基于支持向量机的重组大肠杆菌产脂肪酶MAS1的发酵建模与优化

该研究以来源于海洋放线菌（Streptomyces sp.）W007脂肪酶MAS1为研究对象,将其在大肠杆菌BL21（DE3）中表达并优化了发酵条件。首先,通过单因素实验确定重组大肠杆菌表达脂肪酶的最佳诱导时间为对数生长后期,最佳异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）浓度为0.6 mmol/L,最佳诱导pH值为6.5,最佳诱导温度为20 ℃。然后,用R语言rsm包设计Box-Behnken试验,并在7 L发酵罐中进行发酵试验以得到Box-Behnken实验数据。最后,通过支持向量机（Support Vector Machines,SVM）-遗传算法（Genetic Algorithm,GA）计算得到重组大肠杆菌BL21（DE3）表达脂肪酶MAS1的最优发酵条件：IPTG浓度为0.65 mmol/L、诱导温度23 ℃、诱导pH值为6.7时,理论脂肪酶MAS1酶活力为2 276.99 U/mL。在7 L发酵罐中,使用优化后的发酵条件进行重组大肠杆菌BL21（DE3）培养时,得到最大脂肪酶MAS1酶活力为2 316.02 U/mL,比未优化之前（1 733.33 U/mL）提高了33.61%。上述结果表明SVM-GA在重组大肠杆菌发酵条件优化方面具有较好的性能,为脂肪酶MAS1的高效制备提供了一定的研究依据。     

基于人工神经网络和遗传算法的普鲁兰酶重组大肠杆菌高密度发酵工艺优化

基于人工神经网络和遗传算法,对重组大肠杆菌（Escherichia coli）BL 21表达热稳定普鲁兰酶的高密度发酵工艺进行优化。在5 L的发酵罐中,通过比较不同发酵温度、pH值及培养基碳氮比（C/N,mol/mol）对细胞量和产物产量的影响,确定最佳发酵工艺。结果表明,诱导前适合细胞生长的发酵条件为发酵温度34.4 ℃、pH 6.87、培养基C/N 6.1;诱导后适合产物表达的发酵条件为发酵温度32.5 ℃、pH 6.69、培养基C/N 5.3,最终获得细胞质量浓度56.5 g/L,重组蛋白产量3.21 g/L,酶活力为268.3 U/mL。     

重组大肠杆菌产卤代烷脱卤酶的发酵条件优化

对产卤代烷脱卤酶的重组大肠杆菌BL21（DE3）/pET28a-DhaA进行发酵优化以提高其表达量。该研究从TB培养基出发,通过单因素实验与响应面实验在摇瓶水平上对培养基各成分进行优化;其次,在最优培养基的基础上对发酵的工艺条件进行优化;最后,在5 L发酵罐中进行了初步放大验证。结果表明,最优的培养基组成为：甘油10 g/L,酵母粉23 g/L,蛋白胨14 g/L,MgSO₄·7H₂O 1.3 g/L,ZnSO₄·7H₂O 0.1 g/L,酶活力可达到（1 182.94±10.86） U/L,较初始培养基提高了94%;最优的发酵工艺条件为：接种量5%,装液量40 mL/250 mL,37℃培养至OD₆₀₀为1.8时加入终浓度为0.4 mmol/L的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷于20℃诱导22 h,酶活力可达到（3 585.83±15.02） U/L,提高至未进行优化前的5.87倍;5 L发酵罐初步放大验证实验中,酶活力最高达到（9 682.62±191.16） U/L,提高至摇...     

乳糖诱导基因工程菌产β-葡聚糖酶及其酶学特性的研究

考察了乳糖替代IPTG诱导重组大肠杆菌产β-葡聚糖酶的可行性,分别对乳糖作为诱导剂时的终浓度、诱导时机、诱导时间和温度等方面进行了研究。结果表明,工程菌培养6h（OD600达到0.7左右）后,加入终浓度为10mmol/L的α-乳糖,升温至41℃,诱导6h,酶活可达到830.7U/mL。与IPTG相比,酶活提高2倍左右,发酵周期缩短70%。该酶pH稳定范围较宽,热稳定性良好,在生理温度（70℃左右）下活性高,说明乳糖可以作为基因工程菌的高效诱导剂。     

表达金丝桃素合成酶的基因工程菌发酵工艺研究

采用摇瓶发酵试验，分别对影响工程菌生长和表达的条件：培养基初始pH值、诱导温度、诱导时间、诱导物浓度等进行了考察，优化了重组大肠杆菌的发酵条件，确定了周期短、产率高且稳定可靠的发酵工艺，即工程菌在pH值为7．4、温度为25℃、IPTG（异丙基硫代-D-半乳糖）浓度为0．8mmol／L时蛋白表达量最高。     

重组亚胺还原酶工程菌快速高密度发酵研究

通过快速高密度发酵培养,以重组亚胺还原酶大肠杆菌工程菌的菌体生物量及酶活力作为评价标准,利用低成本的发酵培养基,在短时间内获得菌体的最大生物量和最佳酶活力。采用2 L发酵体系,对该工程菌的接种量和诱导条件进行优化。结果表明,该菌株的快速高密度发酵最佳接种量为10%,当生物量OD₆₀₀值达到12时,发酵体系降温至20℃,加入0.4 mmol/L异丙基-β-D-硫代半乳糖苷,为最佳诱导条件,并以此条件进行20 L快速高密度发酵,诱导12 h酶活力最高,为4.56 U/g。该研究为进一步放大发酵体系以实现亚胺还原酶工业化快速高产量制备的生产奠定基础。     

草鱼皮胶原的体外自组装动力学研究

体外自组装是天然胶原的重要分子行为特征之一,并对胶原基产品性能产生显著影响。以草鱼皮酶溶性胶原蛋白为研究对象,重点开展胶原体外自组装动力学行为、影响因素、组装纤维的微观结构及其热稳定性能研究。浊度实验和自组装程度分析的结果表明,草鱼皮胶原蛋白具备体外自组装能力,其自组装进程受胶原质量浓度、pH值、离子强度、温度等因素的影响。在pH 7～8、胶原质量浓度3～5 mg/mL、体系温度25～30 ℃以及NaCl浓度0～200 mmol/L条件下胶原自组装进程较快、自组装程度较高;组装动力学分析的结果表明,在较高的离子强度（NaCl浓度300 mmol/L）和较低的组装温度（20 ℃）时,胶原组装进程表现为：成核、组装和平衡3 个阶段,而在较高组装温度（25～30 ℃）和较低离子强度时（NaCl浓度0～200 mmol/L）,胶原组装进程表现为：快速组装段、低速组装段和平衡段;胶原纤维形态学观察结果表明,草鱼皮胶原组装纤维具有典型的D周期特征但D周期长度值（64.6 nm）小于哺乳动物胶原纤维（约67 nm）;示差扫描量热法（differential scanning calorimetry,DSC）分析结果表明,经纤维重组后,草鱼皮胶原蛋白的热稳定性得到明显提升。     

D-甘露糖异构酶的酶学性质探究和热稳定性改造

D-甘露糖异构酶可以催化D-果糖与D-甘露糖之间的相互转化，在D-甘露糖的生物酶法制备中具有应用前景，但是目前报道的D-甘露糖异构酶热稳定性较差，无法满足工业生产高温的需求。该研究将大肠杆菌(Escherichia coli) Dh5α来源的D-甘露糖异构酶异源表达后进行酶学性质研究，并对其进行热稳定性改造。研究结果显示D-甘露糖异构酶的最适反应温度为30℃,最适反应pH值为6.0～7.0,K_m、k_cat和k_cat/K_m分别为963.4 mmol/L、1.38 s^-1、1.4×10^-3 L/(mmol·s)。通过理性改造该研究获得了一株热稳定性显著提高的突变体A241P/A116V/G253A/Q379P,其最适反应温度提高了15℃,在50℃条件下，半衰期为野生型的33倍，相对酶活力比野生型高60%。分子动力学模拟分析表明脯氨酸的引入和疏水作用的增强，提高了蛋白质的刚性，从而使热稳定性提高。该研究通过对主流来源的D-甘露糖异构酶进行酶学性质探究及热稳定性改...     

基于主成分分析法构建高蛋白重组米品质评价体系

为探究高蛋白重组米品质指标间相互关系,以碎米与16种常见蛋白粉为原料通过挤压分别制备16种高蛋白重组米,测定高蛋白重组米质构特性、蒸煮特性、糊化度、水溶性指数、吸水性指数、膨化度,并运用主成分分析法计算不同高蛋白重组米的综合得分,通过逐步回归对高蛋白重组米品质的评价指标进行筛选,构建其综合评价体系。结果表明,不同蛋白制备的高蛋白重组米蒸煮品质指标以及质构品质指标差异较大。主成分分析提取的3个主成分累计贡献率达到了85.148%,分别是59.4725%（X₁）、17.527%（X₂）、8.149%（X₃）,其中,胶粘性、米汤干物质、硬度、吸水性指数、咀嚼性、内聚性、糊化度、回复性、大米吸水率对第一主成分起主要作用;弹性、膨化度和碘蓝值对第二主成分起主要作用;水溶性指数是第三主成分的重要指标。以主成分分析得到的各高蛋白重组米综合得分为因变量（F值）,以参加主成分分析的各指标值为自变量,通过逐步回归分析法建立高蛋白重组米综合品质评价的理论模型:Y=0.915X_胶粘性+0.208X_糊化度?0.475X_{米汤干物质}+0.436X_回复性。该模型得出高蛋白重组米的质量最优为大米蛋白重组米,其次为大豆分离蛋白重组米,与主成分综合得分呈极显著正相关（P<0.01）,进一步证实该模型具有很高的可靠性。     

枯草芽孢杆菌胺氧化酶基因的克隆与表达

以细菌型豆豉工业发酵菌种枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）BJ3-2为材料,根据NCBI中菌株B. subtilis 168的胺氧化酶（AMO）基因序列设计同源引物,克隆获得菌株B. subtilis BJ3-2的胺氧化酶基因YobN序列。测序结果显示,YobN基因开放阅读框（ORF）长为1 437 bp,编码478个氨基酸,分子质量为53.79 ku,与菌株B. subtilis 168同源性达98%。目的基因克隆至原核表达载体,获得重组菌pET28a-YobN/BL21,十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）结果显示,浓度为1.0 mmol/L的异丙基硫代半乳糖苷（IPTG）22 ℃诱导5 h,表达量最高达1.30 mg/mL。该研究为AMO活性的研究奠定了基础,对豆类发酵食品中生物胺的控制具有重要意义。     

不同贮藏温度下两种发酵香肠品质变化及货架期预测模型的建立

对玫瑰低硝半干发酵肠（M）和传统半干发酵肠（P）在3个温度（4、25、35 ℃）贮藏过程中的品质变化进行了评价,并运用动力学和Arrhenius方程建立了两种发酵肠货架期预测模型。研究表明,温度对两组香肠的红度值和质构特性影响较大,在贮藏期间,各贮藏温度下的酸价、挥发性盐基氮（total volatile basic nitrogen,TVB-N）值和菌落总数( total viable count,TVC)随贮藏时间推移而升高,且温度越高变化越快;以TVB-N值和TVC为关键因子建立动力学模型,并结合Arrhenius方程构建两种发酵肠的货架期预测模型,P发酵肠的TVB-N值和TVC预测模型中活化能E_a分别为52.37 kJ/mol和43.39 kJ/mol,指前因子k₀分别为69859734.72、8806494.34;M发酵肠的TVB-N值和TVC预测模型中活化能E_a分别为46.46 kJ/mol和43.53 kJ/mol,指前因子K₀分别为5373553.61和8016399.99。选取4、30 ℃验证模型可靠性,两种发酵肠货架期理论值与实测值的相对误差在11.18%以内,可准确预测4～35 ℃范围内的货架期。此外,在不同贮藏温度下M发酵肠的品质均优于P发酵肠,并具有较长的保质期限。     

重组大肠杆菌生产TaqDNA聚合酶发酵工艺优化

Taq DNA聚合酶是PCR技术中广泛应用的耐热酶。为提高重组大肠杆菌生产Taq DNA聚合酶的产量，以Taq DNA聚合酶产量和酶的比活力为考察指标，通过单因素实验优化产生Taq DNA聚合酶含量的单因素：发酵温度、pH值、IPTG诱导剂用量、诱导时间、接种量，结果表明：发酵温度、pH值、IPTG诱导剂浓度，对该基因工程菌发酵产Taq DNA聚合酶的比酶活力有显著影响，而诱导培养时间、接种量对产Taq DNA聚合酶的比酶活力影响不显著。故选择发酵温度、pH值、IPTG诱导剂浓度作为响应面的三个因素优化重组大肠杆菌生产Taq DNA聚合酶发酵工艺，响应面分析结果显示对酶的比活力显著性顺序为：IPTG诱导剂浓度>发酵温度>pH值，最佳发酵工艺参数为：发酵温度37.2℃，pH值为7.5,IPTG诱导剂浓度为0.800 mmol/L，在此条件下发酵，Taq DNA聚合酶比活力达到（43.822±0.878）kU/mg。     

细胞穿膜肽与人表皮生长因子在大肠杆菌中的重组融合表达

该研究构建了细胞穿膜肽Pep-1和人表皮生长因子hEGF融合基因（epEGF）的重组表达质粒PGEX-4T-1-epEGF,并成功转化大肠杆菌BL21（DE3）得到重组大肠杆菌株BL21（DE3）/PGEX-4T1-epEGF。通过IPTG诱导发酵,制备重组融合人表皮生长因子蛋白,并初步尝试建立纯化研究,有效实现了人表皮生长因子（hEGF）在大肠杆菌中的可溶性表达。该研究通过发酵条件优化,发现发酵过程中温度、诱导剂浓度、诱导时间、培养基都是影响蛋白表达量的关键因素;温度在20 ℃、IPTG浓度0.4 mmol/L、诱导时间8 h、培养基为TB液体培养基,目的蛋白占总蛋白的量达到21.58%,蛋白浓度为0.13 mg/mL。菌体破碎液上清经过GST亲和层析融合蛋白纯度达到66.82%,阴离子交换层析后融合蛋白纯度达到92.57%。该研究成功在大肠杆菌中表达出可溶形式的hEGF,且纯化工艺较简单,为hEGF的进一步开发利用提供了参考。     

玉米芯半纤维素提取、乙酰化改性及结构表征

以玉米芯为原料提取半纤维素,并对所提取的玉米芯半纤维素进行乙酰化改性。采用超声辅助碱法提取玉米芯半纤维素,浓硫酸（H₂SO₄）和单质碘（I₂）共催化玉米芯半纤维素进行乙酰化改性;采用红外光谱（IR）、热重分析（TGA）和核磁共振光谱（NMR）对玉米芯半纤维素及其乙酰化产物进行表征。玉米芯半纤维素得率和提取率分别为33.7%和81.0%,其中半纤维素含量为85.3wt%,乙酰化产物产率和取代度（DS）分别为84.6%和1.27。超声辅助有效缩短了碱法提取玉米芯半纤维素的时间,且玉米芯半纤维素得率和提取率均得到提高。H₂SO₄和I₂是半纤维素乙酰化改性的高效共催化体系,IR和NMR结果表明半纤维素被成功改性,改性产物中存在乙酰基,TGA分析表明乙酰化产物热稳定性增加,且DS值适中,有望进一步用于制备可生物降解的食品包装材料。     

纳米二氧化铈的制备及其过氧化物酶活性的分析

为制备具有催化活性的过氧化物模拟酶,本文以CeO₂为研究对象,采用水热法制备具有过氧化物酶活性的纳米二氧化铈（Nano ceria,CeO₂）颗粒。通过四甲基联苯胺（Tetramethylbenzidine,TMB）显色反应研究水热合成的制备条件,包括:料液比、反应温度、反应时间对纳米CeO₂催化过氧化氢性能的影响,筛选出一种催化活性最优纳米CeO₂,并对其进行结构表征及催化反应稳态动力学研究。结果表明:当料液比为1:60 g/mL、反应温度为80 ℃、反应时间为8 h时,吸光度值最大,为0.501,水热法制备的纳米CeO₂催化性能最佳,此方式合成的纳米CeO₂晶体呈萤石型结构,催化反应与米氏方程吻合,对H₂O₂的K_m值为0.021 mmol/L。结果表明,上述方式合成的CeO₂反应条件简单纯度优异,对H₂O₂催化性能较好。     

响应面法优化植物乳杆菌LPL-1产细菌素发酵条件及细菌素理化性质分析

为提高新型植物乳杆菌LPL-1所产细菌素（植物乳杆菌素LPL-1）的产量,以单核细胞性李斯特菌为指示菌,相对抑菌效价为响应值,通过响应面法对发酵条件进行优化,确定了最优发酵条件。利用单因素试验与Plackett-Burman试验,确定主要影响因素为温度、发酵时间与初始pH值,通过最陡爬坡试验与Box-Behnken响应面试验,确定最优发酵条件为发酵温度31?℃、培养基初始pH?6.40、发酵时间32?h、接种量0.5%、装液量60%,在此条件下细菌素效价（674.29?AU/mL）比优化前（292.02?AU/mL）提高了1.31倍。通过对细菌素理化性质的分析,证明了细菌素具有热稳定性（100?℃,30?min）、酸碱稳定性（pH?2～10）、蛋白酶敏感性与抑菌性,同时利用二硫键变性剂对细菌素结构中的二硫键进行变性处理,证明二硫键对其抑菌特性的重要性。因此,通过细菌素发酵条件的优化与理化性质的分析,为菌种与细菌素的产业化生产与应用提供了理论支持。     

表达磷脂酰丝氨酸合成酶基因工程菌发酵条件的研究

研究表达磷脂酰丝氨酸合成酶基因工程菌的发酵条件.利用250mL三角瓶发酵,对携带磷脂酰丝氨酸合成酶基因重组质粒的工程菌进行诱导表达,研究培养基的pH值、装液量、转速、诱导时菌体浓度、诱导剂浓度、诱导时间和温度对磷脂酰丝氨酸合成酶酶活的影响.确定工程菌的最佳发酵条件为:培养基pH值为7.5,装液量为40mL,转速为200 r/min,诱导时菌体浓度为A600≈0.4,诱导剂蔗糖的终浓度为60 mmol/L,诱导时间为27h,诱导温度为37℃.在最佳发酵条件下,酶活可达2.56U/mL,是优化前的1.72倍,为中试放大提供了理论依据.     

辣木叶茶4种发酵方式不同发酵阶段化学成分与品质变化及其相关性分析

采用自然发酵、酵母发酵、根霉发酵与黑曲霉发酵四种方式发酵自制辣木叶茶,研究了其不同发酵阶段样的色泽指标、感官品质与化学成分变化,并分析它们之间的相关性。结果表明:随着发酵时间的延长,四种方式辣木叶茶发酵样的化学成分与品质发生了明显的变化,发酵16 d后,其感官品质有所提升,辣木可溶性蛋白、咖啡碱含量有所升高,多酚、黄酮、多糖及水浸出物含量有所下降,评价茶汤色泽的△E*值、a*值、b*值指标随翻堆次数的增加而有所升高。其中辣木叶茶黑曲霉发酵效果较好,其发酵16 d的四翻样感官品质最好,其多酚、黄酮、可溶性蛋白、多糖、咖啡碱、水浸出物含量分别为13.48、10.99、16.46、27.38、2.39与342.70 mg/g,茶汤色泽指标a*值、b*值、△E*值分别为15.66、28.48与36.42。辣木叶茶不同发酵阶段样的水浸出物（Y）含量与多酚（X₁）、可溶性蛋白（X₃）与多糖（X₄）的含量呈极显著正相关,相关系数分别为0.8821、0.7598与0.7240,它们之间的线性回归方程为Y=15.8337+0.6793X₁+0.2360X₃+0.0897X₄。研究结果为辣木叶发酵茶产品开发及这一资源的开发利用提供一定的实践和数据参考。     

二氧化硅包覆银铜纳米颗粒的结构及其抗菌性能

为研究双金属纳米颗粒间协同抗菌作用及防止金属纳米颗粒团聚,利用气溶胶一步法制备了“火龙果”型高负载量(50%)二氧化硅包覆银铜双金属纳米颗粒抗菌剂Ag-Cu/SiO₂。借助X射线衍射仪、透射电子显微镜、电子能谱仪对Ag-Cu/SiO₂的结构进行研究,并测试该材料对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的最低抑菌浓度(MIC)及细菌的时间与杀菌曲线,研究了2种细菌胞内活性氧的生成情况。结果表明:银铜双金属纳米颗粒均匀分散在球型二氧化硅内部,呈现“火龙果”型结构;与Cu/SiO₂和Ag/SiO₂相比,相同负载量(50%)的Ag-Cu/SiO₂有更好的抗菌效果,对2种细菌的MIC值均为2 μg/mL,在24 h内可以充分抑制细菌生长;Ag-Cu/SiO₂生成活性氧的水平明显高于单金属纳米颗粒,致使细菌死亡,从而说明双金属纳米颗粒具有协同抗菌作用。     

重组角质酶的制备及合成乙酸乙酯条件优化

为了实现镰孢菌角质酶的高效表达,对重组菌株P. pastoris KM71/pPIC9K-ScCuA在3 L发酵罐进行了发酵工艺优化,获得的最优发酵条件为:诱导温度28℃,初始诱导菌浓OD600为100,诱导阶段甲醇体积分数为1%条件下进行诱导产酶。在该条件下发酵138 h时上清酶活可达到最大值419 U/mL,是优化前的2倍。对重组角质酶在有机溶剂中合成乙酸乙酯的酯化条件进行了优化,结果表明,当底物乙酸浓度为0.1 mol/L,乙醇浓度为0.15 mol/L,温度50℃,在异辛烷中反应16 h,乙酸乙酯可以达到最大转化率94.12%。