N-氨甲酰基-D-氨基酸酰胺水解酶基因的克隆与表达

按本室纯化的N 氨甲酰基 D 氨基酸酰胺水解酶 (DCase)的N 末端氨基酸序列设计了正向引物 ,并在已报道的不同来源菌株DCase的氨基酸序列同源性分析的基础上 ,设计了反向引物。用菌株No . 2 2 62总DNA为模板 ,经PCR扩增获得长度为约0 9kpb的片段 ,DNA序列分析表明基因全长为 912bp。将该片段插入 pET 3a ,构建成重组子 pET DCase ,并在E coliDH5α中获得表达 ,经SDS PAGE检测 ,表达产物分子量与天然纯DCase相同 ,约为 35kD。     

华根霉(Rhizopus chinensis)前导肽脂肪酶基因的克隆及其在Pichia pastoris中的表达

通过3次PCR程序克隆得到了华根霉(Rhizopus chinensis CCTCCM201021)脂肪酶全基因序列,该基因的开放阅读框长1170bp,不含内含子,编码一个389个氨基酸残基的蛋白质,包括26个氨基酸的信号肽,94个氨基酸的前导序列和269个氨基酸的成熟肽,其推断的氨基酸序列与一些已报道的根霉脂肪酶序列同源性为86%.在巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115中分泌表达前导肽序列.SDS-PAGE分析表明表达蛋白的分子量约37kD.N-端氨基酸序列分析表明该重组蛋白分泌过程中前导序列N-端的67个氨基酸被切割掉,表达的重组脂肪酶由前导序列C-端的27个氨基酸和成熟肽的269个氨基酸组成.发酵132h后上清中重组脂肪酶的表达量最高,蛋白含量约5.4mg/mL,橄榄油乳化法测水解酶活为161U/mL,其比活比野生型华根霉脂肪酶高约43倍.     

抗夏菌蛋白Rs—AFP2基因定点突变及其对大肠杆菌中表达的影响

为了研究遗传密码子对表达调控的影响，利用PCR重叠延伸法，对萝卜抗真菌蛋白Rs-AFP2基因编码序列区的部分核苷酸进行沉默突变，构建突变体Rs-AFPm。序列分析表明，PCR产物全长240bp，有一个阅读框，编码的蛋白由29个氨基酸的信号肽和51个氨基酸的抗真菌蛋白组成。突变体与突变前的Rs-AFP2基因相比，在编码区第3号氨基酸Lys相差一个碱基(TTG→TTA)，第5号氨基酸G1n相差一个碱基(CAG→CAA)，第6号稀有密码子Arg相差两个碱基(CAG→CGA)。重新合成引物，将切除信号肤的Rs-AFP2基因和Rs-AFPm基因与原核表达载体pET-21b( )分别重组到大肠杆菌BL21菌株。IPTG诱导后，二者均得到了表达。软件分析显示，突变前pETAFPm表达产物占全菌蛋白的3％，突变后pETAFPo的表达产物占全菌蛋白含量的8％；表达蛋白主要以包涵体的形式存在，包涵体经超声波破碎后，蛋白质复性，抑菌结果表明，pETAFPm。表达产物的抑菌半径大于pETAFP2表达产物的抑菌半径。这些都说明改造后的Rs-AFPm基因与Rs-AFP2基因相比，已有效地提高表达量。     

松杨栅锈菌小种特异性DNA片段的SCAR标记转换

用SCAR标记技术对松杨栅锈菌生理小种特异性DNA片段进行了转化和检测研究.通过对RAPD随机引物的扩增筛选,发现随机引物BAO118扩增产生的约700bp的DNA片段与松杨栅锈菌小种特异性相关联.将该片段进行回收、TA克隆、双向测序和序列整合后,序列全长685bp,3'端有BAO118随机引物序列.根据整合后序列,用Primerselect软件设计了一对包含随机引物序列的简并引物对.用该引物对对供试菌样进行PCR扩增,成功获得了松杨栅锈菌小种685bp的SCAR标记.用该标记进行田间混合孢子菌样、单孢子接种菌样DNA检测,均得到了685bp的DNA片段,不受寄主DNA和孢子菌系类型的影响,具有较好的稳定性和特异性.     

人的Bcl—XL和Bcl—Xs cDNA的克隆及表达研究

利用一对带有Ｔａｔ序列的Ｂｃｌ－专一性引物从ＢＥＡＳ－２Ｂ细胞中扩增出ｂｃｌ－ＸＬ和ｂｃｌ－Ｘｓ ｃＤＮＡ，并将它们克隆入ｐＧＥＸ－５Ｘ－３载体进行表达，用ＩＰＴＧ诱导表达的融合蛋白占菌体蛋白总量的３０％，经谷胱甘胱－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ亲和层析，蛋白纯度达９０％，这些结果为进一步研究Ｂｃｌ－ｘ在编程性细胞死亡中的作用奠定了基础。     

天山根瘤菌(R.tianshanense)模式菌株16SrDNA全序列测定及其系统发育

对天山根瘤菌群的模式株A－IBS（＝CCBAU3306）16SrDNA的全序列进行了测定，以确定它在系统发育中的地位。实验中设计了6个引物，通过聚合酶链反应扩增天山根瘤菌模式菌株A－IBS的16SrDNA。应用DNA定向测序技术，获得了菌株A－IBS的16SrDNA全序列，将所得序列与根瘤菌已知种的模式菌株16SrDNA全序列一起进行聚类分析，得到了系统发育树状图。在树状图中，菌株A－IBS所代表的根瘤菌群与华癸根瘤菌（R．huakuu）群、鹰嘴豆根瘤菌（R.ciceri）群、地中海根瘤菌（R．mediterrranean）群及百脉根根瘤菌（R．loti）群的亲缘关系较近，与其它根瘤菌群的亲缘关系较远，存在着属水平的差异，表明了这些相近根瘤菌群构成了根瘤菌的一个独立的发育系。     

WSSV-VAP1基因克隆及在毕赤酵母中的表达

根据WSSV-黏附蛋白(VAP1)基因序列设计了一对引物,在5‘引物和3‘引物中分别引入EcoRI和XbaI酶切位点。经PCR扩增,将VAP1基因克隆至穿梭载体pGAPZαA之GAP启动子下游位点,构建成含α-factor信号肽的重组表达载体,获得的重组质粒pGAPZαA-VAP1经线性化后转入毕赤氏酵母SMD1168菌株,构建成分泌型表达VAP1的酵母工程菌株。SDS-PAGE和Western-blot及结合活性检测分析表明,VAP1基因在该体系中得到成功表达,表达产物与对虾细胞膜具明显的结合活性。     

海带配子体叶绿素a/c结合蛋白基因lhcf6的序列特征与系统发生分析

通过根据糖海带(Laminaria saccharina)叶绿素 a/c 结合蛋白基因 lhcf6 的 cDNA 序列设计的引物和 PCR 方法获得了海带(L.japonica)配子体 llwf6 基因的 cDNA 全长序列(GenBank 登录号:DQ250739).该序列的开放阅读框(ORF)与糖海带 lhcf6 编码序列的相似性高达 99%,而两非翻译区(UTR)序列的相似性只有94%.经推测,海带配子体 lhcf6基因序列的 ORF 编码一个含 218 个氨基酸的前体蛋白 LHCF6,其氨基端的 40 个氨基酸组成跨质体内质网和叶绿体膜的信号肽,跨膜酶切后变为含 178 个氨基酸的成熟蛋白,它的分子量为 19.3 kD,等电点为 4.88.预测的成熟蛋白 IJ-ICF6 高级结构存在 2 个保守性的β折叠和 3 个跨类囊体膜的 a 螺旋区.根据海带配子体 LHCF6 成熟蛋白以及 GenBank 中 12 个同源蛋白质的氨基酸序列所构建的 Neighbor-joining 分子进化树,显示藻类在光捕获蛋白氨基酸序列水平上存在着蓝藻与红藻、杂色藻类、裸藻与绿藻等三个方向的演化途径,其中裸藻和绿藻与高等植物的亲缘关系更近.     

具有5+12优质亚基节节麦的低分子量谷蛋白基因序列分析

根据低分子量谷蛋白亚基(LMW-GS)基因编码区保守序列设计引物,对具优质高分子量谷蛋白亚基(HMW-GS)5 12的节节麦材料AS63进行扩增,得到长度约为900bp和1000bp的DNA片段,克隆测序后获得3个LMW-GS基因序列LMWD-1(GenBank登录号AY841013)、LMWD-2(GenBank登录号AY841014)和LMWD-3(GenBank登录号AY841015)。它们具有小麦低分子量谷蛋白基因的典型结构特征。其中,LMWD-1和LMWD-2具有完整编码区,长度分别为1065bp和972bp,可分别编码333和302个氨基酸残基的成熟蛋白,且第一个半胱氨酸残基均出现在重复区第13位。在重复区,LMW-1的两个疏水单元为PIIIL和PVIIL,而LMWD-2的两个疏水单元为PIIIL和SVIIL。LMW-1的重复区中还存在一个连续13个Q组成的短肽。LMWD-3由于编码区内存在提前终止密码子,为不表达的假基因。氨基酸序列比较发现,LMW-GS基因的N-末端区序列具有位点特异性,且LMW-1和LMWD-2与普通小麦Gtu-D3位点的LMW-GS基因有很高的一致性。     

小麦印度腥黑穗病菌的分子检测

根据GenBank中登录Tilletia属的20个种的核糖体转录间隔区(ITS)序列差异设计1对引物T1／T2，可以特异地从T.indica和T.wallceri菌株中扩增到一条450bp左右的条带，而从其他供试菌株中不能扩增出条带，表明该对引物可以将这二个种与Tilletia其他种区分开。进一步根据T．indica和T．walked的线粒体DNA序列的差异设计一对引物M1／M2，只能特异地从T．indica DNA中扩增到一条250bp左右的条带，表明该对引物可以将T．indica与T．walked区分开。利用上述2对引物分别与ITS区通用引物ITS1/ITS4．和线粒体引物Ti-1／Ti4组合建立套式PCR检测体系，能够直接将T．indica与其他相似或相关种区分开，且灵敏度可达1个冬孢子。此外，还观察到在反应体系中加入适量的(NH4)2SO4对PCR反应具有增效作用，可以提高检测灵敏度。上述结果提示建立的套式PCR反应体系可望能应用于口岸对T．indica的检疫。     

天山根瘤菌模式菌株全序列测定及其系统发育

对天山根瘤菌群的模式株Ａ－ＩＢＳ１６ＳｒＤＮＡ的全序列进行了测定，以确定它在系统发育中的地位。实验中设计了６个引物，通过聚合酶链反应扩增天山根瘤菌模式菌株Ａ－ＩＢＳ的１６ＳｒＤＮＡ。应用ＤＮＡ定向测序技术，获得了菌株Ａ－ＩＢＳ的１６ＳｒＤＮＡ全序列，将所得序列与根瘤菌已知种的模式菌株１６ＳｒＤＮＡ全序列一起进行聚类分析，得到了系统发育树状图，在树状图中，菌株Ａ－ＩＢＳ所代表的根瘤菌群与华癸根瘤菌群     

中国人IL－9cDNA的亚克隆及其高效表达

在完成了ｈＩＬ－９ｃＤＮＡ的克隆及序列测定的基础上，为实现ｈＩＬ－９ｃＤＮＡ在原核细胞中的表达，重新合成了上游引物（在酶切位，久后加上ＡＴＧ）。以ｐｕｃ１９－ｈＩＬ－９ｃＤＮＡ为模板进行了ＰＣＲ扩增，特异产物经ＥｃｏＲＩ酶切、回收后与经ｓｍａｌＩ、ＥｃｏＲＩ酶切的ｐＢｖ２２０载体连接，转化大肠杆菌。转化子质粒用０．８％ａｇａｒｏｓｅ电泳粗筛，经ＥｃｏＲＩ、Ｐｓｔｌ酶切后得到了３个阳性克隆。３个阳性克隆经热诱导后，在ＰａＰ＿Ｌ启动子作用下，获得了天然ｈＩＬ－９ｃＤＮＡ的高效表达，表达量分别达到可溶性总蛋白的３７．３％、４３．８２％、５４．５２％。     

人的Bcl－X_L和Bcl－X_ScDNA的克隆及表达研究

利用一对带有Ｔａｔ在序列的Ｂｃｌ－ｘ专一性引物从ＢＥＡＳ－２Ｂ细胞中扩增出比ｂｃｌ－ＸＬ和ｂｃｌ－ＸｓｃＤＮＡ，并将它们克隆入ｐＧＥＸ－５Ｘ－３载体进行表达。用ＩＰＴＧ诱导表达的融合蛋白占菌体蛋白总量的３０％，经谷胱甘肽－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ亲和层析，蛋白纯度达９０％。这些结果为进一步研究Ｂｃｌ－ｘ在编程性细胞死亡中的作用奠定了基础。     

长爪沙鼠Tim-1基因部分序列克隆及表达分析

根据美国国立生物技术信息中心(NCBI)中基因库(GenBank)里查询到已登录的小鼠、大鼠的Tim-1mRNA序列,通过同源比较,设计引物,首次对长爪沙鼠Tim-1基因部分编码序列进行分子克隆.经过PCR扩增,获得长爪沙鼠Tim-1基因243bp部分编码序列,经测序后登录GenBank(JN628997),发现该序列与小鼠、大鼠Tim-1相应部分有80%以上的相似性.利用所克隆的序列设计引物,建立荧光定量PCR方法检测长爪沙鼠Tim-1基因在不同组织中表达情况.结果显示,长爪沙鼠Tim-1基因在不同组织中表达差异性较大,其中在肾脏组织中表达水平高于其他组织,在肌肉、心脏、小肠、脾脏、肝脏、肺组织中表达均较低.     

真鲷肌肉生长抑素(MSTN)基因的克隆及表达分析

采用同源克隆的策略,设计了3对引物,首次分离、克隆了2820bp的真鲷肌肉生长抑素(MSTN)基因组序列,该序列在GenBank上注册(注册登录号为AY965686).经过剪接、比较,分析了真鲷MSTN基因的序列和结构特征.真鲷的MSTN基因具有3个外显子、2个内含子,整个开放阅读框编码着384个氨基酸,第1个外显子上有一个连续11个Q氨基酸的残基,C-末端具有9个保守的半胱氨基酸及一个RVRR的蛋白酶解加工位点.在第1、第2内含子和3'非翻译区上分别具有一个微卫星重复序列.RT-PCR分析表明,MSTN基因在真鲷不同组织中都有表达,但表达量具有明显的差异;MSTN在肌肉中表达量最高,其次是脑、小肠、头肾、鳃和性腺,心脏、眼睛、肝脏中只有极少量表达,脾脏中没有检测到MSTN的表达.     

N-末端引入RGD序列的葡激酶突变体表达、纯化及性质研究

为解决葡激酶存在的溶栓后再栓塞问题,利用PCR介导的定点突变技术,在野生型葡激酶(wt-SAK)N-末端的第3、4位氨基酸之间插入Arg-Gly-Asp(RGD)序列构建了葡激酶突变体MD2-SAK,另将N-末端的前3位氨基酸替换为RGD序列构建了葡激酶突变体MD4-SAK.将突变体基因分别连接表达载体pBV220,转化大肠杆菌DH5α,经过热激诱导后,突变体均以可溶性形式得到高效表达,表达蛋白占菌体总蛋白的50%以上.破菌上清液通过SP-Sepharose FF、Sephadex G-50和Q-Sepharose FF三步连续的色谱层析纯化得到纤溶活性分别为10.1×104 AU/mg、11.2×104 AU/mg,纯度均大于96%的突变体蛋白.进一步研究了突变体的性质,结果表明葡激酶突变体不仅保留了野生型葡激酶的纤溶酶原激活活性,并具有较强的抗血小板聚集活性.同时发现,葡激酶突变体的N-末端序列会影响其N-末端甲硫氨酸的酶切加工.     

苏云金芽孢杆菌营养期杀虫蛋白基因vip3A的研究

根据已知vip3A基因序列设计一对特异性引物VIP3／VIP5,对218株Bt菌株进行PCR鉴定,有51株含有vip3A类基因,其中12株为不同亚种的标准菌株,有4株标准菌株不含有该基因。从Bt C9菌株中分离克隆了vip—C9基因,并插入表达载体pET—21b,转化大肠杆菌BL21,诱导表达出分子量88．6kDa的可溶性蛋白,表达产物对甜菜夜蛾和棉铃虫具有较高的杀虫活性,LC50分别为0．42ng／mg和25．95ng／mg,对小菜蛾活性较低。构建了缺失蛋白Vip—C9—N(N端去除39个氨基酸组成的信号肽序列),杀虫活性测定结果表明其对甜菜夜蛾的活性显著降低,说明N端39个氨基酸对甜菜夜蛾的活性是必需的。     

短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)脱毛蛋白酶基因的克隆与序列分析

短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)UN-31-C-42菌株是从成都市生活垃圾中分离,并经多次诱变后得到的菌株。其发酵液具有很好的脱毛效果,且对皮革胶原没有损伤。通过对该菌株发酵液中的碱性蛋白酶DHAP的纯化与N′-末端氨基酸序列测定,以及对该序列的同源性分析后,设计出相应引物,用PCR方法扩增了该菌株的碱性蛋白酶基因AP。测序结果表明,该克隆基因全长1588bp,有一个全长1149bp的编码区序列,推测蛋白质序列长383个氨基酸残基,成熟肽分子量为27．8kD。推测的成熟蛋白酶N′-末端具有与DHAPN′-末端完全匹配的序列,说明克隆到的基因为脱毛蛋白酶基因。同源性分析表明,该基因序列与已报道的其他碱性蛋白酶基因有较高的同源性。     

真鲷转铁蛋白基因的克隆与表达特征分析

采用同源克隆的方法,根据相近物种转铁蛋白(Transferrin,TF)基因的序列设计简并引物,在经感染真鲷的cDNA上进行PCR扩增,获得了真鲷TF的全基因编码序列(GeneBank Accession No．AY335444)。该序列由2444bp核苷酸组成,含31bp5’非编码区和340bp3’非编码区以及2073bp的开放阅读框,可编码691个氨基酸,预测分子量约为74．3kD,等电点为5．63。同源性分析表明,真鲷TF与鱼类TF的相似性很高,约为65％～75％;与哺乳类转铁蛋白和乳铁蛋白的相似性约40％～50％;与脊索动物海鞘和无脊椎动物昆虫也有一定的相似性。进化分析表明,该基因是转铁蛋白而不是乳铁蛋白。真鲷TF与其它动物TF结构相似,是由两叶相似的结构域构成的单一肽链;该基因有一信号肽序列,缺乏糖基化位点,在它的两个结构域上,分别有三个TF家族的标签序列及一个MHC分子标签序列;与哺乳类相比,参与蛋白二硫键形成的半胱氨酸以及铁离子结合位点高度保守。RT-PCR结果显示,真鲷TF在肝脏成组成型表达,但在其它组织中的表达可受病原调控,表现为经病原刺激后转铁蛋白基因的组织分布显著增多。