普通烟草SWEET基因家族的鉴定与表达分析

  目的  为挖掘参与烟草糖代谢的SWEET（sugar will eventually be exported transported）基因家族成员。  方法  以拟南芥SWEET蛋白为参考,利用生物信息学方法,对栽培烟草的SWEET蛋白家族进行鉴定,分析蛋白理化性质、系统进化、染色体定位、基因结构和顺式作用元件,对其在不同组织和不同胁迫处理的表达模式进行检测。  结果  从普通烟草中鉴定到70个可能的SWEET基因,系统发育树将其划分为4个亚家族,大多数烟草SWEET基因在进化过程中经历纯化选择。不同烟草组织的表达模式分析显示,一些烟草SWEET基因具有组织表达特异性。不同胁迫处理的表达模式分析显示,部分烟草SWEET基因在葡萄糖、蔗糖、低温、干旱或者是盐胁迫处理下表达量变化明显。  结论  Ntab0097340和Ntab0727890是烟草植株重要的响应干旱与低温胁迫的基因,本研究为深入研究烟草SWEET基因功能提供有价值的参考信息。      

普通烟草脂氧合酶基因家族鉴定及表达模式分析

脂氧合酶（LOX）是脂肪酸代谢途径的关键酶,在植物的生长发育及多种逆境胁迫响应过程中发挥重要作用。本研究对烟草基因组中的LOX家族成员进行鉴定,并利用进化分析、共线性分析和表达分析等方法解析LOX家族成员的潜在生物学功能。结果表明,在普通烟草中共鉴定得到18个LOX基因,其中12个LOX基因被锚定在染色体上。系统进化分析表明,普通烟草中新鉴定的LOX家族成员被分为9-LOX和13-LOX两个亚家族,其中13-LOX又可被分为Type I和Type II两个亚类。共线性分析表明,烟草NtLOX07、NtLOX10基因分别与拟南芥AtLOX05、AtLOX01基因形成同源基因对,并且大部分同源基因之间具有相似的表达模式。表达模式分析发现,普通烟草LOX基因表达具有一定的组织特异性,并且NtLOX06等基因能够被机械损伤和茉莉酸甲脂（MeJA）处理显著诱导。因此,普通烟草LOX家族成员可能在植物胁迫响应过程中发挥着重要的作用。     

普通烟草NtNAC055基因的克隆、鉴定及表达分析

NAC家族是植物中最大的转录因子家族之一，在植物生长发育以及应对环境胁迫中起着至关重要的作用，克隆和验证烟草中NAC相关基因可为烟草抗性育种提供理论依据。本研究采用RT-PCR方法从普通烟草K326根部cDNA中克隆到NtNAC055基因，对NtNAC055及其编码蛋白进行了生物信息学分析、表达模式分析、亚细胞定位和转录激活等相关试验。结果发现，NtNAC055基因的CDS序列全长为1032 bp，NtNAC055蛋白具有典型的NAC结构域，编码一个具有343个氨基酸的NAC转录因子；通过进化分析发现，烟草NtNAC055与拟南芥ANAC055同源性较高，同属于RD26亚家族；通过亚细胞定位分析以及转录激活分析发现，NtNAC055蛋白在细胞核中且具有转录激活活性；运用qRT-PCR技术，对该基因不同组织和胁迫处理后的表达进行了分析，结果显示，NtNAC055基因在根、茎、叶、花和腋芽中均有表达，且在根部表达量最高；同时，该基因受干旱和热胁迫的诱导，表明烟草NtNAC055基因可能参与了烟草的非生物胁迫应答反应。     

普通烟草ERF转录因子亚家族成员鉴定及表达模式分析

乙烯结合响应因子(Ethylene-responsive element binding factors,ERF)家族广泛参与植物的生长发育、逆境调节及激素信号应答等过程。利用生物信息方法,鉴定普通烟草基因组ERF转录因子亚家族成员,并对该亚家族成员的染色体定位、理化性质、系统发生、保守结构域、亚细胞定位和组织表达模式进行分析。结果显示,目前在普通烟草中得到121个ERF基因,在烟草24条染色体分布位置具有不均匀性。通过构建进化树,根据拟南芥ERF亚家族的分类方式将烟草ERF亚家族分为6组,同一分组成员的理化性质及保守域呈现高度一致性。亚细胞定位分析结果显示,绝大部分成员定位在细胞核,少数定位在线粒体和叶绿体上。组织表达模式分析结果显示,烟草ERF基因在幼根、成熟根、离体叶和茎中表达量较高,不同分组成员之间表达存在差异。     

烟草ACS基因家族鉴定及二氯喹啉酸胁迫条件下的表达分析

二氯喹啉酸药害给烟叶生产造成较大影响。为明确烟草二氯喹啉酸药害的发生机制,对1-氨基环丙烷-1-羧酸合酶(1-aminocyclopropane-1-carboxylate synthase,ACS)基因家族进行了鉴定,并对二氯喹啉酸胁迫条件下的基因表达模式进行分析。结果表明,普通烟草共有26个ACS基因。染色体定位分析显示,23个ACS基因定位在染色体上,3个定位在scaffold上。亚细胞定位分析显示,ACS主要定位于细胞核或细胞质中。进化分析表明,ACS蛋白进化形成3个类别。序列比对显示,ACS氨基酸序列含有家族保守结构域和活性位点。启动子分析发现,ACS基因启动子区含有脱落酸、茉莉酸、水杨酸、生长素和赤霉素5种激素反应共10种类型的顺式作用元件。表达分析显示,大部分ACS家族成员均受二氯喹啉酸诱导而上调表达。      

普通烟草碳酸酐酶家族基因的生物信息学分析

为挖掘普通烟草碳酸酐酶基因的信息并探讨其功能,本研究利用生物信息学方法,在烟草基因组数据库中对普通烟草碳酸酐酶家族成员进行了检索,并对其理化性质、遗传进化、基因结构、蛋白保守基序、顺式作用元件和组织表达模式进行了分析。结果显示,在普通烟草中至少含有9个α和6个β亚家族成员。在进化关系上,不同亚家族成员之间,序列同源性较低;与水稻相比,拟南芥和普通烟草两个亚家族间的亲缘关系较近。亚细胞定位分析结果显示,烟草α亚家族成员在细胞壁、细胞膜、线粒体、叶绿体、细胞质等细胞器中均有分布,而β亚家族成员均存在于叶绿体中。基因结构和保守基序分析说明,各亚家族成员的基因结构和蛋白保守基序呈现较高的一致性。启动子顺式作用元件分析显示,烟草碳酸酐酶基因的启动子中,均含有多个参与光反应、激素响应、非生物胁迫和机械损伤等相关的顺式作用元件。基因组织表达模式分析表明,烟草的碳酸酐酶基因不同成员在不同组织表达水平存在差异,并呈现出时空特异性。本研究结果为烟草碳酸酐酶基因的功能研究奠定了基础。     

烟草NtbZIP038的克隆、鉴定及表达模式分析

碱性亮氨酸拉链（bZIP）转录因子是植物中数量最多、最具有多样性的基因家族之一,对植物生长发育及胁迫响应具有重要作用。为探究烟草中bZIP转录因子的生物学功能,本研究在烟草K326中克隆得到一个bZIP转录因子基因NtbZIP038,并对其保守结构域进行分析,利用qRT-PCR技术检测了该基因的表达模式,进一步结合亚细胞定位及转录激活试验对其功能进行了初步鉴定。结果表明,NtbZIP038含有典型的bZIP结构域,亚细胞定位于细胞核中并具有转录激活活性。表达模式分析表明,NtbZIP038在根中表达量最高（p<0.001）,并在盐、干旱、冷、热、脱落酸（ABA）等非生物胁迫下都有明显的表达量变化,在ABA处理下尤其明显（p<0.001）。因此,作为bZIP家族中的一员,NtbZIP038转录因子可能在烟草根系发育、ABA响应与非生物胁迫中扮演着重要的角色。     

普通烟草PPO基因家族的鉴定与表达分析

为探明烟草多酚氧化酶(Polyphenol oxidase,PPO)基因家族的生物学功能,对普通烟草PPO基因家族进行了鉴定和分析。结果表明,普通烟草有10个Nt PPOs基因,基因结构简单,蛋白结构高度保守。7个Nt PPOs基因分别定位在第3、4、5和20号染色体上,另外3个Nt PPOs基因无具体定位信息。Nt PPOs蛋白与番茄、马铃薯的亲缘关系较近。q RT-PCR结果表明,8个Nt PPOs基因在幼蕾、花瓣和蒴果中高量表达,在根、茎、叶中表达量较低;Nt PPO7与Nt PPO8在根中表达量较高,表明Nt PPOs在进化过程中出现了功能分化。     

普通烟草ALMT基因家族的鉴定与表达分析

为了挖掘可能参与烟草氯离子吸收转运的铝激活苹果酸转运蛋白(Al-activated malate transporter,ALMT)基因家族成员,利用生物信息学方法,系统地分析了烟草ALMT基因家族成员的蛋白理化性质、染色体定位、系统进化、基因结构和保守结构域等;利用qPCR的方法分析了烟草ALMT基因在不同组织中的表达情况,以及在盐(NaCl)处理下的表达特征。结果表明:普通栽培烟草基因组中鉴定出30个可能的ALMT家族基因,根据系统发育树可将其划分为五个亚组;NtALMT基因的基因结构和motif分布与其他物种一致,具有高度保守的WEP motif;组织表达特异性分析结果发现大多数NtALMT基因在茎中表达较高,只有NtALMT28在叶中表达量最高;氯盐处理下,茎中NtALMT10表达量升高8倍以上,叶中NtALMT19表达量升高25倍以上,暗示了这些基因可能与烟草氯离子吸收转运相关。     

普通烟草Dof转录因子家族的全基因组鉴定及分析

Dof（DNA binding with one finger）蛋白是植物特有的一类转录因子,在植物的多种生命进程中发挥着重要作用。为解析烟草中Dof家族成员在生长发育过程中的潜在作用,本研究利用比较基因组学、进化分析、共线性分析等方法解析烟草中的Dof家族成员的潜在生物学功能。结果表明,在烟草基因组中共鉴定到69个Dof转录因子,其Dof功能域在进化上十分保守,根据系统进化分析结果将其划分为9个亚家族。共线性分析表明,烟草中的16个Dof基因与拟南芥17个Dof基因有27个共线性基因对,同时,25个NtDof基因被检测到存在17个全基因组复制对,表明复制事件在烟草Dof基因家族的扩张中起关键作用。此外,表达模式分析表明NtDof基因的表达存在明显的组织特异性,其中NtDof05和NtDof28基因可能与根系生长发育有关。本研究对烟草基因组中的Dof转录因子进行了系统的鉴定和分析,为烟草Dof转录因子家族成员的功能研究奠定了基础。     

NtabEXPA12基因过表达对烟草叶片发育及抗逆性的影响

细胞壁松弛因子膨胀素在调控植物生长发育和响应非生物胁迫等方面发挥重要作用,克隆烟草膨胀素基因并研究其功能可为烟草叶片发育调控和抗逆育种提供理论依据。本研究从普通烟草K326中克隆了一个膨胀素基因NtabEXPA12及其启动子ProNtabEXPA12,通过实时荧光定量PCR、亚细胞定位和过表达等对该基因进行了功能研究,分析了启动子包含的顺式作用元件和活性。结果表明,NtabEXPA12在烟草叶片中具有较高的表达量;ProNtabEXPA12中包含多个响应高盐、干旱和植物激素的顺式元件,并且其活性受到高盐、干旱和ABA等的诱导;过表达NtabEXPA12通过调控细胞扩展促进转基因烟草叶片的生长发育,并可以提高转基因K326对高盐和干旱的抗性。因此,NtabEXPA12在烟草叶片发育调控及抗逆育种中具有潜在的应用前景。     

烟草ACO基因家族鉴定和二氯喹啉酸药害条件下的表达分析

烟草二氯喹啉酸药害是影响我国烟叶原料保障的重要问题之一,药害机制可能与乙烯合成相关。为了明确二氯喹啉酸药害的作用机制,对烟草1-氨基环丙烷-1-羧酸氧化酶（1-aminocyclopropane-1-carboxylate oxidase,ACO）基因家族进行鉴定,并对二氯喹啉酸药害条件下的基因表达模式进行分析。结果表明:普通烟草、林烟草、绒毛状烟草分别含有19、9和10个ACO基因。亚细胞定位预测分析显示,几乎所有蛋白均定位于细胞质中。进化分析表明,烟草ACO蛋白家族进化形成三类,Ⅰ类成员最多,Ⅱ类成员最少。MicroRNA靶点分析发现,普通烟草6个ACO含有潜在的miRNA靶点。启动子分析表明,普通烟草ACO启动子区含有激素反应、低温反应、抗性和胁迫反应等多种类型的顺式作用元件。二氯喹啉酸处理下的基因表达分析显示,普通烟草ACO家族所有成员均受二氯喹啉酸诱导上调表达,Ntab0263610、Ntab0263620、Ntab0220530和Ntab0220520 4个基因的上调幅度最大,推测这些基因在烟草二氯喹啉酸药害引起的乙烯合成中发挥关键作用。      

2,4-表油菜素内酯对烟苗幼茎生长及相关基因表达的影响

为研究油菜素内酯（Brassinolide,BR）对烟草主茎生长的影响,利用外源2,4-表油菜素内酯（2,4-Epibrassinolide,EBR）,设置0.5×10^-7 mol/L（T1）、0.5×10^-5mol/L（T2）两个浓度,以蒸馏水（CK）为对照对烟草幼苗进行喷施。分析了不同处理的烟草幼苗株高,节距及解剖结构特征,检测了茎中与细胞分裂和细胞大小调控相关基因以及与油菜素内酯（BR）、生长素（IAA）和赤霉素（GA）合成相关基因的表达量。结果表明,喷施EBR对烟草幼苗节距和株高有显著促进作用,并随处理浓度升高,促进作用增强。观察石蜡切片发现EBR处理后茎皮层薄壁细胞数目增多,单细胞面积减小。EBR处理后,细胞周期调控基因NtCYCD3表达上调,细胞大小调控基因NtARF6、NtARF16表达下调;BR信号受体基因NtBRI1,NtBIN2表达上调,BR转录因子NtBES1T表达下调;BR、IAA和GA的关键生物合成基因NtDWF4、NtYUCCA8、NtGA3ox-2表达量均上调。说明喷施EBR可促进内源BR、IAA和GA的合成基因表达,通过促进节间细胞分裂、抑制细胞大小促进烟草幼苗茎的生长。     

普通烟草WOX转录因子家族的全基因组鉴定及分析

  背景  WOX（WUSCHEL-related homeobox）转录因子家族是植物特有的一类转录因子家族,被报道参与生长发育、细胞间通讯、干细胞分裂分化稳态调控和器官发育等过程。  方法  利用比较基因组学和生物信息学的方法,在烟草基因组中对WOX转录因子成员进行鉴定,并进行进化分析、共线性分析、保守基序分析以及表达模式等分析。  结果  （1）从烟草基因组中鉴定出23个WOX转录因子家族成员编码基因,其中15个NtWOX基因定位到染色体上;（2）系统发育分析表明,普通烟草和拟南芥的WOX转录因子被分成了3个亚支和9个亚家族;（3）共线性分析发现若干普通烟草NtWOX基因存在于普通烟草与拟南芥基因组的共线性区段中;（4）复制事件分析表明串联重复或者全基因组重复事件在普通烟草WOX家族扩张中起重要作用;（5）保守基序分析表明同一亚家族内NtWOX成员的保守基序的组织形式高度相似;（6）表达分析表明普通烟草NtWOX基因表达具有组织特异性;（7）GO注释分析发现普通烟草NtWOX转录因子参与组织器官发育、细胞间通讯过程和胁迫响应等生物学过程。  结论  本研究在普通烟草中鉴定并系统分析了WOX转录因子家族成员,为其功能研究奠定基础。      

烟草OSCA基因家族鉴定及非生物胁迫诱导表达模式分析

高渗门控钙渗透通道(OSCA,hyperosmolal-gatedcalcium-permeable channel)是一种Ca²⁺非选择性阳离子通道,OSCA家族含有钙依赖性通道DUF221结构域。为了进一步了解烟草OSCA基因家族特征和功能,本研究从栽培烟草K326基因组中鉴定到23个OSCA家族基因,并对NtOSCA家族系统进化关系、基因结构与蛋白结构域、启动子、不同组织器官及干旱和盐胁迫下表达模式进行分析。根据进化关系,NtOSCA基因家族被分为4个亚家族,并且同一亚家族成员间蛋白及基因结构相似。启动子分析结果表明,NtOSCA家族基因启动子中存在着多种不同的胁迫响应元件,其中干旱响应元件和脱落酸响应元件较多。进一步组织表达分析结果表明,NtOSCA基因家族成员在不同组织的表达量不同。干旱和盐胁迫表达模式分析表明,20个NtOSCA基因在干旱胁迫下表达量上调,15个NtOSCA基因在盐胁迫下表达量上调。这说明OSCA基因家族在烟草抗旱和抗盐胁迫中具有重要作用。     

烟草DGAT基因家族全基因组鉴定与分析

二酰甘油酰基转移酶（DGAT）是三酰甘油合成的关键酶和唯一限速酶。在烟草中鉴定DGAT基因对于研究油脂代谢途径和创造具有附加值的新型油料作物具有重要意义。本研究从烟草基因组鉴定DGAT家族基因,并对序列特性、基因结构、亚细胞定位、进化模式、表达模式等进行分析。结果表明,共获得25个烟草DGAT家族蛋白,其平均氨基酸长度为485,大部分为碱性蛋白和亲水性蛋白,有13个DGAT蛋白定位到8条连锁群上;有16个蛋白定位到内质网,6个定位叶绿体,3个定位到胞外;烟草DGAT蛋白包含典型的WS_DGAT结构域和LPLAT结构域;系统发育树将DGAT家族分为DGAT1、DGAT2、DGAT3和WSD等4个类群,但烟草DGAT仅划分到DGAT2和WSD两个类群;不同烟草DGAT基因的时空表达特性有所差异,并表现出一定的组织特异性,主要集中在衰老叶片和花器官中大量表达。     

普通烟草NtNAC042基因克隆、鉴定及功能分析

  背景和目的  NAC转录因子是一类植物特有的转录因子,在植物生长发育、生物/非生物胁迫中发挥着十分重要的调控作用,在普通烟草中克隆NtNAC042基因。  方法  进行生物信息学分析、亚细胞定位、转录激活试验和表达模式分析,以及基因功能分析。  结果  （1）生物信息学分析表明,NtNAC042基因编码蛋白具有高度保守的NAC结构域;（2）亚细胞定位和转录激活试验结果表明,NtNAC042定位于细胞核中,具有转录激活活性;（3）表达模式分析表明,NtNAC042基因在根和衰老叶片中表达量较高且受干旱胁迫、盐胁迫、H₂O₂处理诱导;（4）NtNAC042过表达烟草植株抗盐性显著提高。  结论  NtNAC042作为NAC型转录因子,在烟草衰老落黄及生物和非生物逆境应答中发挥着重要的调控作用。      

烟草CYP71D亚家族的生物信息学分析

细胞色素P450（CYP450）是一类超基因家族编码的多功能氧化酶,在生物合成、代谢解毒及植物防御方面具有重要作用。其中CYP71D属于CYP450的一个亚家族,主要在次生代谢物合成和病虫害防御方面起作用。为了更好地了解烟草CYP71D亚家族基因特征和功能,本研究利用生物信息学分析手段及烟草转录组数据,对CYP71D亚家族基因的结构和表达等进行了分析。结果发现,在烟草中共有42个CYP71D亚家族成员,各成员在染色体上并非均匀分布,其氨基酸长度和等电点差异较大,但基因结构、保守结构域数目和分布高度一致;二级结构分析表明,烟草CYP71D亚家族成员具备P450蛋白特征结构域;基因表达模式分析显示,多数CYP71D基因在根、叶、花中特异表达,大部分基因参与了IAA激素、黑胫病、温度等逆境胁迫反应。这为烟草CYP71D亚家族基因功能的深入研究及烟草抗逆品种的培育奠定了基础。     

过表达烟草NtabKNOX8导致烟叶发育异常

为探究KNOX（KNOTTED1-like homeobox）家族基因在烟草叶片发育中的功能,从普通烟草（Nicotiana tobacum）红花大金元中克隆获得KNOX家族基因NtabKNOX8,对其进行了生物信息学分析,并通过转基因技术获得了NtabKNOX8过表达材料,对转生长素报告基因DR5：：GUS材料与NtabKNOX8过表达材料的杂交F1代叶片进行了GUS染色。结果表明,NtabKNOX8属于KNOX基因家族亚家族Ⅰ;过表达NtabKNOX8导致叶片变宽圆,对称性丧失,叶面皱缩并向叶背面弯曲,主脉明显缩短且脉序发生明显改变,类似掌状网脉,叶形指数变小,叶面积减小,比叶鲜重增大;NtabKNOX8过量表达的烟叶中生长素含量明显增加,且分布更加广泛。推测NtabKNOX8可能通过影响生长素的含量及分布,影响叶片生长发育过程,从而导致了烟叶形态的多重变化。     

烟草DGAT3基因响应冷胁迫应答的功能研究

二脂酰甘油酰基转移酶（Diacylglycerol acyltransferase,DGAT）是催化三脂酰甘油（TAG）合成途径的关键酶,在植物生长发育和逆境胁迫响应中具有重要的作用。本研究从普通烟草品种K326中克隆得到NtDGAT3基因,利用荧光定量PCR技术分析不同组织中和低温胁迫下NtDGAT3的表达规律。同时,利用CRISPR/Cas9技术制作NtDGAT3敲除植株,对其耐冷性进行了分析。结果表明,NtDGAT3在烟草根、茎、叶中均有表达,且叶部表达量最高;NtDGAT3受冷胁迫强烈诱导,说明该基因可能对冷胁迫有响应。低温处理试验结果表明,敲除突变体ntdgat3对冷敏感,突变体叶片离子渗漏率及丙二醛含量的变化幅度显著高于野生型烟草;在ntdgat3中,膜脂代谢关键基因PLDα1的表达水平显著高于野生型烟草,而PLDδ的表达水平显著低于野生型烟草。以上结果表明,NtDGAT3基因通过PLDα1和PLDδ的表达参与调节植物低温响应。