联合应用凋亡素基因、新城疫病毒HN基因及IL-18基因对黑色素瘤的抑制效应研究

以前的研究结果表明,来自于鸡贫血病毒的凋亡素基因、来自于鸡新城疫病毒的HN基因和IL-18基因具有不同的抗肿瘤效应,但上述基因抗肿瘤的机制不同,本研究在双启动子真核表达质粒pIRES中的CMV启动子下游插入凋亡素基因,IRES启动子下游插入IL-18HN嵌合基因,构建能同时表达三种基因的真核表达质粒pIRVP3IL-18HN。复制C57BL／6小鼠荷黑色素瘤模型,并将质脂体包裹的重组质粒进行瘤内注射,共注射3次,每次100μg质粒,拟观察凋亡素、新城疫病毒HN基因和IL-18基因以核酸疫苗的形式联合应用对小鼠黑色素瘤的抑制效应。结果显示pVIL-18HN、pVlL-18和pVVP3IL-18均有抑制肿瘤作用,但pIRVP3IL-18HN组抑瘤率高于pVIL-18HN组、pVIL-18VP3组、pVIL-18组和Hanks液对照组。研究结果提示,上述3种基因联合应用具有协同抑瘤效应。     

鸡贫血病毒VP3基因诱导人肺癌细胞SPC-A1凋亡的作用机制

探索了重组质粒pVVP3对人肺癌细胞SPC-A1的作用及机制.将pVVP3经脂质体介导转染人肺癌细胞SPC-A1,通过MTT方法检测了细胞活力;采用吖啶橙/溴化乙锭(AO/EB)染色分析了肿瘤细胞凋亡;采用罗丹明123和DCFA染色测定了线粒体跨膜电位(△Ψm)和活性氧水平变化;通过底物染色反应检测了Caspase-3活性.检测分析结果表明:重组质粒pVVP3转染人肺癌细胞SPC-A1后,细胞活力明显降低; AO/EB染色可见明显的细胞凋亡形态学变化;与空质粒对照相比,线粒体△Ψm下降(P＜0.01),活性氧水平升高(P＜0.05),Caspase-3活性增强(P＜0.01).以上结果提示,重组质粒pVVP3能够通过上调ROS水平,下调线粒体△Ψm,进而激活Caspase-3,最终诱导人肺癌细胞凋亡.     

口蹄疫三价重组鸡痘病毒疫苗分子设计及其构建

针对我国口蹄疫(FMD)流行情况,利用计算机软件模拟分析,构建了口蹄疫病毒(FMDV)复合多表位基因工程疫苗表达盒OAAT.该表达盒以O型、A型FMDV结构蛋白VP1全基因和AsiaI型FMDV 2个基因拓扑型的结构蛋白VP1基因上的5个抗原表位基因(其中2个抗原表位来源于FMDVIND63/7株,该毒株与我国新疆分离株属于同一基因拓扑型,其余3个抗原表位来源于FMDVYNBS/58株)作为主要免疫原基因,以非结构蛋白上的2个Th2细胞表位基因及结构蛋白上的1个Th2细胞表位基因作为辅助基因.将构建好的表达盒OAAT和猪IL-18基因分别插入到鸡痘病毒(FPV)表达载体pUTA-16-LacZ复合启动子(ATI-P7.5×20)和单一启动子(P7.5)下游,构建了携带OAAT表达金和猪IL-18基因的重组鸡痘病毒转移载体质粒pUTAL-OAAT-IL18.应用脂质体转染法,将重组鸡痘病毒转移载体质粒与282E4株FPV共转染鸡胚成纤维细胞(CEF),经BrdU进行3次加压蚀斑筛选后,以不同代次的细胞mRNA为模板,利用FMDV VP1基因和猪IL-18基因特异引物进行RT-PCR和IFA检测,筛选出OAAT和猪IL-18基因共表达的重组鸡痘病毒rF-PV-OAAT-IL18,该重组鸡痘病毒的构建为新型FMDV活载体疫苗的研究奠定了基础.     

鸡贫血病毒VP3基因对荷C6胶质瘤Weister大鼠的治疗

构建荷C6胶质瘤Weister大鼠的肿瘤模型,随机分组给予不同的处理给药,观察治疗期间及治疗后的肿瘤生长情况,通过病理组织学、超微结构分析,检测鸡贫血病毒VP3基因核酸疫苗在Weister大鼠体内的抗肿瘤作用。结果表明,pVVP3治疗组肿瘤生长速度明显受到抑制,其抑瘤率达85．57％。病理组织学观察可见化疗对照组肝组织有点状坏死,而pVVP3治疗组肝组织未见明显病变。肿瘤组织超微结构观察在pVVP3治疗组可见典型的凋亡特征。说明鸡贫血病毒VP3基因核酸疫苗对Weister大鼠C6胶质瘤生长有抑制作用,可诱导肿瘤细胞凋亡,且对肝组织无明显损伤。     

口蹄疫病毒二价DNA疫苗的构建及实验免疫研究

通过PCR方法从本室已构建的克隆载体pGEMT-P1-2A获得O型口蹄疫病毒主要保护性抗原VP1基因,以基因突变获得A型VP1基因。将这两种血清型的VP1基因串联后连接到真核表达载体PVAX1 PCMV启动子下游,构建成口蹄疫二价核酸疫苗pVAX1-OA。经Western blot和IFA检测,目的蛋白在HeLa细胞中获得正确表达。动物实验表明,免疫小鼠T淋巴细胞明显增殖,特异性CTL杀伤活性较对照组显著提高;血清抗体能分别与O型和A型抗原反应,抗体效价均高于空白对照组,但较灭活苗低。     

PPV VP2和PCV2 ORF2重组病毒样颗粒的获得及其免疫原性研究

将PCV2 ORF2基因插入PPV VP2基因HindⅢ酶切位点(即PPV VLPs的N端1/3处)获得重组基因VP2.ORF2,并将其克隆到真核表达载体pEGFP-C1中得到重组质粒pEGFP-VP2.ORF2,经转染及电镜观察表明成功获得VP2.ORF2重组病毒样颗粒。重组病毒样颗粒经超速离心纯化后免疫小鼠,同时设立PPV普通疫苗、PCV2弱毒株及空白对照组,并在不同时期检测小鼠CD_3~+、CD_4~+、CD_8~+T淋巴细胞动态变化情况及PPV和PCV2抗体水平。结果显示:VP2.ORF2重组病毒样颗粒免疫小鼠后能诱导较高水平的细胞免疫和高于同等条件普通疫苗和弱毒株的体液免疫水平。此研究结果为进一步探索VP2.ORF2重组病毒样颗粒的形成机制提供了依据,也为PPV-PCV2二联疫苗的研发打下了基础。     

共表达H5、H7亚型AIV HA基因与鸡IL-18基因的重组鸡痘病毒构建

以鸡痘病毒(FPV)疫苗株为载体,将H5和H7亚型禽流感病毒血凝素(AIV HA)基因串联后(拥有同一个阅读框)和鸡白细胞介素-18(IL-18)基因分别插入到鸡痘病毒表达载体pUTA-16-LacZ复合启动子(ATI-P7.5×20)和单一启动子1(P7.5)下游,构建了携带AIV HA基因和鸡白细胞介素-18基因的重组鸡痘病毒转移载体质粒pUTAL-H5-H7-IL18;用相同的方法构建重组鸡痘病毒转移载体质粒pUTAL-H5-IL18;将H5亚型AIV HA基因插入到鸡痘病毒表达载体pUTA2复合启动子(ATI-P7.5×20)下游,构建了携带H5亚型AIV HA基因的重组鸡痘病毒转移载体质粒pUTA2-H5.应用脂质体转染法,将重组鸡痘病毒转移载体质粒与282E4株鸡痘病毒共转染鸡胚成纤维细胞(CEF),经BrdU进行三次加压蚀斑筛选后,以不同代次的细胞mRNA为模板,利用H5亚型AIV HA基因、H7亚型AIV HA基因和鸡IL-18基因特异引物进行RT-PCR和蛋白印迹检测,筛选出H5HA-H7HA融合蛋白基因和鸡IL-18基因共表达的重组鸡痘病毒rFPV-H5HA-H7HA-IL18,H5亚型AIV HA基因和鸡IL-18基因共表达的重组鸡痘病毒rFPV-H5HA-IL18以及单独表达H5亚型AIV HA基因的重组鸡痘病毒rFPV-H5HA.这些重组鸡痘病毒的构建为AIV活载体疫苗的研制奠定了基础.     

猪、牛成纤维细胞α-1,3-半乳糖基转移酶基因的敲除以及人白细胞抗原-G1基因的敲入

构建了敲除猪α-1,3-GT并敲入人白细胞抗原HLA-G1基因的打靶载体pZJ,其中以新霉素抗性基因(Neo)为正筛选基因,绿色荧光蛋白基因(GFP)为负筛选基因.采用优化的脂质体转染法将打靶载体pZJ转染于一个长势良好的胎猪成纤维细胞系中,经7天G418(600 μg/ml)药物筛选,共获得30个Neo抗性细胞克隆,其中12个为非绿色荧光细胞克隆,7个扩大培养良好,提取阳性克隆细胞的基因组DNA并进行PCR检测.经PCR结果检测,打靶载体转入到胎猪成纤维细胞中,其中3个非荧光阳性单克隆细胞在细胞基因组中进行了定点整合.以同样的脂质体转染条件将pZJ转染牛胎儿成纤维细胞,经筛选并对其进行PCR检测,其中2个均为定点整合阳性.该研究为今后克隆出表达HLA-G1而不表达α-1,3-GT基因的个体猪,从而提供可以真正用于临床的异种器官打下了基础,也为猪牛之间的跨物种敲除提供了一个佐证.     

一种体内高效表达反义RNA、三链形成RNA及Ribozyme的新载体

为了在体内高效表达反义RNA,三链形成RNA与Ribozxyme,通过PCR克隆技术构建了一种全新载体pBSKnerrU6’。该载体利用hsnRNA U6基因表达单元的特性,保留了U6RNA分子5’端维持分子稳定性的发夹和帽式结构的序列,缺失了其中间参与mRNA前体剪切的部分,取而代之的是3个限制性内切酶位点,Hela细胞核抽提物体外转录实验证明该载体可有效地表达U6变体RNA分子,该载体携带新霉素抗性基因neo^r,因而可用于真核细胞核细胞稳定转染的筛选。     

藻蓝蛋白对Hela细胞CD59基因表达调控作用的研究

探讨了钝顶螺旋藻藻蓝蛋白(PC)对Hela细胞CD59基因表达的调控作用.以正常人CD59cDNA基因为模板,经PCR扩增后重组入真核表达质粒载体pALTER-MAX,然后利用阳离子脂质体(Lipfectamine-2000)将重组质粒和PcDNA共转染人子宫颈癌细胞(Hela)和对照用正常中国仓鼠卵巢细胞(Chinese hamster ovary,CHO)进行表达.用不同浓度的钝顶螺旋藻藻蓝蛋白作用于转染细胞,通过核酸分子杂交技术、免疫荧光标记法和ELISA法对细胞中CD59分子的表达进行检测.结果表明:成功构建了重组质粒pALTER-MAX-CD59,并将其导入真核细胞(Hela,CHO),经G418筛选获得了CD59分子高效表达的细胞克隆.用藻蓝蛋白作用于筛选出的转基因细胞,证实藻蓝蛋白可促进Hela细胞表面CD59蛋白的表达并抑制Hela细胞的增殖,而对于正常CHO细胞无明显作用.     

HIV-1核心蛋白Gag与IL-6共表达重组鸡痘病毒的构建及其免疫原性研究

分别将IL-6和HIV-1gag基因插入到鸡痘病毒表达载体质粒pUTAL串联启动子和复合启动子(ATI-P7．5)下游，构建了重组鸡痘病毒表达质粒pUTA-GAG-IL6。经同源重组和Western blot检测，获得重组鸡痘病毒，并将该重组病毒免疫BALB／c小鼠，检测免疫小鼠血清抗体水平和特异性CTL杀伤活性。结果获得的重组鸡痘病毒可同时表达HIV-1核心蛋白和IL-6，并在感染细胞内形成病毒样粒子。重组病毒具有良好的免疫原性，可诱导小鼠产生特异性体液免疫和细胞免疫。     

表达人白细胞介素—2的重组腺病毒的制备

携带人白细胞介素－２ ｃＤＡ序列的Ｅ１区缺陷的腺病毒载体ｐＡｄｌ２／ＲＳＶ－ＩＬ２－ｂｐＡ与ｐＪＭ１７质粒，通过磷酸钙沉地共转染２９３细胞，经同源重组，获得了一个腺病毒噬斑。抽提腺病毒ＤＮＡ，运用ＰＣＲ扩增及ＸｂａＩ酶切检测，证实这一噬斑为带有人ＩＬ－２ ｃＤＮＡ序列的重组腺病毒。受其感染的２９３细胞和人黑素瘤Ａ３７５细胞上清中，都能够测出ＩＬ－２的活性，表明制备的重组腺病毒是能表达人ＩＬ－２的。     

人骨形态发生蛋白－1（hBMP－1）成熟肽的基因克隆及其在大肠杆菌中的表达

采用ＰＣＲ方法从ＢＭＰ－１的ｃＤＮＡ中克隆了ＢＭＰ－１成熟肽的编码基因，删除了ＢＭＰ－１前体分子Ｎ端的信号肽序列和Ｃ端的其他序列。用ＨｉｎｄⅢ消化１．３Ｋｂ的ＰＣＲ产物，将０．８４和０．４６Ｋｂ两片段分别克隆到ｐＵＣ载体中进ＤＮＡ序列分析。分别酶切回收ＥｃｏＲ－ＨｉｎｄⅢ和ＨｉｎｄⅢ－ＢａｍＨⅠ两目的基因片段，与大肠杆菌表达载体ｐＢＶ－２２０进行退火连接，使插入基因受控于Ｐ＿ＲＰ＿Ｌ启动子。将含有ＢＭＰ－１成熟肽编码基因重组表达质粒ｐＢＶＢＭＰ－１转化大肠杆菌宿主细胞进行温度诱导表达。结果表明，经４２℃热诱导后，大肠杆菌能以包涵体形式表达ＢＭＰ－１成熟肽，其分子量约为５２ｋＤａ。     

抗牛精子sp18蛋白单链抗体基因的克隆及表达

应用重组噬菌体抗体技术,从小鼠抗牛精子sp18蛋白的A5杂交瘤细胞系中分离总RNA,构建重组噬菌体抗体库。以牛精子作为包被抗原,经过三轮“亲和吸附-洗脱-扩增”淘选后,用phage-ELISA筛选出特异性阳性克隆。取其中特异结合牛精子细胞的重组噬菌体抗体pCSA1克隆进行序列测定。将其ScFv(single chain fragment variable)因克隆到pET-30a( )上,用IPTG进行诱导表达,成功得到了抗sp18单链抗体基因蛋白。     

脂质体包裹猪白细胞介素6基因对猪带绦虫抗原基因免疫小鼠的影响

比较研究了BALb/c小鼠分别肌肉注射猪带绦虫抗原基因VTS76、猪白细胞介素6（VPIL－6）联合VTS76及其阳离子脂质体包裹质粒等5个处理的免疫效应。结果表明，VTS76联合VPIL－6共注射小鼠的IgG含量和抗体滴度，脾细胞增殖反应和IL－2诱生活性以及免疫细胞数量，均比注射VTS76的显著增强。经阳离子脂质体包裹的VTS76＋VPIL－6在减少质粒用量80％时，免疫应答水平仍显著高于脂质体包裹VTS76，且明显高于VTS76＋VPIL－6，证明VPIL－6能显著增强基因疫苗（VTS76）免疫小鼠的免疫应答。     

外源抗原表位在大肠杆菌CS3菌毛上的呈现

为了探讨ＣＳ３菌毛多位点用于外源表位呈现以及重组蛋白的免疫原性,通过对ＣＳ３亚基蛋白二级结构、抗原表位、亲水性及柔韧性的预测分析,找出了两个新的插入位点７２位和１３６位,将口蹄疫病毒ＶＰ１、脊髓灰质炎病毒Ｃ３等多种表位插入到ＣＳ３中,全细胞ＥＬＩＳＡ、免疫荧光检测和电镜观察等均表明外源表位在大肠杆菌表达得到了表达,而且７２位表达水平明显高于１３６位。用重组菌腹腔注射免疫小鼠,可诱发机体产生针对ＣＳ     

共表达FMDV P1-2A和3C重组鸡痘病毒疫苗与核酸疫苗的实验免疫研究

将口蹄疫病毒(FMDV)衣壳蛋白前体P1-2A基因和蛋白酶3C基因分别插入到鸡痘病毒表达载体质粒pUTA-16Lac Z的复合启动子和单一启动子的下游,构建共表达重组鸡痘病毒转移载体质粒pUTAL3CP1,与282E4株FPV共转染鸡胚成纤维细胞,经RT-PCR、IFA及Western blotting检测,成功获得能正确表达目的蛋白的重组鸡痘病毒株vU-TAL3CP1。并与FMDV重组核酸疫苗免疫小鼠实验表明,各实验免疫组均能诱导小鼠产生特异性的细胞免疫和体液免疫反应,其中以重组鸡痘病毒与核酸疫苗联合免疫效果好于其它实验各组。