L-苯丙氨酸酶法制备中的动力学研究

为研究酶法生产L-苯丙氨酸工艺中影响收率的主要因素,提高L-苯丙氨酸的收率,对该反应过程的动力学进行了研究。研究中采用实验检测和动力学模拟的方法获取了转化反应中的主要动力学参数。研究这些参数和L-苯丙氨酸收率间的关系发现,达到L-苯丙氨酸最大收率的前提条件是草酰乙酸的浓度趋近于0。在此前提条件下,将苯丙酮酸的浓度选在0.10~0.15 mol/L,提高体系中酶活性,降低苯丙酮酸的降解常数,可以提高体系中L-苯丙氨酸的收率。以此规律为指导,构建了合适的基因工程菌,其转氨酶活性提高4.6倍,苯丙酮酸的降解常数降低到0.0158 h-1,选择c(苯丙酮酸)=0.137 mol/L充N2的条件下进行反应,其L-苯丙氨酸收率提高到90.2%。     

酶法转化体系中L-苯丙氨酸的络合萃取

L-苯丙氨酸的分离提取对于促进酶法制备工艺的产业化进程具有重要价值。利用络合萃取分配系数、分离选择性高的特点,对苯丙酮酸酶法制备L-苯丙氨酸转化体系中L-苯丙氨酸的络合萃取进行了研究。以二(2-乙基己基)磷酸为萃取剂,研究了水相平衡pH、萃取剂浓度和稀释剂的种类对分配系数的影响;并利用D2EHPA-正辛醇体系对酶法制备L-苯丙氨酸的转化液进行了络合萃取研究,经4次萃取和1次反萃,L-苯丙氨酸的萃取率达到98 15%;经1次反萃,L-苯丙氨酸的收率达94 33%。     

科技进展

固定化细胞生产L-苯丙氨酸 南京化工大学运用固定化细胞技术生产L-苯丙氨酸的中试成果达到国际先进水平,填补了国内空白。原料苯丙酮酸的转化率接近100％,转化液含L-苯丙氨酸80克/升以上、丙酮酸35克/升;经分离、纯化,L-苯丙氨酸的提取率大于90％。原料苯丙酮酸的消耗定额约1.6吨/吨,而苯丙酮酸的工业合成也已通过中试。 化学—生物合成工艺与单一的化学合成法、发酵     

苯丙氨酸及苯丙酮酸对Lactobacillus sp. SK007合成苯乳酸的影响

从自然发酵泡菜中分离筛选到一株乳杆菌(Lactobacillus sp.)SK007，研究了Lactobacillus sp. SK007利用苯丙氨酸合成苯乳酸的过程，结果发现，在MRS培养基中最高可产生0.55 mmol/L苯乳酸，苯丙氨酸剩余94%，但检测不到中间产物苯丙酮酸，这表明苯丙氨酸的转氨反应是苯乳酸合成的限速步骤. 用苯丙酮酸代替苯丙氨酸作为底物可有效突破这一瓶颈，进一步优化了Lactobacillus sp. SK007利用苯丙酮酸合成苯乳酸的发酵条件. 当苯丙酮酸为18.3 mmol/L, 30℃静置培养24 h，苯乳酸产量可达10.25 mmol/L.     

在热管生物反应器中发酵制备L-苯丙氨酸

用在5L热管生物反应器中实体发酵所产生的大肠杆菌E．coli No．1进行苯丙酮酸转氨制备L-苯丙氨酸过程能达到较高的技术指标。在微生物生长各阶段反应器中发酵液的温度很均匀，其平均温差为0．08℃、最大温差为0．4℃。与用传统的搅拌式生物反应器相比，用热管生物反应器发酵的微生物菌体量(以OD值计)从0．40提高至0．54，其发酵液转化苯丙酮酸制备L一苯丙氨酸的平均得率从70％增加至75％。     

双酶偶联生物合成L-酪氨酸

多酶偶联催化是酶法制备手性药物中间体的重要方法之一。该文采用双酶偶联体系,利用天冬氨酸转氨酶全细胞催化L-天冬氨酸转氨至苯丙酮酸,生成L-苯丙氨酸,同时得到中间产物丙酮酸;反应体系中的酪氨酸酚裂解酶全细胞催化丙酮酸、苯酚和氨酶法合成L-酪氨酸。经考察确定了双酶偶联反应的最佳条件为:温度40℃,pH=8.5,底物苯丙酮酸质量浓度为25 g/L,苯丙酮酸与L-天冬氨酸摩尔比1∶1.2,天冬氨酸转氨酶与酪氨酸酚裂解酶细胞质量比1∶1,4 mmol/L PLP,0.1 g/L吐温80。30 g/L的氯化铵对双酶偶联反应有促进作用。双菌双酶偶联生物法合成L-酪氨酸,充分利用了反应副产物丙酮酸得到附加值较高的产品,对资源合理利用及绿色合成工艺具有参考意义。     

亚苄基海因水解制备苯丙酮酸过程的色-质联用分析

针对亚苄基海因水解体系建立了一种高效实用的液相色谱分析方法,为生产工艺控制提供了依据,并应用液-质联用技术对此体系中的未知副产物进行了初步检测。具体液相色谱条件为:流动相:乙腈 -5mmol·L-1乙酸盐缓冲液(用醋酸调pH4 5 ),流速 0 5mL·L-1;梯度洗脱;色谱柱:AgilentEclipseXDB-C8, 5μm, 4 6×150mm, 20℃;二极管阵列检测器,检测波长: 204nm。色-质联用中质谱条件为:ESI离子源,负离子模式;气帘气流量1 03×105 Pa,电喷雾电压-4 200V,离子源温度 500℃,辅助雾化气 1 37×105 Pa,干燥气 4 13×105 Pa,相对分子质量检测范围:m/z40~600。液相色谱法测定亚苄基海因和苯丙酮酸的线性相关系数为0 999 05和0 999 86,亚苄基海因和苯丙酮酸的平均回收率为 101 45 %和 97 23 %,相对标准偏差为 1 002%和0 833 8%。精密度以相对标准偏差来表示,分别为0 591 9 % 和0 648 2 %。结果表明,该液相色谱分析方法简便、快速,结果准确,可以用于苯丙酮酸生产的质量控制。     

表面活性剂双水相萃取分离氨基酸研究

用溴化十二烷基三乙铵(C12NE)与十二烷基硫钠(SDS)混合体系形成双水相,测定混合摩尔比与分相比例的关系,并以苯丙氨酸为萃取对象研究其在双水相体系中的分配及多级错流萃取效果。实验结果表明,当C12NE与SDS摩尔比为(1.6∶1)—(1.7∶1)时体系有分相,其中当C12NE与SDS摩尔比为1.65∶1时,分相所得上下相体积比为1∶1,且分相时间为10 m in左右,为适合实验条件。双水相体系萃取苯丙氨酸的结果表明,单级萃取率可达80%以上,二级萃取率可达99%以上。     

组成型天冬氨酸转氨酶基因工程菌的构建与高效表达

天冬氨酸转氨酶AspAT是苯丙酮酸转氨制备L-苯丙氨酸的关键酶. 本研究将大肠杆菌中天冬氨酸转氨酶基因aspC克隆到3种不同质粒中，构建组成型表达质粒pUC/P-aspC, pSE/P-aspC, pET/P-aspC，并分别转化至6种常用的大肠杆菌宿主中. 通过对18种重组子的生长及产酶情况的分析，比较了各种重组子生长压力、质粒稳定性与表达酶活的关系，并经SDS-PAGE电泳分析AspAT的表达量，筛选出高产AspAT的重组子BL21(pET/P-aspC)，以该工程菌发酵液直接作为酶液，以天冬氨酸和苯丙酮酸(20 g/L)为底物，发酵液与底物以1:3的体积比转化生成L-苯丙氨酸16.2 g/L，转化率高达80.1%. 该体系表达无需诱导，转化无需添加辅酶PLP，展现了良好的产业化前景.     

科技动态

合成苯丙酮酸 江苏省江都化肥厂研制成功氯苄催化羰基合成法生产苯丙酮酸的新工艺,并形成300吨的年产能力。经中国药科大学生物技术中心检测和试用,转氨酶活力、水溶性、纯度等指标超过从美国西格玛公司进口的同类产品,完全符合固定化酶转化生产L-苯丙氨酸的要求。 新工艺具有产品质量好、收率高、成本低等优点,达到国际先进水平。新工艺的研制成功表明我国即将结束进口L-苯丙氨酸的历史。目前我国L-苯丙氨酸主     

双水相体系萃取精氨酸脱亚胺酶

报道了利用聚乙二醇/硫酸铵双水相体系从自溶NJ402菌粗提酶液中分离纯化精氨酸脱亚氨酶(ADI)的研究结果,为精氨酸脱亚氨酶的分离纯化提供了一种方法。在双水相体系中采用聚乙二醇(PEG)与(NH4)2SO4为组成成分,考察了聚乙二醇(PEG)平均相对分子质量、PEG质量分数、(NH4)2SO4质量分数、pH及NaCl质量分数对精氨酸脱亚氨酶分离纯化效果的影响。最佳双水相体系萃取条件为:聚乙二醇(PEG)平均相对分子质量为1 000,w(PEG1000)=15%,w[(NH4)2SO4]=20%,pH=6.5,室温下从自溶NJ402菌粗提酶液中分离纯化精氨酸脱亚氨酶,纯化倍数达到2.35倍,萃取率达91.1%。     

双水相系统萃取细菌素发酵

以生长速率为标准,筛选出适合菌株乳酸乳球菌乳酸亚种ATCC 11454生长的成相聚合物聚乙二醇(PEG)20000、成相盐MgSO4.以细菌素浓度为筛选标准,优选出适合菌体生长及细菌素积累的双水相系统:PEG 20000 11%-MgSO4 3.5%.菌株细胞在该系统中完全分配在下相,虽然细胞的生长只有单相对照培养基的60%,但产物产量可提高33%.双水相系统系线和相体积比的改变均影响到菌体的生长及目的产物的积累.     

酶法合成头孢氨苄的反应-双水相萃取耦合过程

应用聚乙二醇(PEG)/硫酸镁双水相体系(ATPS)进行了酶法合成头孢氨苄的反应-双水相萃取的耦合过程研究.通过考察头孢氨苄、苯甘氨酸甲酯和7-氨基脱乙酰氧基头孢烷酸(7-ADCA)在ATPS中的分配行为建立了一个含20％(质量)PEG 400和12％(质量)硫酸镁的ATPS,在此体系中头孢氨苄的分配系数为6.7,苯甘氨酸甲酯的分配系数为1.5,7-ADCA的分配系数为1.2,且青霉素酰化酶的分配系数小于0.01.底物、产物以及催化剂的分配特性有利于构建双水相体系应用于酶法合成头孢氨苄的反应-双水相萃取的耦合过程.对此双水相体系中青霉素酰化酶的稳定性研究表明催化剂亦适合此体系的构建.进而将此体系应用于头孢氨苄酶法合成,产率为60％左右,相对水相体系20％左右的产率取得了较好的结果.     

双水相萃取技术研究新进展

介绍了双水相萃取技术(ATPE)在生物工程下游工程中的应用现状,综述了近年来ATPE相关研究的进展。为了提高ATPE的选择性和分离效率,不但发展了热分离聚合物体系和表面活性剂混合体系等新型双水相系统(ATPS),而且在组成传统ATPS的聚合物上耦联亲和配基的亲和ATPS也得到发展。与物理场作用、其他分离技术和生物过程的集成克服了单一ATPE的某些不足,是ATPE的发展方向。常规萃取设备和连续化操作技术在ATPE中的应用标志着其工业化日趋成熟,但建立溶质在ATPS中分配的热力学模型和相关理论有待进一步完善。     

Extractive bioconversion of xylan for production of xylobiose and xylotriose using a PEG6000/sodium citrate aqueous two-phase system

Aqueous two-phase system (ATPS) was applied for extraction bioconversion of xylan by xylanase from Trichoderma viride. Phase diagrams for poly (ethylene glycol) (PEG) and sodium citrate were determined at room temperature. The ATPS composed of 12.99% (w/w) PEG6000 and 12.09% (w/w) sodium citrate was favorable for partition of xylanase and used for extraction bioconversion of xylan. Batch hydrolysis demonstrated that higher concentrations of xylobiose and xylotriose were obtained in the PEG6000/sodium citrate ATPS compared to those in the aqueous system. These results present the potential feasibility of production of xylo-oligosaccharides by extraction bioconversion in ATPS.     

Aqueous two-phase countercurrent distribution for the separation of c-phycocyanin and allophycocyanin from Spirulina platensis

C-phycocyanin (C-PC) and allophycocyanin (APC) with similar molecular structures were separated, respectively from Spirulina platensis cell homogenate by single extraction and multi-stage countercurrent distribution (CCD) using an aqueous two-phase system (ATPS) composed of polyethylene glycol (PEG) and potassium phosphate (KPi). The partition coefficients of C-PC and APC were 10.64 and 0.57, respectively, and the extraction selectivity of C-PC was 18.67 from 0.5% (w/w) S. platensis crude extract by single extraction using PEG6000/KPi ATPS (pH 7.0) with 34% (w/w) tie line length (TLL). In ten-stage CCD under the same ATPS extraction condition with 2% (w/w) S. platensis crude extract, the purity of C-PC increased nearly twice and the recovery of APC increased more than nine-fold compared with single extraction. The results displayed that most C-PC (82.1%) followed the mobile phase was enriched in the top phases of the last three tubes, while more APC (41%) remained in the stationary phase was enriched in the bottom phases of the first three tubes in the ten-stage CCD. Hence, aqueous two-phase CCD technology provided an effective and low cost method for C-PC and APC separation from S. platensis cell homogenate directly.     

Recovery of Human Interferon Alpha-2b from Recombinant Escherichia coli by Aqueous Two-Phase System

Recovery of periplasmic human recombinant interferon alpha-2b (IFN-α2b) from Escherichia coli rosetta-gami2 (DE3) using a single-step polyethylene glycol (PEG)-potassium phosphate aqueous two-phase system (ATPS) was investigated in this study. The influences of system parameters including PEG molecular weight, tie-line length, volume ratio, crude stock loading, system pH, and sodium chloride (NaCl) concentration (%, w/w) were studied. The results showed that the optimum condition to obtain the high purification factor of IFN-α2b in a single step was achieved by ATPS composed of 4% (w/w) PEG 8000, 13% (w/w) potassium phosphate, 0.5% (w/w) NaCl, 10% (w/w) crude stock, and a system pH of 6.5. A purification factor of 26.3 and recovery yield of 40.7% were obtained from optimized ATPS.     

双水相系统分离纯化南极假丝酵母脂肪酶

对南极假丝酵母脂肪酶(CAL)在双水相中的分配情况进行了研究,考察了温度、聚乙二醇(PEG)相对分子质量、NaC l质量分数和(NH4)2SO4质量分数对分配系数K(CAL)的影响,结果表明:温度对K(CAL)影响不大;低相对分子质量PEG与蛋白质的疏水作用可促进CAL的分配;二相间电势差等对分配平衡、有较大影响。在PEG2 000/(NH4)2SO4双水相体系中,CAL最佳的萃取分离条件为:室温下,质量分数20%PEG2 000,12%(NH4)2SO4,1.5%NaC l,此时,K(CAL)为8.16,CAL回收率为91.2%。     

金属螯合双水相亲和分配技术分离纳豆激酶的研究

利用金属螯合亲和双水相分配技术对纳豆激酶的分离纯化进行了研究。考察了双水相系统、聚合物的分子量和浓度、亲和配基加入量、pH值、相比以及生物质加入量等因素对亲和分配的影响。结果表明,双聚合物系统比聚合物／无机盐系统更有利于纳豆激酶亲和分配;pH值和亲和配基加入量是影响分配的关键因素。优化的分配条件为：2．6％聚乙二醇,20．2％羟丙基淀粉,5％亲和配基PEG-IDA—Cu(Ⅱ),相比12,pH8．2,发酵液加入量15％。分配系统放大到100g,仍保持一致的酶活收率(90％)和纯化因子(2.0)。设计了两次分配分离流程,纯化因子达到3．52,总收率为81％。