植酸酶基因在海水小球藻细胞内的表达

为建立海水小球藻外源基因转化系统,使外源植酸酶基因在海水小球藻细胞内获得稳定表达,利用电激法将植酸酶基因与海水小球藻细胞共转化;利用含G418的抗性平板筛选抗性藻株,并对所获得的抗性藻株依次进行PCR检测、Southern杂交分析和植酸酶活性与性质的检测.经过转化处理的微藻细胞在含G418的抗性平板上培养3周后,每个平板有10~30个抗性藻株长出;在这些抗性藻株中,PCR检测的阳性率为40.16%;Southern杂交分析和植酸酶活性检测证明,植酸酶外源基因已经在小球藻细胞中获得正确表达.植酸酶外源基因在海水小球藻细胞内被成功表达.     

哈茨木霉Chiv基因的原核表达及优化

通过筛选哈茨木霉的DNA文库,克隆到Chiv基因的cDNA全长序列.以连接有哈茨木霉Chiv基因的质粒pBK902为模板,设计含有EcoRI和XhoI酶切位点引物,采用PCR方法扩增得到具有完整开放阅读框的目的基因;将目的基因连接到表达载体pET28上并转化大肠杆菌BL21菌株中,成功地获得了大量的阳性转化子.质粒通过EcoRI和XhoI酶切鉴定及测序鉴定,证明Chiv基因成功地转化到大肠杆菌中.重组大肠杆菌经IPTG诱导表达及SDS-PAGE检测后,发现特异的蛋白表达条带,其分子量为50 kDa左右.通过对诱导剂量与诱导时间等因素的优化,结果显示几丁质酶的最佳诱导时间为13 h,最佳诱导剂浓度为1 mM,为几丁质酶的工业化生产奠定基础.     

绿色荧光蛋白标记在MEOR中的应用研究

为了充分认识目的优势菌种经油藏运移后在产出水中分布的规律与数量,准确分析和客观评价MEOR现场试验效果,利用绿色荧光蛋白(GFP)基因标记目的菌,通过绿色荧光蛋白跟踪监测目的菌的动态信息。构建含有GFP基因的质粒pET-30a(+)-EGFP,并将其成功导入JD中。对构建的JD(gfp)工程菌进行培养发现,该工程菌在含有Kan质量浓度50μg/mL的培养条件下,重组质粒在JD(gfp)工程菌体内传代稳定,绿色荧光的表达稳定。但是在没有选择压力的培养条件下,重组质粒在JD工程菌胞体内有丢失现象。与野生菌混合培养,JD(gfp)工程菌具有很好的配伍性和竞争性,并且不发生重组质粒的水平转移,因此在环境中释放是安全的。     

核盘菌和草酸诱导下的油菜几种酶活力的变化分析

油菜菌核病是油菜生产中的重要病害之一,为了进一步探讨菌核病的致病机理和抗病机制,采用草酸浸叶和接种核盘菌菌丝两种方法分别处理甘蓝型油菜叶片,确定草酸最佳浓度为3 mmol/L,分析叶片中过多酚氧化酶(PPO)、氧化物酶(POD)、纤维素酶和几丁质酶的活力变化,发现草酸和核盘菌都可以诱导防御酶PPO和POD活力升高,可增...     

CDld基因稳定转染Panc-1细胞系的建立

实验采用PCR法获得CD1d基因片段,将其插入慢病毒pReceiver-Lv201载体（带GFP荧光）中获得EX-S0249-LV201重组质粒,经转染试剂EndoFectin-Lenti转染到293T细胞中获得慢病毒LP-S0249-LV201,用包装获得的慢病毒感染胰腺癌Panc-1细胞,在不同时间段用倒置荧光显微镜观察绿色荧光,并用反转录酶聚合酶链反应（RT-PCR）和Western blot方法验证获得的表达细胞株.实验结果显示经RT-PCR和Western blotting检测证实慢病毒LP-S0249-LV201 转染至Panc-1细胞株后,该细胞株表达CD1d基因和蛋白,成功建立了稳定表达CD1d基因的Panc-1细胞系,为进一步研究CD1d基因在胰腺癌免疫基因治疗中的作用奠定基础.     

一个野生质粒赋予的抗生素多抗性的遗传分析与鉴定

一株分离自椰子果面的、在LA培养基上产紫色水不溶性色素的野生细菌对安苄青霉素、卡那霉素、潮霉素表现出强烈的抗性。质粒与总DNA的比较分析表明该野生细菌极可能携带一个具有抗生素多抗性的质粒。差异表达显示该质粒能够为抗生素强烈地诱导表达。该质粒的RFLP分析证明这株野生细菌多抗药性确实来自质粒，且该多抗质粒有7个EcoRI酶切位点和5个HindⅢ酶切位点。该质粒电转化大肠杆菌(E．coli)JM109获得9株对安苄青霉素、卡那霉素、潮霉素皆有抗性的转化子，并从转化子中抽提到该抗性质粒，这就更进一步证明该野生细菌对抗生素的多抗性确实来自同一个质粒。     

哈茨木霉UBc基因的克隆及表达

筛选哈茨木霉的cDNA文库,克隆到泛素结合酶基因的cDNA全长序列,并对其进行生物信息学分析,该序列的长度为951 bp,包含一个455 bp的完整开放阅读框,编码157个氨基酸,其理论分子量为17.64ku.在氨基酸水平上,具有较高的保守性.以克隆载体pBK5313为模板,设计含有XhoI和BamH I酶切位点的引物,成功地获得包含完整阅读框的目的基因;将目的基因连接到表达载体pET28上,构建出含有泛素结合酶基因的重组子pET28-UBc,转化到大肠杆菌BL21(DE3)菌株中,成功地获得了大量的大肠杆菌转化子.通过对大肠杆菌转化子菌落PCR检验、质粒双酶切鉴定及测序分析,证实了成功转化.通过IPTG诱导,优化了泛素结合酶原核表达的条件,最佳诱导时间为4 h,诱导剂浓度对蛋白表达量影响不大.本研究为进一步研究哈茨木霉的生物防治作用机制,诠释蛋白质代谢途径提供基本技术支持.     

一株微生物采油菌的16S rDNA鉴定和绿色荧光蛋白分子标记

筛选到一株高效生产多糖的YX菌,油田先导试验证明该菌可以用于微生物调剖提高原油采收率（Microbial Enhanced Oil Recovery,MEOR）.经16SrDNA分析鉴定,YX菌属于肠内杆菌属（Enterobacter.）,为跟踪监测其动态信息,构建表达绿色荧光蛋白（green fluorescent protein,GFP）的重组质粒pET-30a（＋）-EGFP,利用CaCl2法将其转化至YX菌,利用荧光显微镜可以观察到重组YX（GFP）工程菌的绿色荧光.结果表明YX菌可以被绿色荧光蛋白基因标记,用于微生物采油研究.     

茂原链霉菌luxR基因对TGase生物合成的作用

前期研究表明,MgCl_2胁迫不但可以提高TGase的产量,还会影响微生物次级代谢产物合成的一个重要调节因子LuxR家族蛋白的表达.为了研究LuxR家族蛋白对茂原链霉菌(Streptomyces mobaraensis)TGase生物合成以及菌体生长的调控作用,利用pKC1139为载体,构建luxR基因阻断质粒,通过PEG介导的质粒转化将其转入S.mobaraensis原生质体中,利用单交换同源重组法将整个重组质粒插入到茂原链霉菌基因组中构建S.mobaraensis luxR家族蛋白基因阻断突变菌.利用菌体干重法对比突变菌和野生菌菌体生长变化,利用比色法研究两株菌TGase生物合成的变化,找到LuxR家族蛋白基因表达与TGase生物合成之间的关系.结果发现,本研究采用单交换同源重组的方法可以成功地构建出S.mobaraensis luxR基因阻断突变菌株.通过对比野生菌与阻断菌株生长和TGase活力的变化发现阻断luxR基因会导致菌体生长受阻,TGase合成延迟,并且表达量显著下降.这些研究结果表明本文研究的luxR基因可能是S.mobaraensis合成TGase必不可少的正向调控因子.     

过表达hom基因对谷氨酸棒杆菌发酵L-异亮氨酸的影响

谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium glutamicum）中hom基因编码的高丝氨酸脱水酶为L-异亮氨酸合成过程的关键酶,本研究通过在L-异亮氨酸生产菌cglutamicum YILW中过表达高丝氨酸脱水酶,考察过表达高丝氨酸脱水酶对发酵卜异亮氨酸产量的影响．以L-异亮氨酸生产菌cglutamicum YILW基因组为模板克隆horn基因,将horn基因与表达载体pXMJ19连接构建出重组质粒pXMJ19-hom,再转入Cglutamicum YILW构建C．glutamicum YILW（pXMJ19．hom）．通过5L罐发酵研究重组质粒对工程菌的生长、耗糖、L-异亮氨酸产量及副产物积累等方面的影响．结果显示,重组酶的表达使菌株对卜苏氨酸的抗反馈抑制作用得到加强．最终L-异亮氨酸和L-蛋氨酸积累量分别为36．5g／L和2．8g／L,分别较出发菌株提高7％和33％,同时L-赖氨酸合成量仅为2．1g／L,较出发菌株降低了63．8％．     

ZNF 219基因核定位信号序列的确定

ZNF2 19是新发现定位在人 14号染色体 q11带上的特异性锌指基因 .本实验对其核定位信号的识别说明其中有两组核定位序列存在 ,因此通过将ZNF2 19的核定位序列(NLS)与N -端增强绿色荧光蛋白载体 (pEGFP N1)构建成质粒 (pEGFP ZNF2 19NLS) ,然后瞬时转染到COS靶细胞 ,实验结果表明 :绿色荧光蛋白 (GFP)进入细胞核区     

过量表达苏氨酸脱水酶对谷氨酸棒杆菌合成L–异亮氨酸的影响

考察过量表达解除反馈抑制的苏氨酸脱水酶对谷氨酸棒杆菌发酵生产L-异亮氨酸的影响.将解除反馈抑制的苏氨酸脱水酶基因ilvA（F383V）连接大肠杆菌/谷氨酸棒杆菌穿梭质粒pXMJ19,过量表达于L-异亮氨酸生产菌株Corynebacterium glutamicum YILW.经5 L发酵罐分批补料发酵产酸实验,与出发菌株C.glutamicum YILW相比,耗糖高峰期滞后,L-异亮氨酸产量增加了10.3%,副产物L-蛋氨酸、L-赖氨酸含量分别降低了33.3%2、6.5%,发酵液中没有L-苏氨酸的累积,乳酸的累积量增加了41.7%.对发酵稳定期的代谢流分布研究表明,过量表达解除反馈抑制的苏氨酸脱水酶使HMP途径流量增加了31.7%,L-异亮氨酸生物合成途径的代谢流提高了8.5%.     

中国明对虾溶菌酶点突变基因的原核表达

为解决中国明对虾(Fenneropenaeus chinensis)溶菌酶成熟肽(FcLys)可溶性问题,构建了点突变基因的原核表达质粒,并进行重组表达。以已构建的带有FcLys目的基因的重组克隆质粒为模板扩增FcLys点突变(FcLysM)的基因片段,将该对虾溶菌酶成熟肽序列的N端和C端中含有几个疏水性氨基酸经点突变改为亲水性氨基酸,但不改变其活性中心和二硫键的形成。将FcLysM的基因片段与表达载体连接并转化,制得基因工程菌pET-39b(+)-FcLysM/Rosetta(DE3)。通过基因测序方法验证该重组表达质粒读码框的准确性以及FcLysM目的基因序列的正确性。该工程菌表达后在SDS-PAGE结果显示,表达产物为分子质量约为43ku的融合蛋白FcLysM。进一步研究分析证明,该重组点突变蛋白的可溶性表达量高于非突变的对虾溶菌酶表达量。     

拟南芥谷氨酸-tRNA合成酶(AtGluRS)不能取代酵母GluRS

将拟南芥细胞质谷氨酸-tRNA合成酶（AtGluRS）引入酵母细胞，研究其与酵母GluRS进行功能互补的可能性．无功能的酵母GluRS会导致酵母细胞死亡．将携带AtGluRS的pACT2-AtGluRS或pBridge（dNLS）-AtGluRS表达载体转化到含有能表达酵母谷氨酸．tRNA合成酶的pRS316-yGluRS载体的gluRS缺陷型酵母菌株中，若拟南芥GluRS能取代酵母中的该同源蛋白，酵母细胞中的载体pRS316-yGluRS在非选择性培养条件下将会很快丢失．然而，在经过3d的非选择性培养后，发现酵母细胞没有因拥有AtGluRS而失去提供GluRS功能的载体pRS316-yGluRS．可见，不同物种的GluRS之间，即使其具有很高的同源性，它们在演化过程中可能已形成了各自不同的特性，导致了拟南芥AtGluRS不能对酵母GluRS起功能互补作用．提示一些同源蛋白在异源生物体中不能发挥其正常功能．     

2-氯-N-苯基苯甲酰胺的合成及其抑菌活性研究

目的:合成2-氯-N-苯基苯甲酰胺,并测定其对水稻纹枯病菌(Rhizoctonia solani)和油菜菌核病菌(Scle-rotiua sclerotiorum)的抑菌活性。方法:以2-氯苯甲酰氯和苯胺为原料,采用酰卤的胺解法合成2-氯-N-苯基苯甲酰胺,并通过IR,1H NMR进行结构确认。以多菌灵为对照,采用平板生长速率法测定其对水稻纹枯病菌和油菜菌核病菌菌丝的抑制率。结果:2-氯-N-苯基苯甲酰胺对水稻纹枯病菌和油菜菌核病菌均有较好的抑菌活性,其抑制中浓度IC50分别为5.00,6.38 mg/L。结论:合成的2-氯-N-苯基苯甲酰胺为研究和开发高效、低毒、对非靶标生物安全的新型植物病原真菌农药奠定了较好基础。     

pPIC3．5K／Thanatin-（G8S2）-PPA毕赤酵母表达载体的构建和表达

将掌叶半夏凝集素和死亡素的融合基因thanatin-linker-ppa定向连接到pPIC3．5K,构建酵母表达载体pPIC3．5K／Thanatin-（G8S2）-PPA并进行序列分析,经SalI单酶切线性化后电转化到GSll5毕赤酵母感受态细胞中,PCR鉴定后在含有G418抗性的YPD平板筛选高拷贝重组子。利用甲醇在BMMY培养基中诱导表达融合蛋白,经SDS-PAGE和Westernbloting分析显示获得分子量约31kD的融合蛋白,融合蛋白经纯化后MTT分析其抗肿瘤活性,结果显示融合蛋白具有显著的抗肿瘤效果。     

盐生卤虫BADH基因的克隆及序列分析

实验以盐生动物卤虫（Artemia）为材料,采用酚-氯仿法提取总DNA,以已报道的BADH基因的保守序列设计引物,通过PCR技术,从卤虫的基因组DNA中分离得到了1个BADH基因片段,经测序,得到一段868 bp的核苷酸序列,输入Gen-Bank进行BLAST同源性比较,发现所得片段与植物中的籽粒苋的BADH4基因中的一段序列有96%的同源性,此项研究为更深入地研究抗盐动物的BADH基因奠定了良好的基础.     

嗜酸乳杆菌AS1.1854亚油酸异构酶基因的克隆与序列分析

将GenBank中已报道的罗伊氏乳杆菌亚油酸异构酶基因对已公布的嗜酸乳杆菌NCFM基因组全序列做tblast,找到一个同源编码框.参照此编码框的核苷酸序列及pQE30质粒图谱特性设计上、下游引物,利用PCR法扩增嗜酸乳杆菌AS1.1854亚油酸异构酶基因,并克隆到pQE30质粒载体上进行测序.分析测序结果表明,扩增得到的目的DNA全长1 776 bp,G C含量为37.5%,共编码591个氨基酸,理论相对分子质量67.5kDa.用Signal P3.0对其N端前70个氨基酸序列进行分析,结果表明,第20~40位氨基酸有较强的疏水性.不过,N端前70个氨基酸的C值、S值和Y值并不高,最有可能的酶切位点位于第45位与第46位氨基酸之间,但预测其被切割的可能性概率低于1%.可以推断,在嗜酸乳杆菌AS1.1854亚油酸异构酶的N端氨基酸序列中不存在信号肽序列.     

松材线虫纤维素酶基因的克隆及在大肠杆菌中的表达

采用PCR技术克隆了松材线虫纤维素酶的编码基因BXC46,克隆基因与已报道的纤维素酶基因BXC10（GenBank登录号：FJ598020.1）的同源性高达99%,将其克隆到表达载体pET-15b上构建了表达载体pET-15b-BXC。将该重组质粒转化大肠杆菌BL21（DE3）菌株构建工程菌,SDS-PAGE分析表明,IPTG诱导了纤维素酶在工程菌中表达。采用Ni2＋-NTA树脂亲和层析部分纯化了重组松材线虫纤维素酶,DNS法进行的活性测定表明,部分纯化的重组蛋白具有纤维素酶的活性,其最适温度为45℃,最适pH为4.0。     

Chondrogenesis of Precartilaginous Stem Cells in KLD-12 Self-assembling Peptide Nanofiber Scaffold Loading TGF-β3 Gene

The effect of culture in KLD-12 self-assembling peptide nanofiber scaffold containing TGF-β3 gene on differentiation of precartilaginous stem cells (PSCs) into chondrocytes was studied. KLD-12 was synthesized by solid-state method. After TGF-β3 plasmid was loaded into KLD-12 self-assembling peptide nanofiber scaffold, DNA release ability was investigated. PSCs and hTGF-β3 gene were loaded into KLD-12 3-D scaffold, and MTT assay was performed to investigate the cell proliferation, and ELASA assay was used to...