三株产几丁质酶菌株的筛选、产酶条件优化及水解虾壳的研究

目的:筛选鉴定产几丁质酶的菌株并优化其发酵条件,最终应用于虾壳降解研究。方法:以盐城市滩涂海泥为样品,利用平板筛选水解几丁质的菌株,运用生物信息学方法鉴定菌株,通过单因素优化其发酵条件,并将筛选得到的菌株和优化后的发酵条件用于虾壳发酵。结果:鉴定得到三株显著降解胶体几丁质的菌,分别是发光杆菌（Photobacterium sp. LYM-1）、需钠弧菌（Vibrio sp. WM-1）和希瓦氏菌（Shewanella sp. ZXY-1）;优化发酵条件:发光杆菌的碳源为几丁质10 g/L,氮源为NH₄Cl 2.0 g/L,接种量为3%,发酵液pH为6.5,温度为32 ℃,发酵1 d酶活最高为15.37±0.55 U/mL,是优化前的4.37倍;需钠弧菌的碳源为几丁质10 g/L,氮源为NH₄Cl 2.0 g/L,接种量为3%,发酵液pH为7.5,温度为22 ℃,发酵2 d酶活最高为40.82±6.03 U/mL,是优化前的1.60倍;希瓦氏菌的碳源为几丁质10 g/L,氮源为(NH₄)₂SO₄ 2.0 g/L,接种量为3%,发酵液pH为6.5,温度为22 ℃,发酵1 d酶活最高为25.64±3.29 U/mL,是优化前的2.47倍;三株菌均能利用虾壳产几丁质酶,但利用效率均低于几丁质,酶活力分别为10.25±0.95、32.16±2.25和21.81±4.27 U/mL。结论:本研究从盐碱地筛选得到三株产几丁质酶的菌株,优化后酶活力均得到提高,且均能利用虾壳产几丁质酶,为发酵虾壳制备几丁质酶提供新的菌株来源。     

高产纤维素酶真菌的筛选及鉴定

该研究旨在从腐殖土中筛选得到高产纤维素酶的菌株。利用刚果红染色作为初筛,菌株酶活测定作为复筛得到3株高产纤维素酶的菌株。通过形态学鉴定与分子生物学鉴定,菌株B03、E15为枝孢菌属(Cladosporium sp.),D11为极细枝孢菌(Cladosporium tenuissimum)。菌株B03在以CMC为底物,28℃、180 r/min条件下培养3 d后,CMC酶活达(427. 62±2. 78) U/m L,FPA酶活为(46. 83±1. 85) U/m L,在以油菜秸秆为底物时其CMC酶活也达到(352. 50±4. 17) U/m L,培养6 d后秸秆降解率达26. 8%,具有较好的降解能力。筛选得到3株高产纤维素酶的真菌菌株,其中菌株B03的纤维素酶活较高,是一株具有研究潜力的纤维素酶菌株。     

白酒黄水中纤维素降解菌的分离鉴定及产酶活性研究

为拓展纤维素降解菌资源,以羧甲基纤维素钠（CMC-Na）为唯一碳源作初筛培养基,从浓香型白酒发酵副产物黄水中分离得到18株具有产纤维素酶能力的菌株进行纯培养。形态学、生理生化和系统发育鉴定结果显示,菌株XH01、XH04、XH05、XH18为Bacillus cereus,菌株XH34为Bacillus circulans,菌株SW01、SW05为Bacillus megaterium,菌株SW02为Bacillus endophyticus,菌株SW03、SW04为Bacillus simplex,菌株SW09、SW13为Bacillus bataviensis。菌株ZL08为Penicillium camemberti,菌株ZL13为Aspergillus fumigatus,菌株ZL04和ZL25为Penicillium chrysogenum,菌株ZL15和ZL17为Alternaria tenuissima。利用二硝基水杨酸法对菌株发酵液纤维素酶活进行研究,结果表明,菌株SW02的产酶活性较高,其羧甲基纤维素酶活为153.36 U/mL,β-葡萄糖苷酶活为126.00 U/mL,微晶纤维素酶活为17.64 U/mL,滤纸酶活为30.48 U/mL。     

一株中性内切纤维素酶产生菌的分离及鉴定

利用刚果红染色法从偏碱性土壤中分离产内切纤维素酶的菌株,通过内切纤维素酶(CMC酶)的发酵液酶活和酶促反应最适pH,复筛得到1株中性内切纤维素酶产生菌A8。经形态学观察、生理生化特征分析及分子生物学鉴定,A8菌株属于蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)。其在50℃、pH7.0发酵96h条件下发酵液的中性内切纤维素酶酶活为141.70U/mL,是一株在食品加工中具有开发潜力的产中性内切纤维素酶菌株。     

酸浸高压法破壁对灵芝孢子中三种主要成分变化影响的研究

研究酸浸高压法对未破壁灵芝孢子中灵芝多糖、灵芝总三萜和麦角固醇含量的影响,与未经酸浸高压的未破壁及已破壁的灵芝孢子进行含量比较。以无水葡萄糖为对照品,用紫外–可见分光光度法,对灵芝孢子的灵芝多糖含量进行测定;以齐墩果酸为对照品,用紫外–可见分光光度法,对灵芝孢子的灵芝总三萜含量进行测定;以麦角固醇为对照品,用反相高效液相色谱法,对灵芝孢子的麦角固醇含量进行测定,根据结果对三种成分含量进行比较。结果表明,经酸浸高压的未破壁灵芝孢子,其灵芝多糖的含量明显高于未经酸浸高压的未破壁及已破壁灵芝孢子,其灵芝总三萜和麦角固醇的含量明显高于未经酸浸高压的未破壁灵芝孢子。酸浸高压法可作为一种新的灵芝孢子破壁方法,该法获得的灵芝多糖、灵芝总三萜和麦角固醇的含量明显高于对照组。     

几丁质脱乙酰酶高产菌株的选育及其发酵特性研究

以一株海洋丝状真菌（Penicillium janthinellum）UV-0S为出发菌株,通过多级紫外线诱变育种后获得几丁质脱乙酰酶（CDA） 高产突变株UV-3S,并对该菌株产CDA的发酵特性及其细胞壁几丁质的脱乙酰度（DD）进行研究。 结果表明,突变株UV-3S的胞外 CDA酶活力为11.05 U/mL,是出发菌株UV-0S的2.1倍。 该菌株产胞外CDA的最适初始pH值为9.0,最适无机盐为NaH2PO（4 11 mmol/L）, 胶体几丁质最适添加量为0.5%。 在此最佳发酵条件下,突变株UV-3S的CDA酶活力最高,为11.83 U/mL,说明CDA是一种诱导酶。 细 胞壁几丁质的脱乙酰度随真菌生长而增加,且在发酵96 h后脱乙酰度达到最高（90.52%）。     

湖北雪茄烟叶致霉菌分离鉴定及芽胞杆菌属拮抗菌株筛选

为筛选可高效拮抗湖北雪茄烟叶中致霉菌的芽胞杆菌属（Bacillus）微生物，采用形态学和分子生物学相结合的菌种鉴定方法，从湖北省十堰市和宜昌市雪茄烟叶中分离、纯化得到5种霉菌，经鉴定为聚多曲霉（Aspergillus sydowii）、产黄青霉（Penicillium chrysogenum）、绳状篮状菌（Talaromyces funiculosus）、云南木霉（Trichoderma yunnanense）和黑曲霉（Aspergillus niger）。用5种霉菌对烟叶进行回接侵染，发现湖北省宜昌市发酵前茄衣烟叶更易被5种霉菌混合的孢子悬浮液侵染，且绳状篮状菌（Talaromyces funiculosus）与黑曲霉（Aspergillus niger）均对该烟叶有强致霉性。采用牛津杯抑菌法分析了不同芽胞杆菌属（Bacillus）拮抗菌株对5种霉菌的拮抗能力，其中解淀粉芽胞杆菌DY-9(Bacillus amyloliquefaciens DY-9)对各霉菌拮抗能力均为最强。浓度为109CFU/mL时菌株DY-9菌悬液对雪茄烟叶的防霉效果最佳。     

降解玉米秸秆产纤维素酶和木质素酶菌种的筛选

筛选能降解玉米秸秆产生纤维素酶和木质素酶的菌种,并测定纤维素酶系和木质素酶系的相关酶活.经过筛选得到10株菌株,经鉴定为:Penicillium sp、Altemaria sp、Aspergillus fumigatus、Aspergillus sp、Pestalotiopsis sp、Tricherderma sp、Cephalsporium sp、Pleurotus sp.酶活分析显示,筛选得到的10株菌都有CMC酶、滤纸酶、微晶纤维素酶、Mn过氧化氢酶、漆酶等酶活性;筛选得到的茵株都具有较全面的降解玉米秸秆所需要的酶系,具有较好的玉米秸秆生物降解的研究价值.     

烟草秸秆废弃物中纤维素降解菌的筛选、鉴定及产酶条件优化

为筛选出具有解磷释钾能力的高效纤维素降解菌,从烟草秸秆中分离出21株纤维素降解菌,并通过解磷释钾能力测定、刚果红染色比较透明圈直径和菌落直径比值大小、羧甲基纤维素酶活性与滤纸酶活性测定,筛选出1株具有高效降解纤维素和解磷释钾功能的菌株。经形态学和分子生物学鉴定,该菌株为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis),命名为Bacillus subtilis SL-3A。采用单因素试验分别对培养基组分和培养条件进行优化结果表明,SL-3A产纤维素酶较佳条件:蛋白胨为氮源、羧甲基纤维素钠为碳源,C/N比为2∶1;接种体积分数为8%,发酵培养温度为37℃,初始pH为7,发酵培养转速为200 r/min。在培养基配方和培养条件优化后,其CMCase与FPase分别为169.25 U和44.99 U。SL-3A菌株经液态发酵15 d时烟草秸秆降解率为20.85%。烟草秸秆堆肥初步试验结果显示,秸秆粗纤维降解率34.62%,有效磷含量增加0.13%,有效钾含量增加2.12%。     

五株有机高分子化合物降解菌的生物安全性分析

以分离自环洞庭湖水系的3个淡水湖渔场表层底泥样品中的2株产几丁质酶菌株及3株产胶原蛋白酶菌株为研究对象,对其进行酶活分析及分子生物学鉴定,并通过药敏性、溶血性、氨基酸脱羧酶活性及硝酸还原酶活性实验对其安全性进行评价。结果表明,2株产几丁质酶菌株AL1、BM1分别被鉴定为芽孢杆菌（Bacillus sp.）和假单胞菌（Pseudomonas sp.）;3株产胶原蛋白酶菌株ALJ1、BMJ1及DJ2分别被鉴定为Pseudomonas sp.、Pseudomonas sp.和微小杆菌（Exiguobacterium sp.）。安全性试验结果表明,菌株DJ2、BMJ1分别对6种和4种抗生素高度敏感,其余菌株仅对1种抗生素高度敏感;除菌株AL1外,其余4株菌均无溶血性;除菌株DJ2外,其余4株菌均有氨基酸脱羧酶活性;5株菌均无硝酸还原酶活性。综上,菌株BM1和DJ2是降解有机高分子化合物的较安全菌株,可将其应用于有机高分子化合物的降解。     

芽菜中高效降解亚硝酸盐菌株的分离鉴定

以芽菜为研究对象,筛选亚硝酸盐高效降解菌,采用分离纯化、分子生物学鉴定等方法对菌株进行分离鉴定。结果表明:通过显色反应、降解能力测定和形态学特征比较,最终筛选出7株具有强降解能力的亚硝酸盐还原菌株,其中A5、A7在浓度为400μg/mL NaNO2的液体培养基中培养24h的降解率最快,分别为80.49%、85.03%,在培养72h后降解率接近99%,进行分子生物学鉴定,结果表明:菌株皆为芽孢杆菌属,其中A5为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、A7为贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)。     

食品及其生产环境和包装材料中分离霉菌的形态与分子鉴定

为了明确食品及食品包装材料、食品的生产坏境中污染霉菌菌株种类,本文对收集、单孢分离的55株霉菌菌株同时采用形态学和分子生物学方法鉴定,并相互验证。实验结果表明:55株污染霉菌主要包括有曲霉属(Aspergillus sp.)、镰刀菌属(Fusarium sp.)、青霉属(Penicillium sp.)、枝孢菌属(Cladosporium sp.)、链格孢属(Alternaria sp.)等,这为食品中霉菌污染的安全控制和菌株溯源提供了有价值的参考信息。     

糍粑辣椒中辣椒素降解菌株的筛选应用

该研究采用辣椒素筛选培养基进行辣椒素降解菌株筛选,并通过形态学观察及分子生物学技术进行筛选菌株鉴定后应用于糍粑辣椒发酵中,考察筛选菌株接种发酵对糍粑辣椒中辣椒素类物质含量及风味物质的影响。结果表明,共筛选出6株辣椒素降解菌株,其在辣椒素筛选培养基中辣椒素降解率在3.13%～28.34%。鉴定结果表明,筛选菌株B10、JP01、GJ02、GJ03、7B-5和28L-C分别为短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus）、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）、解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）、贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）、甲基营养芽孢杆菌（Bacillus methylotrophicus）、澄清状芽孢杆菌（Clostridium clariflavum）。其中,菌株28L-C和7B-5辣椒素降解能力较强,均可显著降低糍粑辣椒中辣椒素类物质含量（P<0.05）。菌株28L-C和7B-5强化发酵糍粑辣椒样品中重要香气、重要差异化合物分别为18种、10种。     

灵芝子实体多糖发酵工艺条件优化及抗氧化活性

为更好辅助和研究灵芝多糖，并进一步提高灵芝孢子亚门实体细胞壁基质（灵芝子实体）中灵芝多糖的抗氧化活性，选取产朊假丝酵母（Candida utilis）和扣囊复膜孢酵母（Saccharomycopsis fibuligera）作为灵芝混合多糖发酵菌种。以灵芝子实体多糖中的DPPH自由基清除率为响应值,结合单因素试验，并通过Box-Behnken设计的响应面法来进一步优化分析灵芝子实体多糖的发酵工艺。结果表明，最优的液态发酵反应条件:发酵时间60 h、接种菌量3%、pH4、发酵温度26℃。灵芝子实体多糖在此最佳发酵工艺参数下，DPPH自由基清除率为90%。说明了灵芝子实体多糖经过发酵加工后，具有较强的天然抗氧化活性。     

黄曲霉毒素B1降解菌的筛选鉴定及发酵条件优化

该研究采用香豆素筛选模型,从酒醅、大曲、榨菜、酸豆角等样品中分离筛选降解黄曲霉素B1（AFB1）菌株,通过形态学观察及分子生物学技术对筛选菌株进行鉴定,并以黄曲霉毒素B1降解率为评价指标,采用单因素及正交试验对筛选菌株的发酵条件进行优化。结果表明,共初筛出23株可利用香豆素菌株;采用高效液相色谱（HPLC）法复筛出1株AFB1高效降解菌,其降解率最高,为86.22%,菌株编号为HB022。菌株HB022被鉴定为地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）,其最优发酵条件为发酵温度37 ℃、初始pH 7.2、接种量5%、发酵时间72 h。在此优化条件下,AFB1的降解率为91.13%。     

破壁灵芝孢子的体外模拟消化特性研究

为探究破壁灵芝孢子在口腔和胃肠道中的消化吸收情况以及对肠道环境的影响。以机械碾压法、微波法和超声法破壁的灵芝孢子（Ganoderma lucidum spore,GLS）为研究对象,经体外模拟人体口腔、胃、小肠消化系统及透析模型,随后将消化后的底物进行体外发酵。测定消化各个阶段的灵芝孢子失质量率、多糖和三萜化合物释放量、生物可接受率和透析率以及小肠消化底物在0、6、12、24、48 h体外发酵过程中pH变化。结果显示,胃和小肠是灵芝孢子的主要消化场所,破壁组平均失质量率达到23.84%,其中机械碾压组更易被消化,其失质量率为29.46%。97%的多糖在胃肠液中溶出,机械碾压组多糖的生物可接受率具有最高水平,为87.33%。三萜只在破壁组小肠模拟消化中有微量溶出,平均约1.50±0.04 mg/g,95.2%的三萜随沉淀进入结肠。体外发酵结果显示,发酵液pH在0~12 h持续下降,并在12 h基本到达发酵终点。对比三种破壁灵芝孢子的消化特性,机械碾压法破壁的品质可观,不失为企业规模化破壁生产的优选。综上所述,破壁有利于提高灵芝孢子的有效成分在人体消化环境内释放量和生物可接受率,促进结肠发酵产酸,有助于调节人体肠道环境。     

耐盐高降解蛋白菌株的分离鉴定及其降解条件的研究

通过耐盐实验和发酵实验,从餐饮废水中分离得到一株耐盐且高效降解蛋白的细菌(A-3),为了确定该菌株的最佳降解条件,选择培养基初始pH、溶氧量、接种量和碳源4个影响因素进行降解实验。通过形态学、生理生化特征以及16S rDNA鉴定,将A-3初步鉴定为沙雷氏菌(Serratia sp.A3)。蛋白质降解实验结果表明:耐盐降解蛋白菌Serratia sp.A3最佳降解条件为:初始pH7.0,溶氧量180r/min,接种量5%,蔗糖作为碳源可以促进菌株对蛋白质的降解。     

酸枣叶食用菌发酵茶的研制

以秀珍菇、香菇、雪玉松茸和灵芝4种食用真菌为发酵酸枣叶菌种,通过测定菌丝生长速度和分析发酵茶黄酮、三萜和多糖等生物活性物质含量,确定灵芝为发酵酸枣叶的最佳食用菌。以灵芝发酵酸枣叶,通过单因素试验和正交试验研究酸枣叶发酵茶制备工艺,确定酸枣叶发酵茶黄酮含量最高的制备条件为:5g酸枣叶添加2g小麦米、接种量为5L、28℃发酵3d;黄酮含量为3.50mg/g。三萜含量最高的制备条件为:5g酸枣叶添加2g薏仁、接种量为15 mL、28℃发酵9 d;三萜含量为16.90 mg/g。多糖含量最高的制备条件为:5g酸枣叶添加2g薏仁、接种量为10 mL、28℃发酵9 d;多糖含量为172.99 mg/g。     

柑橘皮渣降解菌的筛选及特性

为有效处理柑橘皮渣,筛选高效降解柑橘皮渣的菌株。本实验从堆肥中分离得到5 株菌株,测定其香精油耐受性,选取两株耐受性较好的菌株测定纤维素酶和果胶酶活力,并进行柑橘皮渣降解实验。结果表明,菌株L207和L702在65 ℃条件下可正常生长,属于耐高温菌株;对柑橘香精油具有较好的耐受能力,其最大耐受体积分数为25.0%;2 株菌株的纤维素酶活力和果胶酶活力分别是对照菌株（Bacillus subtilis L520）的1.31、2.08 倍和12.68、7.30 倍。柑橘皮渣降解实验表明,菌株能快速高效分解纤维素和果胶。16S rDNA基因序列分析鉴定表明菌株L207和L702均属于地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）。     

3株降解玉米赤霉烯酮芽孢杆菌的快速鉴定

为了快速确定筛选的3株降解玉米赤霉烯酮的芽孢杆菌(Bacillus sp. YW、Bacillus sp. CP、Bacillus sp. GJ)的分类地位,利用形态学、生理生化特性、保守持家基因的进化分析及特异性PCR对菌株进行鉴定。3株芽孢杆菌的形态特征及生理生化特性非常相似,均产芽孢;结合16S rDNA序列分析、gyrA基因的系统发育树及特异引物PCR结果显示,菌株YW和CP属于贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis),菌株GJ属于解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)。本研究表明保守持家基因序列分析及特异性PCR,能够快速、灵敏地对芽孢杆菌近缘物种进行分子鉴定,为功能性微生物菌株的快速筛选鉴定提供参考。