生物活性的hCNTF蛋白。方法 以人染色体DNA为模板，经PCR扩增到编码CNTF成熟蛋白的cDNA序列，并克隆进原核表达载体 pBV220，在大肠杆菌 BL21（Gold）中进行表达，产物经 CM-Sepharose FF柱纯化后，以体外培养的鸡胚背根神经节（DRG）测定生物活性。结果 重组表达质粒pBV22Z- CNTF在大肠杆菌BL21（Gold）中获得了非融合的稳定、高效表达，目的蛋白占细胞总蛋白的45％左右，以可溶性和包涵体两种形式存在，表达上清及包涵体复性后经CM柱一步纯化纯度达90％以上；表达的重组hCNTF能促进培养的鸡胚背根神经节神经突起的生长。结论 基因工程rhCNTF的获得为进一步研究其结构功能关系和临床应用奠定基础。     

人破骨细胞形成抑制因子活性域片段在大肠杆菌中的融合表达

目的　在大肠杆菌中高效融合表达人破骨细胞形成抑制因子 (Osteoclastogenesisinhibitoryfactor,OCIF)活性域片段。方法　从中国人正常肝细胞系LO2中提取总RNA ,利用RT PCR得到OCIF活性域编码基因cDNA ,将其与pMD18 T连接 ,转化大肠杆菌K80 2 ,筛选得到阳性重组克隆载体pMD18 OCIFAD ,经双酶切得到OCIF活性域编码片段 ,将其插入pMAL c2载体中 ,转化大肠杆菌TB1。筛选得到阳性重组表达子后进行诱导表达。结果　所获得的OCIF活性结构域编码序列片段经测序与GenBank报道的完全一致。所表达的产物经SDS PAGE分析可见在相对分子质量 6 0 0 0 0处出现一条特殊条带 ,与预期的相对分子质量一致。Westernblot证实了表达产物能与抗人OCIF单抗发生特异性反应。结论　已成功地获得了人OCIF活性结构域编码片段的克隆 ,并实现了其在大肠杆菌中的融合表达。表达产物对体外培养破骨细胞的骨吸收功能有明显的抑制作用。     

中国人MBL基因编码区的克隆与原核表达

目的克隆中国人MBL基因编码区序列,并在原核细胞中表达。方法提取肝总RNA,RT-PCR扩增MBL编码区序列,并克隆到pGEM-T-easy载体上,再亚克隆到pET-30(a)上。诱导表达重组MBL,并通过SDS-PAGE检测表达情况,表达蛋白经初步纯化后,用ELISA及点杂交试验检测其免疫原性。结果克隆得到长747bp的MBL编码区序列,与GenBank中的MBL序列同源性在99%以上。重组MBL相对分子质量约为36000,以包涵体形式存在,表达量占菌体总蛋白量的20%左右,表达蛋白经初步纯化,纯度可达95%以上。ELISA检测显示重组MBLA490值与阴性对照差异有显著意义(10倍以上),点杂交检测结果为阳性。结论已成功克隆中国人MBL基因的编码区序列,并在大肠杆菌中表达,表达产物与天然MBL具有相似的免疫原性。