中国对虾组织细胞中酚氧化酶活力的研究

运用酶细胞化学技术，显示中国对虾（Fenneropenaeus chinensis）淋巴器、皮肤、鳃、肝胰腺、中肠育囊和中肠这几种组织细胞中的酚氧化酶活性，在透射电镜下观察各组织中细胞内酚氧化酶的活性部位；观察在受病毒感染的细胞内酚氧化酶对病毒的作用。结果表明，在健康对虾的组织细胞中，基本不表现酚氧化酶活性，而在受病毒感染的对虾中，不同的组织表现不同程度的酚氧化酶活性。其中，尤以淋巴器和皮肤的细胞中酚氧化酶活性最强，在淋巴器和皮肤这两个组织的细胞中，都可看到酚氧化酶对病毒结构的破坏作用。中国对虾淋巴器具有对血淋巴中有害异物进行过滤的作用，酚氧化酶在这一过程中发挥了重要作用。     

牙Ping淋巴囊肿病的PCR诊断方法研究

以中国养殖牙Ping(Paraclichthys olivaceus)淋巴囊肿病毒（Lymphocystis disease virus,LCDV_cn)主要衣壳蛋白（major capsid protein,MCP)基因的中间保守序列为目标基因，设计了一对特异性引物。该引物可扩增出172bp的病毒DNA片段，其最小DNA检出量为0.0183ng。用PCR法从人工感染淋巴囊肿病毒3天的牙Ping血，鳃，肝，脾，肠，胃及自然发病牙Ping的肿瘤中，分别检测到了LCDV的存在。本实验结果证明，PCR法对于早期检测LCDV是十分有效的。     

淋巴囊肿病病毒主要衣壳蛋白基因片段原核载体的构建及表达

淋巴囊肿病病毒感染牙鲆鳃细胞系FG-9307，提取细胞总RNA，采用RT-PCR法成功获得了淋巴囊肿病病毒主要衣壳蛋白0．6kb基因片段。构建其原核表达载体，IPTG诱导表达。结果表明，该融合蛋白分子量约48kD，可与抗LCDV多克隆血清特异反应。为LCDV基因工程疫苗的研制奠定了实验基础。     

牙鲆淋巴囊肿病的PCR诊断方法研究

以中国养殖牙鲆 (Paralichthysolivaceus)淋巴囊肿病毒 (Lymphocystisdiseasevirus,LCDVcn)主要衣壳蛋白 (majorcapsidprotein ,MCP)基因的中间保守序列为目标基因 ,设计了一对特异性引物。该引物可扩增出 172bp的病毒DNA片段 ,其最小DNA检出量为 0 0 183ng。用PCR法从人工感染淋巴囊肿病毒 3天的牙鲆血、鳃、肝、脾、肠、胃及自然发病牙鲆的肿瘤中 ,分别检测到了LCDV的存在。本实验结果证明 ,PCR法对于早期检测LCDV是十分有效的。     

应用间接ELISA技术快速检测花鲈病原菌-鳗弧菌

以花鲈（Lateolabrax japonicus)弧菌病的病原菌－鳗弧菌（Vibrio auguillarum)W-1为抗原,制备兔抗血清;利用辣根过氧化酶标记的羊抗兔血清（HRP－IgG)为酶标二抗,建立了检测鳗弧菌的间接ELISA快速检测法。结果表明,应用间接ELISA技术检测鳗弧菌有较高的灵敏度,最低的检测量为10^5个／ml,即10^4个／孔。同时交叉反应表明其具有较高的特异性。对46份人工感染后的花鲈组织样品,包括肌肉、鳃、肠、肝、肾等组织的检测表明,阳性检测率为76．1％。     

栉孔扇贝酸性α-醋酸萘酯酶的组织化学研究

采用酶组织化学方法对栉孔扇贝(Chlamys farreri)各主要器官组织中的酸性α-醋酸萘酯酶(ANAE)进行了定性定位研究。结果表明，栉孔扇贝的大部分器官，包括：外套膜、鳃、唇瓣、口唇、胃、肠、直肠、肝脏、肾脏、生殖腺、心脏和闭壳肌，其上皮组织和大血窦多呈很强的ANAE阳性( )；血细胞呈ANAE强阳性( )；结缔组织和肌纤维呈ANAE较强阳性( )或弱阳性( )；肝脏肝小叶呈较强的ANAE阳性；肾脏肾小管呈ANAE强阳性。生殖腺滤泡呈很强的ANAE阳性。     

牙鲆淋巴囊肿病毒主要衣壳蛋白基因片段真核表达载体的构建、表达与免疫效果评价

用淋巴囊肿病毒LCDV-cn感染牙鲆鳃细胞系FG-9307,提取细胞总RNA,用RTPCR法获得了LCDV-cn主要衣壳蛋白(MCP)0.6kb基因片段.将该LCDV-cn-MCP0.6kb片断克隆入真核表达载体pEGFP-N2,得到重组质粒pEGFP-N2-LCDV-cn-MCP 0.6.采用脂质体法将重组质粒转染入牙鲆鳃细胞系FEC,并进行瞬时表达.通过荧光显微镜观察和特异性RT-PCR检测,证实重组质粒pEGFP-N2-LCDV-cn-MCP 0.6kb已成功转染到FEC细胞,并得到了初步表达.将重组质粒肌注入牙鲆体内,检测牙鲆外周血、肠、脾脏、前肾和淋巴细胞的增殖反应、呼吸爆发活性及抗体产生水平.结果表明,构建的核酸疫苗pEGFP-N2-LCDV-cn-MCP 0.6可诱导牙鲆特异性体液免疫和细胞免疫,具有明显的免疫保护作用.     

斜带石斑鱼(Epinephelus coioides)MHC Ⅱα基因的克隆及表达分析

利用RACE PCR克隆了斜带石斑鱼(Epinephelus coioides)主要组织相容性复合体Ⅱα(MHCⅡα)基因,并通过荧光定量PCR分析了该基因在健康鱼体中的组织分布以及在溶藻弧菌(Vibro alginolyticus)感染后在不同组织中的表达变化。斜带石斑鱼MHCⅡαcDNA全长为2127bp,其中5'非翻译区为834bp,开放阅读框为714bp,3'非翻译区为579bp,编码237个氨基酸,其推导的氨基酸序列包含信号肽、α1及α2功能区、跨膜区、连接肽和胞浆区。荧光定量PCR结果表明,斜带石斑鱼MHCⅡα基因在鳃、头肾、肝、体肾、脑、脾和肠中表达量较高,在心脏、皮肤和肌肉中的表达量较低,并且溶藻弧菌(Vibro alginolyticus)感染后在脾、肠、头肾、和体肾中的表达显著上调,分别为对照组的9.5倍、4.3倍、3.4倍及1.9倍。上述结果表明斜带石斑鱼MHCⅡα在抗溶藻弧菌感染的免疫反应中可能发挥重要作用,这对进一步了解石斑鱼抗菌免疫反应具有参考意义。     

金鱼(Carassius auratus)腺垂体激素细胞中的球形病毒及其细胞病理学研究

利用电镜技术，在金鱼腺垂体促性腺激素细胞、促甲状腺激素细胞和促生长激素细胞中发现了一种球形病毒及其发生基质。该病毒在细胞核中形成不规则形态的包涵体，病毒粒子直径为80～100nm，呈中等电子密度，无囊膜。病毒侵染造成了促性腺激素细胞、促甲状腺激素细胞和促生长激素细胞的核膜溶解，染色质变性解体，内质网膨胀以及线粒体内嵴与外膜的溶解。此外，病毒的增殖导致了腺垂体中大量促性腺激素细胞、促甲状腺激素细胞和促生长激素细胞的凋亡。     

无毒藏红花组培芽的获取及其病毒检测

为解决病毒感染藏红花问题和获得无毒种质资源,在球茎诱导愈伤组织以及愈伤组织再分化成苗的过程中进行了脱毒处理,并首次采用间接ELISA和RT-PCR方法检测了国内外报道的侵染藏红花的芜菁花叶病毒(TuMV)、鸢尾花叶病毒(IMV)、菜豆黄花叶病毒(ByMV)、黄瓜花叶病毒(CMV)和烟草脆裂病毒(TRV).结果表明:在藏红花愈伤组织和再分化芽中没发现国内外报道的侵染藏红花的病毒TuMV、 TRV、 CMV 和potyvirus,获得了无毒藏红花种质资源.     

栉孔扇贝急性病毒性坏死症病毒感染的ELISA检测

应用纯化病毒免疫新西兰兔制备的抗血清，进行ELISA分析，检测栉孔扇贝体内急性病毒性坏死症病毒的感染情况。结果表明：一龄贝在整个养殖期间感染该病毒呈现低一高一低的涨落过程，其中7月下旬到8月中旬检出阳性率为75％～95％，为当年感染的高峰时期。对二龄贝感染该病毒的分析结果显示，二龄贝对病毒的感染可能具有一定的抗性。     

栉孔扇贝的急性病毒性坏死症(AVND)病毒多克隆抗体的制备及ELISA分析

以青岛太平角养殖海区患病栉孔扇贝组织中提纯的急性病毒性坏死症病毒作为抗原，制备出效价较高的多克隆抗体。用酶联免疫吸附分析(ELISA)方法对青岛黄岛等不同养殖海区、不同时间采集的栉孔扇贝材料进行检测，结果表明，7、8月份样品检测结果呈强阳性，检出阳性率为75％～95％，其他时期阳性率较低。     

病毒感染对细胞表面超微结构影响的研究

用原子力显微镜（AFM）技术观察汉坦病毒的基本形貌,分别对用戊二醛固定的Vero—E6细胞和用汉坦病毒感染过的Vero—E6细胞进行成像,在原子级或纳米级水平上观测病毒感染后细胞表面超微结构的变化。将病毒直接滴加到云母片上自然风干后进行扫描,可以清晰地观察到病毒的结构大小;用0．5％～2．0％浓度的戊二醛固定细胞,通过成像发现,固定液浓度高时虽然成像质量较好,但对细胞的损伤较大,降低固定液浓度,细胞的形态接近于生理状态,成像质量良好;用不同稀释度的病毒感染细胞后,用合适的戊二醛浓度固定细胞进行观察,发现病毒感染前后细胞的形态结构发生了较大的变化,并且发现其形态的变化与病毒感染的浓度有显著的相关性。     

HIV-1核心蛋白Gag与IL-6共表达重组鸡痘病毒的构建及其免疫原性研究

分别将IL-6和HIV-1gag基因插入到鸡痘病毒表达载体质粒pUTAL串联启动子和复合启动子(ATI-P7．5)下游，构建了重组鸡痘病毒表达质粒pUTA-GAG-IL6。经同源重组和Western blot检测，获得重组鸡痘病毒，并将该重组病毒免疫BALB／c小鼠，检测免疫小鼠血清抗体水平和特异性CTL杀伤活性。结果获得的重组鸡痘病毒可同时表达HIV-1核心蛋白和IL-6，并在感染细胞内形成病毒样粒子。重组病毒具有良好的免疫原性，可诱导小鼠产生特异性体液免疫和细胞免疫。     

Exploring Sialic Acid Receptors‐Related Infection Behavior of Avian Influenza Virus in Human Bronchial Epithelial Cells by Single‐Particle Tracking

Human respiratory tract epithelial cells are the portals of human infection with influenza viruses. However, the infection pathway of individual avian influenza viruses in human respiratory cells remains poorly reported so far. The single‐particle tracking technique (SPT) is a powerful tool for studying the transport mechanism of biomolecules in live cells. In this work, we use quantum dots to label avian influenza H9N2 virus and elaborate on the infection mechanism of the virus in human bronchial epithelial (HBE) cells using a three‐dimensional SPT technique. We have found that the H9N2 virus can infect HBE cells directly and the virus infection follows an actin filament‐ and microtubule‐dependent process with a three‐stage pattern. The transport behaviors show a high degree of consistency between the sialic acid receptors and the influenza virus. Real‐time SPT provides dynamic evidence of the sialic acid receptors‐related infection behavior of the avian influenza virus in live cells. The study of the influence of sialic acid receptors on virus infection may contribute to a better understanding of the cross‐species transmission of the avian influenza virus.     

Uncovering the Rab5‐Independent Autophagic Trafficking of Influenza A Virus by Quantum‐Dot‐Based Single‐Virus Tracking

Autophagy is closely related to virus‐induced disease and a comprehensive understanding of the autophagy‐associated infection process of virus will be significant for developing more effective antiviral strategies. However, many critical issues and the underlying mechanism of autophagy in virus entry still need further investigation. Here, this study unveils the involvement of autophagy in influenza A virus entry. The quantum‐dot‐based single‐virus tracking technique assists in real‐time, prolonged, and multicolor visualization of the transport process of individual viruses and provides unambiguous dissection of the autophagic trafficking of viruses. These results reveal that roughly one‐fifth of viruses are ferried into cells for infection by autophagic machineries, while the remaining are not. A comprehensive overview of the endocytic‐ and autophagic‐trafficking process indicates two distinct trafficking pathway of viruses, either dependent on Rab5‐positive endosomes or autophagosomes, with striking similarities. Expressing dominant‐negative mutant of Rab5 suggests that the autophagic trafficking of viruses is independent on Rab5. The present study provides dynamic, precise, and mechanistic insights into the involvement of autophagy in virus entry, which contributes to a better understanding of the relationship between autophagy and virus entry. The quantum‐dot‐based single‐virus tracking is proven to hold promise for autophagy‐related fundamental research.     

牙鲆淋巴囊肿病毒的病原性与免疫原性

用病牙鲆体表肿瘤纯化的病毒,对健康牙鲆进行人工感染实验,感染60天后,供试牙鲆再现了自然发病鱼的症状,对结果证明,从病鱼囊肿物中纯化的病毒,确系引发淋巴囊肿病的病原,免疫学实验显示,淋巴囊肿病毒使被感染鱼产生了抗体IgM,在实验期间内,IgM随着时间的延长而增加。