去泛素化酶25在非洲爪蛙早期胚胎中的时空表达

去泛素化酶25(Ubiquitin-specific protease25,USP25)作为蛋白泛素化降解过程的负性调节因子,广泛参与病毒免疫、肿瘤发生、转移、蛋白修饰折叠等一系列的病理和生理过程,在小鼠胚胎中,该基因主要表达于增殖的神经上皮细胞和有丝分裂后的神经元,但是其在整个胚胎发育早期时空的细致表达尚未详尽刻画.作者克隆了模式动物非洲爪蛙(Xenopus laevis)去泛素化酶25,通过胚胎原位杂交和半定量RT-PCR方法研究了其在早期胚胎中的时空表达情况.USP25蛋白序列在进化上,从斑马鱼、鸡胚、爪蛙、小鼠到人具有高度的保守性,提示该蛋白在各物种间具有相似的功能.数据表明,USP25在非洲爪蛙中母源性表达于动物极区域,在整个早期胚胎发育过程中其mRNA表达量比较恒定,神经板时期(第14期)USP25主要在胚胎神经板外侧、前部基板和表皮表达;发育后期该基因主要表达于中枢神经系统、心脏、胰腺以及胃和十二指肠原基,提示该基因在这些器官和组织发育中发挥作用.     

Cldn4抑制胰腺癌的迁移

为了验证Cldn4(Claudin 4)蛋白在胰腺癌中扮演的角色是促进肿瘤的进展还是抑制肿瘤的进展,选用胰腺癌细胞PANC-1,分别对其Cldn4进行过表达和敲低,研究其对胰腺癌细胞迁移、增殖的影响.实验方法采用体外划痕实验及Transwell小室实验评估细胞的迁移能力,采用MTT比色法评估细胞增殖能力.结果表明:Cldn4可显著抑制PANC-1的迁移,但对其增殖能力无显著性影响,Cldn4在胰腺癌中扮演癌基因的角色.     

UbcH5B活性位点突变体对野生型E2传递泛素活性的影响

蛋白质泛素化需要泛素活化酶E1、泛素结合酶E2和泛素连接酶E3的依次作用,但泛素结合酶E2不仅在泛素传递中起中间者的作用,还可能决定泛素链的特异性以及调控泛素化过程.为了更加深入了解E2参与的泛素传递调控机制,通过将泛素结合酶UbcH5B催化活性位点Cys85突变成Ser,获得可以与Ub结合得到更加稳定复合物的突变体UbcH5B-C85S,探究突变体对野生型E2体外泛素传递的影响.首先构建野生型E2和UbcH5B-C85S的表达质粒,然后通过原核表达和使用Ni-NTA亲和柱层析纯化,获得有活性的人重组E2蛋白;设置体外泛素转移反应,通过Western blot等方法,分别在E2和E3水平分析UbcH5B-C85S对野生型E2泛素转移反应的作用.结果 显示:突变体UbcH5B-C85S可以部分抑制泛素从E1传递到UbcH5B和E2-25K,并且可以抑制UbcH5B将泛素传递到泛素连接酶TRIM23.这些结果有助于更深入了解泛素化的活性调控机制.     

哈茨木霉UBc基因的克隆及表达

筛选哈茨木霉的cDNA文库,克隆到泛素结合酶基因的cDNA全长序列,并对其进行生物信息学分析,该序列的长度为951 bp,包含一个455 bp的完整开放阅读框,编码157个氨基酸,其理论分子量为17.64ku.在氨基酸水平上,具有较高的保守性.以克隆载体pBK5313为模板,设计含有XhoI和BamH I酶切位点的引物,成功地获得包含完整阅读框的目的基因;将目的基因连接到表达载体pET28上,构建出含有泛素结合酶基因的重组子pET28-UBc,转化到大肠杆菌BL21(DE3)菌株中,成功地获得了大量的大肠杆菌转化子.通过对大肠杆菌转化子菌落PCR检验、质粒双酶切鉴定及测序分析,证实了成功转化.通过IPTG诱导,优化了泛素结合酶原核表达的条件,最佳诱导时间为4 h,诱导剂浓度对蛋白表达量影响不大.本研究为进一步研究哈茨木霉的生物防治作用机制,诠释蛋白质代谢途径提供基本技术支持.     

去泛素酶复合体Ubp3/Bre5的制备及与Cdc48作用（英文）

泛素化是一种存在于真核细胞中与生理功能密切相关的蛋白修饰,泛素化与去泛素化处于动态调节过程中.Ubp3是与人USP10同源的酵母去泛素化酶,结合辅引子Bre5在细胞内发挥广泛作用.为研究该复合体的工作机制,制备重组蛋白复合体,在大肠杆菌中成功表达并纯化重组Ubp3与Bre5单体及Ubp3/Bre5复合体,首次成功大规模制备重组Ubp3/Bre5复合体.通过一系列pulldown实验,检验Ubp3/Bre5与AAA家族中泛素选择性ATP酶Cdc48的相互作用模式,结果发现,Ubp3及Bre5无法单独与Cdc48结合,但Ubp3/Bre5复合体可以有效与Cdc48相互作用.提出了Ubp3/Bre5-Cdc48相互作用的新模式,制备了高质量重组Ubp3/Bre5复合体.该研究为通过生化及结构生物学进行分子机制探索奠定了基础.     

携带pri-mir-20a的慢病毒表达载体的构建

采用PCR扩增获得的pri-mir-20a,过渡质粒pcDNA3.0-H1经BamH Ⅰ与Hin dⅢ双酶切后将两者连接产生pcDNA3.0-H1-pri-mir-20a重组质粒,再将PCR获得的H1-pri-mir-20a克隆到慢病毒载体pdc-SEW上获得重组慢病毒载体pdcH1-pri-mir-20a-SEW.将pCMV 8.91、pMD2.VSV.G、pdcH1-pri-mir-20a-SEW三质粒共转染293FT细胞,结果显示48 h后绿色荧光蛋白的表达达到80%,表明已成功构建出携带pri-mir-20a的慢病毒表达载体.该载体的成功构建为深入开展对miR-20a的生物学功能和靶标验证提供了有效的工具.     

HPV16 E6基因原核表达质粒的构建

对构建HPV16 E6基因的原核表达质粒pET28a(+)-HPV16 E6进行研究.从宫颈癌细胞株CaSki细胞中提取的的DNA基因组为模板,设计一对特异性引物,用PCR法扩增出HPV16E6基因片段.HPV16E6基因片段和质粒pET28a(+)经NcoⅠ和HindⅢ双酶切后用T4 DNA连接酶连接.构建的重组质粒pET28a(+)-HPV16 E6转化大肠杆菌DH5α,经PCR鉴定和酶切鉴定筛选出阳性克隆,将阳性克隆的质粒转化到大肠杆菌BL21 Star-DE3 Plyss中,构建了HPV16 E6基因原核表达质粒pET28a(+)-HPV16E6.HPV16E6基因原核表达质粒pET28a(+)-HPV16 E6的构建为HPV16 E6重组蛋白的制备和为宫颈组织HPV16型感染的早期诊断和相关治疗性疫苗的研制奠定了物质基础.     

去泛素酶复合体Ubp3/Bre5的制备及与Cdc48作用

泛素化是一种存在于真核细胞中与生理功能密切相关的蛋白修饰,泛素化与去泛素化处于动态调节过程中。 Ubp3是与人USP10同源的酵母去泛素化酶,结合辅引子Bre5在细胞内发挥广泛作用。为研究该复合体的工作机制,制备重组蛋白复合体,在大肠杆菌中成功表达并纯化重组Ubp3与Bre5单体及Ubp3/Bre5复合体,首次成功大规模制备重组Ubp3/Bre5复合体。通过一系列pulldown实验,检验Ubp3/Bre5与AAA家族中泛素选择性ATP酶Cdc48的相互作用模式,结果发现, Ubp3及Bre5无法单独与Cdc48结合,但Ubp3/Bre5复合体可以有效与Cdc48相互作用。提出了Ubp3/Bre5-Cdc48相互作用的新模式,制备了高质量重组Ubp3/Bre5复合体。该研究为通过生化及结构生物学进行分子机制探索奠定了基础。     

泽泻水提物抗氧化能力及对SIRT1蛋白表达影响的研究

[目的]探索泽泻水提物抗氧化能力及其可能的作用机制.[方法]采用H_2O_2(700umol/L)诱导HEK293T细胞氧化损伤,建立HEK293T细胞氧化损伤模型.通过泽泻水提物预处理,使用MTT法测定细胞存活率.使用实时定量PCR和ELISA方法,测定泽泻水提物预处理的HEK293T细胞sirt1基因转录水平和SIRT1蛋白表达水平.[结果]与H_2O_2对照组相比,泽泻水提物能够提高HEK293T细胞存活率.实时定量PCR结果显示,泽泻水提物能够明显上调sirt1 mRNA水平.ELISA结果显示泽泻水提物能够提高SIRT1蛋白水平.[结论]泽泻水提物能够减轻H_2O_2诱导的HEK293T细胞氧化损伤并抑制其凋亡.泽泻水提物抗氧化能力可能与其促进SIRT1蛋白表达有关.     

人p75NTR荧光真核表达载体的构建及其在HEK293细胞中的表达

构建了人p75神经营养素受体（p75 neurotrophin receptor,p75NTR）cDNA序列的绿色荧光真核表达载体,并鉴定其在人胚肾293（human embryo kidney293,HEK293）细胞中的表达．采用PCR方法从含人p75NTR的pDC316-HP75质粒中扩增目的片段,经EcoRI和SalI双酶切,定向克隆于pEGFP-N1质粒中,构建绿色荧光真核表达载体pEGFP-N1-HP75,经酶切及测序鉴定后,通过脂质体转染HEK293细胞,激光共聚焦及Western blot法鉴定人p75NTR的表达．结果表明,酶切鉴定和序列分析证实重组质粒含有人p75NTR编码序列,转染实验表明,重组质粒能够在HEK293细胞中表达出具有活性的人p75NTR片段．     

携带oct4、klf4s、ox2、nanog4种转录因子的腺病毒载体的构建

构建并鉴定携带人oct4、klf4、sox2、nanog4个基因的腺病毒载体,重组出能同时表达这4种转录因子的腺病毒,为进一步诱导多能干细胞的研究提供新方法。使用口蹄疫病毒2A序列将人的oct4、klf4、sox2、nanog4个基因顺序连接,定向克隆至腺病毒载体pDC328上,并在nanog下游插入红色荧光蛋白dsRed2作为报告基因。利用酶切及PCR方法鉴定病毒载体的正确性;荧光显微镜下观察病毒感染HEK 293细胞24 h后红色荧光的表达,检测病毒功能;实时定量PCR检测细胞内4种基因的表达情况。结果表明,酶切后DNA电泳鉴定证实载体构建成功,重组后病毒PCR显示病毒携带oct4、klf4、sox2、nanog基因;荧光显微镜下观测到红色荧光的表达,实时定量PCR检测到细胞内4种基因的表达。本研究成功构建的腺病毒载体,能够介导以上4种转录因子在细胞内的同时表达,为进一步诱导多能干细胞的提供新方法。     

CD44、CD133和ABCG2潜在癌症生物标记蛋白质的表达

癌症生物标记物是一种新的早期癌症治疗工具,它既可用于癌细胞抑制,也可用于将其杀灭.癌干细胞已被证明是癌症的一个关键标志细胞.最近,随着单克隆抗体技术的发展生物标记物的研究发展迅速,一些重要的癌干细胞标记已被确认.单克隆抗体是癌标记物应用的重要技术,也是临床诊断和治疗重要手段.本研究的癌干细胞标记物CD44,CD133和ABCG2,分别通过Genestar等软件分析,并选定目标抗原特异性的基板的基因,设计出目标基因的模板和引物.经过免疫分析,设计出编码基因,利用PCR克隆技术,将其并插入预先选定的pGEX-4T-1或pET32a质粒上的克隆位点上.载有预定基因的标记物,通过载体转入感受态的E.coli BL21中,在加入IPTG的条件下,诱导其蛋白质的表达,得到目标蛋白质产物.利用SDS-PAGE和Westem Blot analysis,验证其表达的正确性.研究的目标蛋白质片段CD44、CD133和ABCG2,可以用于癌干细胞进一步的研究和其单克隆抗体的制作.

Abstract：

Cancer biomarkers can provide the chance to develop therapies for cancer during its the natural progression, to either inhibit or eliminate the disease. Cancer stem cells have been proved to be critical in the progression of cancer. Recently,some important cancer stem cells markers have been characterized. The rapid development of cancer biomarker research is attributed to a large extent to the advance of the monoclonal antibody technology. Monoclonal antibodies specific for cancer biomarkers have important clinical use in diagnosis and therapeutics. In the present studies, the cancer stem cell markers,CD44,CD133 and ABCG2 ,were first analyzed for their respective antigenic epitopes by Genestar. Then the gene encoding protein fragment with sound immunogenicity was cloned by PCR and inserted to the multiple cloning site of the pGEX-4T-1 or pET32a plasmid. The resulting expression vector was transformed into the E. coli BL21 strain and the protein expression was induced by the addition of IPTG. Finally,the target protein was characterized by the SDS-PAGE and Western Blot analysis. In further study,these CD44 ,CD133 and ABCG2 target protein fragments will be utilized to develop monoclonal antibodies, which can be used in cancer stem cell research.     

Chondrogenesis of Precartilaginous Stem Cells in KLD-12 Self-assembling Peptide Nanofiber Scaffold Loading TGF-β3 Gene

The effect of culture in KLD-12 self-assembling peptide nanofiber scaffold containing TGF-β3 gene on differentiation of precartilaginous stem cells (PSCs) into chondrocytes was studied. KLD-12 was synthesized by solid-state method. After TGF-β3 plasmid was loaded into KLD-12 self-assembling peptide nanofiber scaffold, DNA release ability was investigated. PSCs and hTGF-β3 gene were loaded into KLD-12 3-D scaffold, and MTT assay was performed to investigate the cell proliferation, and ELASA assay was used to...     

CDld基因稳定转染Panc-1细胞系的建立

实验采用PCR法获得CD1d基因片段,将其插入慢病毒pReceiver-Lv201载体（带GFP荧光）中获得EX-S0249-LV201重组质粒,经转染试剂EndoFectin-Lenti转染到293T细胞中获得慢病毒LP-S0249-LV201,用包装获得的慢病毒感染胰腺癌Panc-1细胞,在不同时间段用倒置荧光显微镜观察绿色荧光,并用反转录酶聚合酶链反应（RT-PCR）和Western blot方法验证获得的表达细胞株.实验结果显示经RT-PCR和Western blotting检测证实慢病毒LP-S0249-LV201 转染至Panc-1细胞株后,该细胞株表达CD1d基因和蛋白,成功建立了稳定表达CD1d基因的Panc-1细胞系,为进一步研究CD1d基因在胰腺癌免疫基因治疗中的作用奠定基础.     

球孢白僵菌几丁质酶基因chit1真核表达

采用PCR方法从球孢白僵菌的DNA中克隆出几丁质酶基因chit1,并将该序列构建到酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)诱导型表达载体pYES2上,转化到酿酒酵母H158菌株中,通过Northern检验确定该基因在酿酒酵母中成功表达.经过酶活检测该转化子在培养48 h达到酶活高峰,达0.47 U/mL.     

人源血管紧张素转化酶-N结构域基因片段在毕赤酵母中的表达

利用RT-PCR方法从食管癌细胞TE-1中反转出cDNA,PCR扩增得到血管紧张素转化酶N结构域(ACE-N)基因片段,构建pPIC9K-ACE-N表达载体,转化毕赤酵母GSll5,阳性克隆再次电转,并从转化菌株中筛选出多拷贝转化子进行表达.经Ni2+亲和层析柱对表达的蛋白进行纯化,获得的目的蛋白表达量为0.11 g/L,其纯度大于99％.为今后选择性抑制血管紧张素转化酶两个同源结构域的体外研究奠定基础.     

猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF7基因的克隆、高效表达与鉴定

根据猪繁殖与呼吸综合症病毒(PRRSV)VR2332株ORF7的全长基因序列设计一对特异性引物,应用RT-PCR扩增出完整的ORF7基因,并将PCR产物克隆至pMD-18T载体进行测序分析.双酶切测序后重组质粒pMD-18T-N得到目的片段连接至原核表达载体pET-28a(+)上,构建重组质粒pET-28a(+)-N....     

乙酰肝素酶-1/多配体蛋白聚糖-1轴对肝癌细胞侵袭能力的影响

乙酰肝素酶-1(Heparanase-1,HPA-1)/多配体蛋白聚糖-1(Syndecan-1,SDC-1)轴调控多种肿瘤细胞的转移。肿瘤细胞侵袭能力的改变是导致肿瘤脱离原发组织,进而向远隔器官转移的关键启动因素。为了检测Heparanase-1/Syndecan-1轴在肝癌细胞中是否存在及其对肝癌细胞侵袭能力的影响,我们利用SDC-1小干扰RNA及重组HPA-1(rHPA-1)分别处理肝癌细胞Hepa1-6,再通过反转录PCR(RT-PCR)、Western-blot及免疫细胞化学检测SDC-1表达,应用体外基质胶侵袭实验观察细胞侵袭能力的改变。结果显示:SDC-1小干扰RNA明显抑制SDC-1表达;r HPA-1处理显著下调SDC-1蛋白的分子量,但没有改变SDC-1的mRNA表达;SDC-1表达下调及rHPA-1处理均促进Hepa1-6细胞的侵袭。因此得出结论:HPA-1通过作用于SDC-1蛋白,即形成Heparanase-1/Syndecan-1轴启动肝癌细胞转移。