小鼠对HIV-2嵌合结构基因重组鸡痘病毒的免疫反应

将HIV-2嵌合结构基因gag-gp105插入到转移载体pUTA2复合启动子ATI-P7.5×20下游,构建出鸡痘病毒重组转移质粒pA-gg;经转染和BrdU加压筛选,以基因组PCR和Western blot法鉴定重组病毒;将获得的重组病毒大量制备并纯化后,肌肉注射免疫BALB/c小鼠,ELISA法检测小鼠血清HIV-2抗体,流式细胞仪测定CD4 、CD8 T淋巴细胞亚类数量,乳酸脱氢酶(LDH)释放法检测脾特异性CTL杀伤活性.结果表明,成功筛选出一株可稳定表达HIV-2嵌合蛋白Gag-gp105的重组鸡痘病毒rFPV-gg;该重组病毒免疫组小鼠的血清出现HIV-2抗体,脾T细胞亚类数量增加,并产生针对HIV-2靶细胞的特异性CTL杀伤活性.本研究提示,HIV-2 gag-gp105重组病毒能诱导小鼠产生特异性细胞和体液免疫应答.     

共表达FMDV P1-2A和3C重组鸡痘病毒疫苗与核酸疫苗的实验免疫研究

将口蹄疫病毒(FMDV)衣壳蛋白前体P1-2A基因和蛋白酶3C基因分别插入到鸡痘病毒表达载体质粒pUTA-16Lac Z的复合启动子和单一启动子的下游,构建共表达重组鸡痘病毒转移载体质粒pUTAL3CP1,与282E4株FPV共转染鸡胚成纤维细胞,经RT-PCR、IFA及Western blotting检测,成功获得能正确表达目的蛋白的重组鸡痘病毒株vU-TAL3CP1。并与FMDV重组核酸疫苗免疫小鼠实验表明,各实验免疫组均能诱导小鼠产生特异性的细胞免疫和体液免疫反应,其中以重组鸡痘病毒与核酸疫苗联合免疫效果好于其它实验各组。     

人工设计的HIV-1重组鸡痘病毒诱导恒河猴产生免疫应答的研究

将人工设计的HIV-1多表位-p24嵌合基因重组鸡痘病毒rFPV-MEGp24大量制备并纯化后,分别在0周、8周、18周肌肉注射至实验恒河猴中,在第2次免疫后2周和第3次免疫后2周采集血液,分离血清和外周血淋巴细胞(PBMC),ELISA法检测血清HIV-1抗体和PBMC培养上清Th1类细胞因子的含量,MTT法测定PBMC的增殖能力,乳酸脱氢酶(LDH)释放法检测PBMC特异性CTL杀伤活性.结果表明:HIV-1多表位-p24嵌合基因重组鸡痘病毒可刺激恒河猴产生HIV-1特异性抗体;免疫猴的PBMC在HIV-1抗原肽刺激下细胞增殖能力加强,针对HIV-1靶细胞的特异性CTL杀伤活性产生,分泌Th1类细胞因子IFN-γ、IL-2的水平升高.研究提示,HIV-1多表位-p24嵌合基因重组鸡痘病毒能诱导恒河猴产生特异性细胞和体液免疫应答.     

共表达H5、H7亚型AIV HA基因与鸡IL-18基因的重组鸡痘病毒构建

以鸡痘病毒(FPV)疫苗株为载体,将H5和H7亚型禽流感病毒血凝素(AIV HA)基因串联后(拥有同一个阅读框)和鸡白细胞介素-18(IL-18)基因分别插入到鸡痘病毒表达载体pUTA-16-LacZ复合启动子(ATI-P7.5×20)和单一启动子1(P7.5)下游,构建了携带AIV HA基因和鸡白细胞介素-18基因的重组鸡痘病毒转移载体质粒pUTAL-H5-H7-IL18;用相同的方法构建重组鸡痘病毒转移载体质粒pUTAL-H5-IL18;将H5亚型AIV HA基因插入到鸡痘病毒表达载体pUTA2复合启动子(ATI-P7.5×20)下游,构建了携带H5亚型AIV HA基因的重组鸡痘病毒转移载体质粒pUTA2-H5.应用脂质体转染法,将重组鸡痘病毒转移载体质粒与282E4株鸡痘病毒共转染鸡胚成纤维细胞(CEF),经BrdU进行三次加压蚀斑筛选后,以不同代次的细胞mRNA为模板,利用H5亚型AIV HA基因、H7亚型AIV HA基因和鸡IL-18基因特异引物进行RT-PCR和蛋白印迹检测,筛选出H5HA-H7HA融合蛋白基因和鸡IL-18基因共表达的重组鸡痘病毒rFPV-H5HA-H7HA-IL18,H5亚型AIV HA基因和鸡IL-18基因共表达的重组鸡痘病毒rFPV-H5HA-IL18以及单独表达H5亚型AIV HA基因的重组鸡痘病毒rFPV-H5HA.这些重组鸡痘病毒的构建为AIV活载体疫苗的研制奠定了基础.     

口蹄疫三价重组鸡痘病毒疫苗分子设计及其构建

针对我国口蹄疫(FMD)流行情况,利用计算机软件模拟分析,构建了口蹄疫病毒(FMDV)复合多表位基因工程疫苗表达盒OAAT.该表达盒以O型、A型FMDV结构蛋白VP1全基因和AsiaI型FMDV 2个基因拓扑型的结构蛋白VP1基因上的5个抗原表位基因(其中2个抗原表位来源于FMDVIND63/7株,该毒株与我国新疆分离株属于同一基因拓扑型,其余3个抗原表位来源于FMDVYNBS/58株)作为主要免疫原基因,以非结构蛋白上的2个Th2细胞表位基因及结构蛋白上的1个Th2细胞表位基因作为辅助基因.将构建好的表达盒OAAT和猪IL-18基因分别插入到鸡痘病毒(FPV)表达载体pUTA-16-LacZ复合启动子(ATI-P7.5×20)和单一启动子(P7.5)下游,构建了携带OAAT表达金和猪IL-18基因的重组鸡痘病毒转移载体质粒pUTAL-OAAT-IL18.应用脂质体转染法,将重组鸡痘病毒转移载体质粒与282E4株FPV共转染鸡胚成纤维细胞(CEF),经BrdU进行3次加压蚀斑筛选后,以不同代次的细胞mRNA为模板,利用FMDV VP1基因和猪IL-18基因特异引物进行RT-PCR和IFA检测,筛选出OAAT和猪IL-18基因共表达的重组鸡痘病毒rF-PV-OAAT-IL18,该重组鸡痘病毒的构建为新型FMDV活载体疫苗的研究奠定了基础.     

联合应用凋亡素基因、新城疫病毒HN基因及IL-18基因对黑色素瘤的抑制效应研究

以前的研究结果表明,来自于鸡贫血病毒的凋亡素基因、来自于鸡新城疫病毒的HN基因和IL-18基因具有不同的抗肿瘤效应,但上述基因抗肿瘤的机制不同,本研究在双启动子真核表达质粒pIRES中的CMV启动子下游插入凋亡素基因,IRES启动子下游插入IL-18HN嵌合基因,构建能同时表达三种基因的真核表达质粒pIRVP3IL-18HN。复制C57BL／6小鼠荷黑色素瘤模型,并将质脂体包裹的重组质粒进行瘤内注射,共注射3次,每次100μg质粒,拟观察凋亡素、新城疫病毒HN基因和IL-18基因以核酸疫苗的形式联合应用对小鼠黑色素瘤的抑制效应。结果显示pVIL-18HN、pVlL-18和pVVP3IL-18均有抑制肿瘤作用,但pIRVP3IL-18HN组抑瘤率高于pVIL-18HN组、pVIL-18VP3组、pVIL-18组和Hanks液对照组。研究结果提示,上述3种基因联合应用具有协同抑瘤效应。     

HIV-1中国流行株gp120基因在痘苗病毒中的表达及其与核酸疫苗的实验免疫研究

将HIV－1中国流行株gp120基因在痘苗病毒中进行表达,以期获得重组痘苗病毒,与核酸疫苗混合免疫,评价免疫效果,为艾滋病疫苗开发研制打下基础。将HIV－1中国流行株gp120基因片段插入到pJ38载体启动子下游,经同源重组和血凝素阴性空斑筛选重组痘苗病毒,SDS－PAGE、Western blot检测目的蛋白。以重组病毒和核酸疫苗免疫BALB／c小鼠,进行淋巴细胞转化实验、CTL、CD4＋CD8＋T细胞数目以及血清抗体等细胞免疫和体液免疫指标检测。结果获得的重组痘苗病毒vJ38pg120能够表达Gp120蛋白并诱导机体产生细胞免疫和体液免疫,具有良好的免疫原性,其免疫效果以2rVV-DNA混合方式为最好。重组痘苗病毒vJ38gp120。     

共表达VP3与hIL-18基因真核重组质粒的构建及对人结肠癌细胞的影响

先将鸡贫血病毒VP3基因插入真核表达载体pVAXl的多克隆位点，再将pVAX1载体上的IRES启动子及新霉素基因一同切下插入pVAXl的VP3基因下游，然后切下新霉素基因，将pIRES1基因插入其中，构建成pVVP3IL-18，将pVVP3IL-18转染Heda细胞。间接免疫荧光表明，在细胞膜和细胞浆观察到了特异的黄绿色荧光，证明表达了hIL-18。pVVP3IL-18转染人结肠癌细胞HCY-116后，经AO／EB染色及电镜观察，可见大量细胞凋亡。说明真核重组质粒pVVP3IL-18可在HeLa细胞中表达，并可在体外诱导人结肠癌细胞HCT-116凋亡。     

牙鲆淋巴囊肿病毒主要衣壳蛋白基因片段真核表达载体的构建、表达与免疫效果评价

用淋巴囊肿病毒LCDV-cn感染牙鲆鳃细胞系FG-9307,提取细胞总RNA,用RTPCR法获得了LCDV-cn主要衣壳蛋白(MCP)0.6kb基因片段.将该LCDV-cn-MCP0.6kb片断克隆入真核表达载体pEGFP-N2,得到重组质粒pEGFP-N2-LCDV-cn-MCP 0.6.采用脂质体法将重组质粒转染入牙鲆鳃细胞系FEC,并进行瞬时表达.通过荧光显微镜观察和特异性RT-PCR检测,证实重组质粒pEGFP-N2-LCDV-cn-MCP 0.6kb已成功转染到FEC细胞,并得到了初步表达.将重组质粒肌注入牙鲆体内,检测牙鲆外周血、肠、脾脏、前肾和淋巴细胞的增殖反应、呼吸爆发活性及抗体产生水平.结果表明,构建的核酸疫苗pEGFP-N2-LCDV-cn-MCP 0.6可诱导牙鲆特异性体液免疫和细胞免疫,具有明显的免疫保护作用.     

PPV VP2和PCV2 ORF2重组病毒样颗粒的获得及其免疫原性研究

将PCV2 ORF2基因插入PPV VP2基因HindⅢ酶切位点(即PPV VLPs的N端1/3处)获得重组基因VP2.ORF2,并将其克隆到真核表达载体pEGFP-C1中得到重组质粒pEGFP-VP2.ORF2,经转染及电镜观察表明成功获得VP2.ORF2重组病毒样颗粒。重组病毒样颗粒经超速离心纯化后免疫小鼠,同时设立PPV普通疫苗、PCV2弱毒株及空白对照组,并在不同时期检测小鼠CD_3~+、CD_4~+、CD_8~+T淋巴细胞动态变化情况及PPV和PCV2抗体水平。结果显示:VP2.ORF2重组病毒样颗粒免疫小鼠后能诱导较高水平的细胞免疫和高于同等条件普通疫苗和弱毒株的体液免疫水平。此研究结果为进一步探索VP2.ORF2重组病毒样颗粒的形成机制提供了依据,也为PPV-PCV2二联疫苗的研发打下了基础。     

口蹄疫病毒二价DNA疫苗的构建及实验免疫研究

通过PCR方法从本室已构建的克隆载体pGEMT-P1-2A获得O型口蹄疫病毒主要保护性抗原VP1基因,以基因突变获得A型VP1基因。将这两种血清型的VP1基因串联后连接到真核表达载体PVAX1 PCMV启动子下游,构建成口蹄疫二价核酸疫苗pVAX1-OA。经Western blot和IFA检测,目的蛋白在HeLa细胞中获得正确表达。动物实验表明,免疫小鼠T淋巴细胞明显增殖,特异性CTL杀伤活性较对照组显著提高;血清抗体能分别与O型和A型抗原反应,抗体效价均高于空白对照组,但较灭活苗低。     

外源抗原表位在大肠杆菌CS3菌毛上的呈现

为了探讨ＣＳ３菌毛多位点用于外源表位呈现以及重组蛋白的免疫原性,通过对ＣＳ３亚基蛋白二级结构、抗原表位、亲水性及柔韧性的预测分析,找出了两个新的插入位点７２位和１３６位,将口蹄疫病毒ＶＰ１、脊髓灰质炎病毒Ｃ３等多种表位插入到ＣＳ３中,全细胞ＥＬＩＳＡ、免疫荧光检测和电镜观察等均表明外源表位在大肠杆菌表达得到了表达,而且７２位表达水平明显高于１３６位。用重组菌腹腔注射免疫小鼠,可诱发机体产生针对ＣＳ     

Interleukin-6 expression by cultured human endothelial cells in contact with carbon coated polyethylene terephthalate

In order to evaluate if carbon coated polyethylene terephthalate (C-PET) could favor inflammatory reactions, the expression of interleukin-6 (IL-6) by cultured human umbilical vein endothelial cells was tested in vitro. The cultures were put in contact with C-PET for 1, 24, 48 and 72 h. The same cells cultured on tissue culture-treated polystyrene without biomaterials were tested as the negative control; the same cells incubated with LPS were the positive control. The level of IL-6 in the conditioned medium was tested by enzyme immunoassay; the mRNA expression was evaluated by RT-PCR with specific primers. The cultures incubated with C-PET produced non significantly different amount of IL-6 compared to the negative control and did not induce the expression of IL-6 specific mRNA. LPS induced a significantly higher release of IL-6 in the medium and the expression of mRNA after 24, 48 and 72 h. We conclude that C-PET does not stimulate the synthesis of IL-6 and therefore does not favor inflammatory reaction through the release of this cytokine. © 2001 Kluwer Academic Publishers     

一种新型双向启动子--棉花曲叶病毒启动子的分离、序列分析与功能初探

以棉花曲叶病毒(CLCuV)侵染的烟草叶片组织总DNA为模板,通过聚合酶链反应扩增CLCuV双向启动子片段并插入克隆载体.序列分析和同源性比较表明,克隆的启动子长436bp,与目前发现的9种CLCuV株系的启动子序列均不相同,同源性最高达99.32%.将启动子片段分别以不同方向与GUS报告基因和nos终止子融合,构建了瞬时表达载体.通过基因枪法将质粒载体导入烟草和棉花叶片细胞中进行瞬时表达,结果表明,互补链基因方向启动子属强启动子,在叶肉及维管组织均有较高的活性;病毒链基因方向启动子表达活性较低.本文初步证实分离的互补链基因启动子可作为新型强启动子应用于双子叶植物尤其棉花的遗传转化.     

Up-regulation of T lymphocyte and antibody production by inflammatory cytokines released by macrophage exposure to multi-walled carbon nanotubes

Our data demonstrate that multi-walled carbon nanotubes (MWCNTs) are internalized by macrophages, subsequently activating them to produce interleukin (IL)-12 (IL-12). This cytokine induced the proliferative response of T lymphocytes to a nonspecific mitogen and to ovalbumin (OVA). This increase in the proliferative response was accompanied by an increase in the expression of pro-inflammatory cytokines, such as interferon-gamma (IFNγ), tumor necrosis factor-alpha (TNFα) and IL-6, in mice inoculated with MWCNTs, whether or not they had been immunized with OVA. A decrease in the expression of transforming growth factor-beta (TGFβ) was observed in the mice treated with MWCNTs, whereas the suppression of the expression of both TGFβ and IL-10 was observed in mice that had been both treated and immunized. The activation of the T lymphocyte response by the pro-inflammatory cytokines leads to an increase in antibody production to OVA, suggesting the important immunostimulatory effect of carbon nanotubes.     

脂质体包裹猪白细胞介素6基因对猪带绦虫抗原基因免疫小鼠的影响

比较研究了BALb/c小鼠分别肌肉注射猪带绦虫抗原基因VTS76、猪白细胞介素6（VPIL－6）联合VTS76及其阳离子脂质体包裹质粒等5个处理的免疫效应。结果表明，VTS76联合VPIL－6共注射小鼠的IgG含量和抗体滴度，脾细胞增殖反应和IL－2诱生活性以及免疫细胞数量，均比注射VTS76的显著增强。经阳离子脂质体包裹的VTS76＋VPIL－6在减少质粒用量80％时，免疫应答水平仍显著高于脂质体包裹VTS76，且明显高于VTS76＋VPIL－6，证明VPIL－6能显著增强基因疫苗（VTS76）免疫小鼠的免疫应答。     

人免疫缺陷病毒I型p24gag基因的重组与表达

将编码人Ｉ型免疫缺陷病毒（ＨＩＶ－１）衣壳蛋白的ｐ２４ｇａｇ基因片段，克隆到原核表达载体ｐＥＴ－１７ｂ的Ｔ７噬菌体启动子下游，构建成了重组表达质粒ｐＥＴ２４，并使ｐ２４ｇａｇ基因片段在大肠杆菌ＢＬ２１（ＤＥ３）中高效表达，产物为３０ｋＤａ的ｓ１９－ｐ２４融合蛋白，表达量占菌体总蛋白的３８．４％。重组ｐ２４蛋白均与抗ｐ２４单克隆抗体及ＨＩＶ－１阳性血清发生特异性反应，具有较好的抗原性。