噬夏孢欧文氏菌GGPP合成酶与八氢番茄红素合成酶相互作用的研究

GGPP合成酶与八氢番茄红素合成酶是噬夏孢欧文氏菌类胡萝卜素合成代谢中的两个关键酶。本研究将编码GGPP合成酶与八氢番茄红素合成酶的基因crtE和crtB共转化大肠杆菌或将crtE、crtB及编码八氢番茄红素脱氢酶的crtI共转化大肠杆菌,IPTG诱导其表达,然后利用亲和层析、凝胶过滤层析纯化重组蛋白。Western blotting分析结合N-末端序列分析表明,GGPP合成酶与八氢番茄红素合成酶以两种复合体的形式存在,而八氢番茄红素脱氢酶则不能与这两种酶形成稳定的复合体。     

哈茨木霉UBc基因的克隆及表达

筛选哈茨木霉的cDNA文库,克隆到泛素结合酶基因的cDNA全长序列,并对其进行生物信息学分析,该序列的长度为951 bp,包含一个455 bp的完整开放阅读框,编码157个氨基酸,其理论分子量为17.64ku.在氨基酸水平上,具有较高的保守性.以克隆载体pBK5313为模板,设计含有XhoI和BamH I酶切位点的引物,成功地获得包含完整阅读框的目的基因;将目的基因连接到表达载体pET28上,构建出含有泛素结合酶基因的重组子pET28-UBc,转化到大肠杆菌BL21(DE3)菌株中,成功地获得了大量的大肠杆菌转化子.通过对大肠杆菌转化子菌落PCR检验、质粒双酶切鉴定及测序分析,证实了成功转化.通过IPTG诱导,优化了泛素结合酶原核表达的条件,最佳诱导时间为4 h,诱导剂浓度对蛋白表达量影响不大.本研究为进一步研究哈茨木霉的生物防治作用机制,诠释蛋白质代谢途径提供基本技术支持.     

哈茨木霉几丁质酶基因的cDNA克隆及表达

为了研究全新几丁质酶基因Chit37(DQ647957)的特性与功能,将该基因在大肠杆菌中进行了外源表达.通过构建哈茨木霉(Trichoderma harzianum)菌丝生长期的cDNA文库及对部分表达序列标签序列的测定与生物信息学分析,成功获得了基因Chit37的全长cDNA序列.该基因的编码框长度为1032bp,编码343个氨基酸,理论分子量为36.6kDa.采用PCR扩增的方法克隆该基因并将其构建到原核表达载体pET28(a+)上,构建了原核表达载体pET-Chit37并转化宿主菌BL21(DE3),菌落PCR及酶切鉴定均证实转化子的正确性,重组蛋白经IPTG诱导后获得表达.优化的表达条件为终浓度0.1mM IPTG诱导培养4h.     

哈茨木霉Cu-ZnSOD的克隆表达及活性鉴定

为研究哈茨木霉(Trichoderma harzianum)的生物防治机制并获得与生物防治相关基因,通过构建哈茨木霉菌丝生长期的cDNA文库及对部分表达序列标签序列的测定与生物信息学分析,成功获得了哈茨木霉超氧化物歧化酶(Cu-Zn SOD)基因的全长cDNA序列.该基因的编码框长度为465 bp,编码154个氨基酸,理论分子量为15.7 ku.将该基因构建到表达载体pET28上,转化到大肠杆菌BL21菌株中,通过诱导表达条件的优化后,经裂解菌体取上清进行酶活鉴定,确定在蛋白水平上得到了表达.蛋白质表达的最佳条件为:IPTG浓度为0.125 mmol/L,OD600为0.600,培养温度37℃,诱导时间为4 h.目的蛋白SOD的粗酶活为26.69 U/mL.该研究结果为进一步研究哈茨木霉的抗逆境胁迫分子生物学机制奠定基础.     

丹参SAMDC基因的电子克隆及序列分析

基于丹参EST数据库,以烟草S-腺苷甲硫氨酸脱羧酶基因(SAMDC)cDNA序列为信息探针,进行同源搜索,经同源比对和序列组装,分离得到1个新的植物SAMDC基因家族成员,命名为SmSAMDC,全长1620bp,经RT-PCR扩增,分子克隆和序列分析验证,结果表明与电子克隆完全一致。该cDNA序列具有完整的开放阅读框架,存在3个植物SAMDC基因特征ORF(tiny ORF、small ORF及main ORF);main ORF编码蛋白质理论分子量为39.4kD、pI为4.71,均与植物SAMDC酶原蛋白相近。二级结构预测发现,SmSAMDC基因main ORF编码序列中25.28%的氨基酸残基构成α螺旋、24.17%的氨基酸残基构成延伸链、50.56%的氨基酸残基构成随机卷曲。氨基酸序列比对分析结果表明,SmSAMDC与已知植物SAMDC基因家族成员高度同源,具有植物SAMDC基因家族的酶原剪切位点及SAMDC蛋白快速降解相关PEST保守结构域。     

家蚕新基因Bmbzj的表达、抗体制备及亚细胞定位

在自建的家蚕蛹cDNA文库中发现了一条新基因序列,GenBank登录号为DY231426.该基因是一个同源性很低的基因,未发现保守结构域,将其命名为Bmbzj.Bmbzj基因全长661bp,由99 bp的5'端非翻译区序列(5'UTR)、486 bp的开放读码框(ORF)和76 bp的3'端非翻译区序列(3'UTR)组成.生物信息学分析结果表明蛋白Bmbzj可能存在跨膜区和信号肽.将该基因插入到载体pGEX-4T-3中,构建了该基因编码的重组质粒pGEX-4T-3-Bmbzj,转化大肠杆菌Rosetta后,IPTG诱导表达了该融合蛋白,并利用亲和层析的方法纯化该重组蛋白,免疫新西兰兔制备多克隆抗体.亚细胞定位实验结果表明该蛋白只存在于细胞质中.     

HPV16 L1基因的PCR扩增、纯化和酶切鉴定

用重组DNA技术获取人乳头瘤病毒(HPV)16型晚期基因L1.以提取的宫颈癌细胞株Caski细胞总DNA为模板,设计一对L1基因特异引物,用PCR方法扩增HPV16 L1重组基因,用柱层析技术纯化和酶切初步鉴定HPV16 L1重组基因.该方法不仅可以扩增出HPV16 L1重组基因,用层析技术纯化HPV16 L1重组基因,还能通过酶切鉴定PCR产物HPV16 L1全长基因,为HPV感染的检测诊断和宫颈癌疫苗的制备奠定基础.     

HBV/HEV二价抗原的载体构建与表达

为构建一个能够表达出乙/戊型肝炎二价疫苗抗原的大肠杆菌高效重组原核表达载体,采用PCR方法扩增出HBV的S基因,及HEV的ORF2编码区的羧基末端中的414-606aa的基因片段,经过T载体连接、菌落PCR、双酶切、测序鉴定后,将这两部分重组入含有增强子的pT-T7高效的E.coli表达载体中。构建了pT-T7SE表达载体并且表达出相应的目的蛋白。该实验结果为研制预防乙型和戊型肝炎双价疫苗提供了实验技术基础。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF7基因的克隆、高效表达与鉴定

根据猪繁殖与呼吸综合症病毒(PRRSV)VR2332株ORF7的全长基因序列设计一对特异性引物,应用RT-PCR扩增出完整的ORF7基因,并将PCR产物克隆至pMD-18T载体进行测序分析.双酶切测序后重组质粒pMD-18T-N得到目的片段连接至原核表达载体pET-28a(+)上,构建重组质粒pET-28a(+)-N....     

嗜酸乳杆菌AS1.1854亚油酸异构酶基因的克隆与序列分析

将GenBank中已报道的罗伊氏乳杆菌亚油酸异构酶基因对已公布的嗜酸乳杆菌NCFM基因组全序列做tblast,找到一个同源编码框.参照此编码框的核苷酸序列及pQE30质粒图谱特性设计上、下游引物,利用PCR法扩增嗜酸乳杆菌AS1.1854亚油酸异构酶基因,并克隆到pQE30质粒载体上进行测序.分析测序结果表明,扩增得到的目的DNA全长1 776 bp,G C含量为37.5%,共编码591个氨基酸,理论相对分子质量67.5kDa.用Signal P3.0对其N端前70个氨基酸序列进行分析,结果表明,第20~40位氨基酸有较强的疏水性.不过,N端前70个氨基酸的C值、S值和Y值并不高,最有可能的酶切位点位于第45位与第46位氨基酸之间,但预测其被切割的可能性概率低于1%.可以推断,在嗜酸乳杆菌AS1.1854亚油酸异构酶的N端氨基酸序列中不存在信号肽序列.     

海刺参组织蛋白酶L基因的克隆、重组表达及活性鉴定

通过RT-PCR和RACE PCR技术,从海刺参(Stichopus japonicus)肠中克隆得到编码组织蛋白酶L(SjCL)基因,其中全长cDNA 1 287 bp,5′非编码区(UTR)202 bp,3′UTR 87 bp,开放阅读框(ORF)999 bp,编码332个氨基酸(aa),包括组织蛋白酶L成熟肽316 aa和信号肽16 aa,分子质量预测为35.3 ku。用SjCL序列与相似物种海胆、海葵等进行对比,可知SjCL具有组织蛋白酶L所特有的氨基酸保守区域ERFNIN和GNFD,以及由Cys 139,His 278和Asn 299残基组成的保守活性位点。将编码SjCL基因克隆进原核表达载体pET32a(+)中,构建重组质粒pET32a(+)-SjCL,转化至大肠杆菌BL21(DE3)pLysS感受态细胞,再进行诱导表达、亲和纯化和透析复性,得到了纯化且具有活性的重组SjCL。酶活力检测结果表明,重组SjCL对组织蛋白酶L特异性底物Z-Phe-Arg-Nmec具有较高活性,而对组织蛋白酶B特异性底物Z-Arg-Arg-Nmec无活性。本实验对SjCL的cDNA序列进行了生物信息学分析并通过基因工程的手段表达出具有活性的重组SjCL,为进一步研究组织蛋白酶L在海刺参自溶过程中的作用提供理论基础。     

ZNF 219基因核定位信号序列的确定

ZNF2 19是新发现定位在人 14号染色体 q11带上的特异性锌指基因 .本实验对其核定位信号的识别说明其中有两组核定位序列存在 ,因此通过将ZNF2 19的核定位序列(NLS)与N -端增强绿色荧光蛋白载体 (pEGFP N1)构建成质粒 (pEGFP ZNF2 19NLS) ,然后瞬时转染到COS靶细胞 ,实验结果表明 :绿色荧光蛋白 (GFP)进入细胞核区     

RNA结合蛋白RB47、RB60在叶绿体翻译调节中的作用

光调节的叶绿体mRNA的翻译需要mRNA5′,非翻译区(5′ UTR)相互作用的中间作用因子.叶绿体多聚腺苷酸结合蛋白(cPABP)RB47特异性地与PsbAmRNA的5′ UTR结合,并对于该mRNA的翻译是很重要的.定位于叶绿体中与cPABP伴随纯化出来的一种蛋白质二硫化物异钩酶RB60表现出调节cPABP与PsbAmRNA的5′ UTR结合的特性.这种调节是通过可逆地改变有氧化还原特征的cPABP的氧化还原状态来实现,或通过ADP依赖的磷酸化来实现.这种机制就在调节叶绿体的基因表达中提供了一个简单可逆的开关机制.     

HBV/HEV融合抗原大肠杆菌表达包涵体的变复性和纯化

利用乙型肝炎病毒adr型的S抗原基因和戊型肝炎病毒China-D型的ORF2编码区的羧基末端中的部分序列构建融合抗原表达载体,在大肠杆菌中表达时,出现了大量包涵体,我们对包涵体进行洗涤,变性,复性,金属亲和层析柱和凝胶过滤纯化后,蛋白的相对含量达98%.采用Western blot对目的蛋白活性进行检测,具有乙肝和戊型肝抗原活性.为提高资源利用效率,降低成本,提高产量,以及进一步研发疫菌用抗原提供了实验基础.     

E2弱化双酚A雌激素活性机制

前期研究发现天然雌激素E2可以弱化一种常见雌激素类污染物双酚A的活性,为探讨这一现象的机制,利用人体乳腺癌细胞MCF7,从细胞周期、雌激素受体途径、MAPKs信号途径进行实验．结果表明:E2可诱导DNA合成期细胞显著增高,抑制受体蛋白表达,提高ERK蛋白的表达,进而激活多种转录因子;双酚A显著抑制受体蛋白表达,对MAPKs信号通路基本没有影响,可同时提高DNA分裂期与间歇期细胞比例;两者联合后活化了受体途径和ERK途径,促进Cfos的转录表达,激活cyclin D1蛋白,增加S期及G2期细胞比例．E2弱化双酚A的可能机制为Cmyc蛋白表达下降．     

胞内分枝杆菌HSP 70基因的克隆、分析及原核表达

胞内分枝杆菌为致病性非结核分枝杆菌（NTM）之一,分布广泛,人畜均可感染,对人畜健康造成极大威胁。应用巢式PCR克隆胞内分枝杆菌HSP 70基因,利用在线分析软件对其进行生物信息学分析。构建原核表达载体p ET15b-HSP 70,同时进行诱导表达。结果显示,胞内分枝杆菌HSP 70基因完整,ORF基因全长1860bp,共编码619个氨基酸,HSP 70为酸性、亲水性蛋白质,不存在明显跨膜结构,含14个潜在磷酸化位点,亚细胞定位主要存在于细胞质中,无信号肽结构。二级结构预测,蛋白空间结构以α-螺旋和无规则卷曲为主。同时,以同源建模法预测了HSP 70基因编码蛋白的三维立体结构。成功构建p ET 15b-HSP 70原核表达载体,在原核表达系统中该载体可诱导表达70ku的HSP70重组蛋白。