TMV、PVY福建分离物分子鉴定及末端区域变异分析

为及时准确地鉴定出病毒病原和追踪了解病毒病流行变异趋势,使用特异性引物对福建烟区病毒烟叶样品进行RT-PCR分析,分别鉴定出病毒病原为TMV和PVY.序列测定结果表明PCR扩增产物为预期的TMV 5'末端和PVY 3'末端序列,大小分别为959和646个核苷酸,均包含末端非编码区和部分病毒功能基因蛋白编码区.将所获得的病毒末端序列与国内外报道的主要病毒分离物的同一区域进行比较,分析结果显示TMV 5'端非编码区保守性极强,不同分离物之间部分126 kDa或183 kDa编码蛋白N端编码区表现出一定程度的变异(突变),PVY外壳蛋白编码区与3'末端非编码区变异数量差异不大,变异(突变)均主要为碱基转换,环境自然选择压力对病毒基因组变异(突变)具有一定的影响.     

复合亚氯酸钠灭活烟草花叶病毒的机理分析

为揭示复合亚氯酸钠（500 mg/L）杀灭烟草花叶病毒（Tobacco mosaic virus,TMV）的机理,采用荧光定量RT-PCR检测药剂处理后的病毒CP基因和Rep基因表达量,并利用间接酶联免疫吸附法测定了TMV CP的破坏程度;同时接种心叶烟,通过枯斑数统计分析了TMV的侵染活性;利用大片段步移RT-PCR检测TMV相关基因片段的损伤,并使用透射电镜观察药剂处理后病毒粒子被破坏的情况。结果显示:①药剂处理30 min可以完全抑制TMV CP基因的表达,处理60 min可完全抑制TMV Rep基因的表达。此时,TMV CP被完全破坏,病毒也完全丧失了对枯斑寄主心叶烟的侵染能力。②药剂处理30 min时,TMV的183kDa-1、183kDa-2、183kDa-3、183kDa-4、54kDa、CP&MP基因编码区等6个区域中的183kDa-2、183kDa-4和CP&MP区域首先被损伤,但接种叶叶脉和接种叶叶柄上的这3个区域可以正常扩增。处理45 min时,接种叶叶脉、接种叶叶柄和接种叶上部叶片的183kDa-1、183kDa-3和54kDa区域可以正常扩增,而其他3个区域不能正常扩增;对照叶、茎、接种叶下部叶片的6个区域均不能正常扩增。处理60 min时,各部位的基因组片段扩增结果均呈阴性。因此,可以确定药剂处理导致的CP损伤是造成病毒侵染性丧失的主要因素,核酸损伤与病毒失活无关。③透射电镜观察发现,药剂处理1.5 h后病毒粒体完全断裂成碎片状。      

烟草中TMV、CMV和PVY多重RT-PCR检测体系的建立与应用

利用DNAMAN软件对GenBank数据库中已登录的烟草花叶病毒(Tobacco mosaic virus,TMV)、黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaicvirus,CMV)和马铃薯Y病毒(Potato virusY,PVY)全基因组序列进行序列比对,选择最保守的区域,进行相应病毒的引物设计,建立了多重RT-PCR检测烟草中TMV、CMV和PVY的技术体系。对3条扩增片段进行回收、测序和BLAST比较,结果表明多重RT-PCR所扩增的片段序列均与预期设计序列相符,同源性均在98%以上。利用多重RT-PCR对广西区132个烟草病毒病样品进行检测分析,结果表明TMV检出率为91.7%,CMV检出率为18.2%,PVY检出率为55.3%。较单一的RT-PCR,具有简便、快速和经济的特点。与酶联免疫吸附法(Enzyme Linked Immunosorbent Assay,ELISA)相比,其检测限度高出ELISA的检测限度104级数,具有更高的特异性与准确性。该方法可以同步快速、特异地检测出烟草中TMV、CMV和PVY病毒的侵染。     

烟草上马铃薯Y病毒的RT-PCR检测

本文根据已报道的PVY CP基因序列,设计合成了2套扩增PVY CP基因全序列和中间部分序列的寡核苷酸引物,用两套程序分别对马铃薯Y病毒普通株系(PV YO)和马铃薯Y病毒坏死株系PV YN) CP基因进行RT-PCR扩增,结果分别得到了与预期大小一致的804和301bp片段,健康植株对照中未扩增到任何产物,建立了RT-PCR检测烟草上马铃薯Y病毒的程序。      

烟草4种病毒的多重RT-PCR检测方法构建

为有效鉴定烟草的主要病毒,包括烟草普通花叶病毒(Tobacco mosaic virus,TMV)、黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus,CMV)、马铃薯Y病毒(Potato virus Y,PVY)和烟草脉带花叶病毒(Tobacco vein banding mosaic virus,TVBMV),建立了一种同时检测这4种病毒的多重RT-PCR检测方法。通过人工接种4种病毒试验,发现TVBMV在混合侵染中受TMV、CMV和PVY的拮抗作用。为提高4种病毒复合侵染下TVBMV的检测灵敏度,筛选出TVBMV中表达水平最高的PIPO基因,利用该基因结合TMV、CMV和PVY的CP基因,基于保守区域设计引物,并优化引物及模板的浓度,在一个PCR反应体系中稳定扩增获得大小分别为700、452、275和235 bp的产物。该方法实现了对多种病毒的同时检测,适用于目前大部分烟区田间病毒复合侵染的监控。     

黔江烟田病毒与周边作物及杂草携毒关系分析

为明确烟田烟叶携带病毒与周边作物和杂草携带病毒的亲缘关系,利用RT-PCR克隆烟田烟叶与周边杂草和作物携带病毒外壳蛋白（CP）,通过MEGA序列比对分析黔江烟田烟叶和周边杂草与作物所带病毒种类及其亲缘关系。结果显示,黔江地区烟草感染病毒有烟草普通花叶病毒（TMV）、黄瓜花叶病毒（CMV）和马铃薯Y病毒（PVY）;在烟田周边杂草和作物番薯、四季豆、糯米团、三悬叶钩草、杂草中检测到了TMV;自番薯、四季豆、蓬蘽、千里光、糯米团、三悬叶钩草中扩增出CMV;自番薯、四季豆、假酸浆、杂草中扩增出了PVY。进化关系分析显示,三悬叶钩草、四季豆、糯米团以及番薯为黔江烟田烟叶TMV的主要来源,蓬蘽为烟叶病毒病CMV的侵染源,假酸浆为烟田PVY的主要来源。     

烟草脉带花叶病毒基因组序列分析

为了探明烟草脉带花叶病毒危害和流行的机制,使用RT-PCR技术扩增获得TVBMV云南分离物YN9.1基因组全序列,并进行了基因组结构、序列同源性、氨基酸保守基序、系统进化和重组分析。结果表明:(1)YN9.1基因组具有Potyvirus属病毒典型特征,含有在Potyvirus属病毒中较为少见的NIb/CP切割位点Q/N;(2)YN9.1与其它分离物核苷酸序列同源性为90.5-91.1%,氨基酸序列同源性为95.2-96.2%。与YND核苷酸和氨基酸序列同源性最高;(3)对HC-Pro和CP保守基序进行了分析。YN9.1具有RITC、PTK、DAG等病毒蚜虫传播保守基序,其中RITC在Potyvirus属病毒中常见形式为KITC;(4)系统进化树分析结果显示,TVBMV进化形成2个组,云南分离物独立进化形成一组,TVBMV进化与地域具有明显的相关性;(5)重组分析发现PY为ZC1和YN的组内重组体,重组位点位于HC-Pro 3'末端和NIb 5'端。      

重庆地区烟叶辣椒脉斑驳病毒的检测与鉴定

为确定重庆烟区烟草叶片上出现黄化斑点、枯斑等症状的病原,进而制定出科学的综合防治措施,对采自重庆市涪陵和巫溪烟区与北碚试验田的18份烟叶样品进行了病毒种类检测与鉴定。根据病毒外壳蛋白基因序列设计了特异性引物,采用RT-PCR扩增及BLAST序列对比分析,结果表明:涪陵烟区烟叶上出现黄化斑点、枯斑等症状的样品中检测出烟草花叶病毒（Tobacco mosaic virus,TMV）和辣椒脉斑驳病毒（Chilli veinal mottle virus,ChiVMV）,检出率分别为54.55%和100%;巫溪烟区样品中检测出TMV和马铃薯Y病毒（Potato virus Y,PVY）,检出率分别为100%和66.67%;北碚烟草试验田病叶样品中检测出ChiVMV,检出率为100%。其中,ChiVMV为重庆地区烟草上首次发现。      

一株突破va基因型烟草抗性的PVY病毒分离物的鉴定

  背景和目的  近来,能突破va基因型抗性的马铃薯Y病毒(Potato virus Y,PVY)毒株在烟草上不断出现。2016年,我们分离到一株抗性突破的毒株PVY-CJ,本文对该病毒分离物进行了验证和鉴定。  方法  采用病毒重新接种、多重RT-PCR、RT-PCR分段扩增病毒全长基因组、PVY病毒分子进化分析及病毒蛋白VPg蛋白序列比对等方法对PVY-CJ毒株进行了验证和鉴定。  结果  三种重新接种了PVY-CJ的va基因型烟草品种均发病。多重RT-PCR结果将PVY-CJ鉴定为PVYNTN株系。序列分析表明,PVY-CJ全长基因组包含一个全长9180 nt的开放读框,其编码一个3060 AA的多聚蛋白。分子进化分析进一步验证了其归类于PVYNTN株系。相比其他PVYNTN株系毒株,PVY-CJ的VPg蛋白105位氨基酸出现了一个由赖氨酸到谷氨酸的替换,而这一氨基酸替换导致了其对va基因来源抗性的突破。  结论  我们首次报道并鉴定了国内一株能突破va基因型烟草抗性的PVY毒株—PVY-CJ。这为进一步研制PVY抗病烟草品种提供了材料。