基于ITS和IGS1序列分析对云南牛肝菌的分类鉴定

以采自云南地区的5个牛肝菌(Boletus sp.)样品为材料,根据样品的形态特征,并结合r DNA ITS和IGS1序列分析对5个样品进行分类鉴定,通过与Gen Bank上已登录的牛肝菌序列比对,采用邻接法(neighbor-joining,N-J)构建系统发育树。结果表明,所有供试材料的ITS和IGS1全长分别在739~787bp和537~583bp范围内,GC含量分别在48.31%~51.01%和48.42%~52.89%之间,遗传距离在0.017~0.248和0.002~0.225之间,上述数据表明云南5个牛肝菌样品之间存在一定的遗传差异。5个牛肝菌样品的ITS和IGS1序列聚类分析均表明,供试样品被分为两大类,其中样品YX1-2和QJ3-4聚为一个类群,样品CX2-10、QJ3-5和YX1-3聚为另一个大的类群,两种分析手段相互印证,且ITS序列聚类分析能将云南不同地点的牛肝菌鉴定到属甚至种的水平,上述分析结果表明ITS和IGS1序列分析相结合可作为牛肝菌亲缘关系鉴定的有效分子标记方法。     

麻花秦艽不同组织部位可培养内生菌群结构及其与龙胆苦苷含量的相关性

为了明确四川麻花秦艽(Gentiana straminea Maxim)内生菌的资源状况,本实验采用稀释涂布法并结合形态学观察及16S rDNA和ITS-rDNA序列分析的方法,对其根、茎、叶和花中的内生菌进行了分离、纯化和鉴定;并采用高效液相色谱法(HPLC)检测了不同组织部位龙胆苦苷的含量,分析了麻花秦艽可培养内生菌数量与龙胆苦苷含量的相关性。结果表明,麻花秦艽不同组织部位可培养内生菌数量和菌群结构存在一定的差异。其中,从根中得到的可培养内生细菌和真菌的数量均最高,分别为(8.77±0.71)×10~5cfu/g和(2.00±1.05)×10~4cfu/g。统计分析显示,麻花秦艽内生细菌和内生真菌的数量分别与其龙胆苦苷的含量成极显著正相关(P0.01)。从麻花秦艽中共分离得到13株内生菌,归属为3门6纲8目9科10属,其中细菌10株,真菌3株。其中的优势菌株,包括细菌QJ2(Duganella sp.)、QJ6(Rahnella sp.)、QJ10(Pseudomonas sp.)及真菌QJ11(Aspergillus sp.)和QJ13(Aspergillus sp.),其数量均分别与龙胆苦苷的含量成极显著正相关(P0.01)。麻花秦艽内生菌具有较丰富的遗传多样性,不同组织部位麻花秦艽内生菌、种类及分布存在差异,并与其有效成分龙胆苦苷存在极显著正相关性。     

野生牛肝菌内生真菌分离鉴定及其生物学特性

采用组织分离法从黄皮疣柄牛肝菌、小美牛肝菌、双色牛肝菌的子实体中,分离纯化获得4株内生真菌,经菌落、菌丝、孢子形态学观察及rDNA ITS分子生物学鉴定,结果显示:菌株LCTG-12为盖姆斯木霉(Trichoderma gamsii)、LCCK-6为克鲁伊假丝酵母(Candida kruisii)、BSHC-18为黄瘤孢菌(Hypomyces chrysospermus)、BBFO-10为尖孢镰刀菌(Fusarium oxysprum)。对4株内生真菌生物学特性进行研究,其中盖姆斯木霉菌丝生长速度较快,在CPDA培养基上,25 ℃培养5 d菌丝长满平板;液态培养时,该菌株在25 ℃、摇床转速160 r/min、pH5.5、8 d,可获得菌丝干基生物量4.13 g/L。平板对峙实验结果:盖姆斯木霉LCTG-12对黄瘤孢菌BSHC-18和尖孢镰刀菌BBFO-10菌丝生长均有拮抗作用,并且,黄瘤孢菌BSHC-18和尖孢镰刀菌BBFO-10两者之间也具有拮抗作用,表明牛肝菌内生真菌中盖姆斯木霉对腐败菌具有拮抗作用,可为生物防腐提供优良的菌株。     

西沙野生诺尼叶片内生菌的分离与初步鉴定

主要研究西沙群岛野生诺尼叶片中可培养内生菌的多样性。利用常规平板分离方法进行菌株分离。通过测定真菌核糖体基因翻译间隔序列(ITS序列)和细菌16S r DNA基因序列,结合系统发育研究对所分离菌株进行鉴定分析。共分离到32株内生菌,分为19种。其中2种霉菌,共2株,分别属于炭层菌属(Nemania sp.)和毛壳菌属(Chaetomium sp.);细菌17种,共30株,分别属于芽孢杆菌属(Bacillus sp.)、赖氨酸芽孢杆菌属(Lysinibacillus sp.)、微球菌属(Micrococcus sp.)、土地芽孢杆菌属(Terribacillus sp.)、肠杆菌属(Enterobacter sp.)、黄单胞菌属(Xanthomonas sp.)、黄杆菌属(Flavobacterium sp.)等7个已知属,其中芽孢杆菌属(Bacillus sp.)为绝对优势属,共20株,11种。     

粗柄羊肚菌内生真菌多样性研究

分离了不同发生地粗柄羊肚菌的内生真菌,并采用常规形态学技术结合ITS序列分析进行了鉴定.结果表明内生真菌具有多样性:从3个发生地采集的羊肚菌子实体中,共分离出属于14个分类单元的16个内生真菌菌株,其中15个菌株为子囊菌或其无性型,仅1个菌株(高山被孢霉)属于接合菌门.毛壳菌为3个发生地共有的内生真菌,Lecanicillium fungicola var.aleophilum仅在四川绵阳和河南郑州采集的羊肚菌子实体中分离到,其他内生真菌均为发生地特异性种类.     

西沙野生诺尼果内生菌的分离与鉴定

采用传统微生物学分离培养方法对我国海南西沙野生诺尼果内生菌进行分离与鉴定研究。计数结果显示,成熟野生诺尼果内生菌菌落总数达1.0×105CFU/g,其中真菌总数为8.0×103CFU/g。进一步在25²8℃下分离得到22株细菌、14株酵母菌和9株霉菌,分别采用16S rDNA、26S rDNA D1/D2区和ITS rDNA序列进行扩增和系统发育分析。结果表明,(1)22株内生细菌分属于α变形菌纲(α-Proteobacteria)、β变形菌纲(β-Proteobacteria)、γ变形菌纲(γ-Proteobacteria)、厚壁菌门(Firmicutes)和放线菌门(Actinobacteria)5个类群,包括亚西亚菌属(Asaia sp.)、黄杆菌属(Flavobacterium sp.)、伯克霍尔德氏菌属(Burkholderia sp.)、泛菌属(Pantoea sp.)、根瘤菌属(Rhizobium sp.)、类芽孢杆菌属(Paenibacillus sp.)、短小杆菌属(Curtobacterium sp.)、藤黄色杆菌属(Luteibacter sp.)8个属的10个已知种;(2)14株酵母分属于担子菌门(Basidiomycota)和子囊菌门(Ascomycota),包括隐球酵母菌属(Cryptococcus sp.)、Pseudozyma sp.、Sympodiomycopsis sp.和假囊酵母属(Eremothecium sp.)4个属的5个种;(3)9株霉菌均属于子囊菌门(Ascomycota),包括枝孢属(Cladosporium sp.)、轮层炭菌属(Daldinia sp.)、赤霉菌属(Gibberella sp.)、Nemania sp.和青霉属(Penicillium sp.)5个属的5个种。     

竹叶兰内生真菌的分离鉴定及其抗氧化活性研究

本文采用经典的植物内生菌分离方法,从两种不同产地的竹叶兰植株的根、茎及叶片部位中共分离出16株可培养的内生真菌,其中4种真菌分离自云南省西双版纳地区的竹叶兰,12种真菌分离自广西省百色市的竹叶兰。根据形态学观察和ITS基因序列同源性分析,大致分为7类,其中Phanerochaete sp.、Phyllosticta capitalensis、Diaporthe sp.、Hypoxylon sp.、Nodullsporium sp.、Chaetomium nigricolor各一株,其余10个菌株均属于Colletotrichum sp.,说明Colletotrichum sp.为竹叶兰内生真菌的一大优势种。通过对其中5种内生真菌的抗氧化活性进行测定(DPPH自由基清除法、Fe~(3+)还原能力法及H_2O_2自由基清除法),得到具有较强抗氧化活性的2种菌株BSSF-2及YNLF-1(对DPPH自由基的清除率≥80%),经鉴定菌株BSSF-2为Colletotrichum karstii,菌株YNLF-1为Phanerochaete sp.。本研究结果表明,药用植物内生真菌在寻找新型抗氧化药物的方面具有广阔前景。     

浓香型白酒酒醅可培养真菌的分离、鉴定及系统发育分析

对四川浓香型白酒酒醅可培养真菌进行分离、鉴定,并做系统发育分析。运用ITS1-5.8S rRNA-ITS2序列可将部分菌株鉴定到种的水平,可培养丝状真菌优势菌为曲霉属(Aspergillus sp.)、红曲霉属(Monascus sp.)、根霉(Rhizopus sp.)。26S rRNA D1/D2序列可将所有分离酵母鉴定到种的水平,可培养酵母优势菌为假丝酵母属(Candida sp.)和毕赤酵母属(Pichia sp.)。     

银杏叶内生真菌抑菌菌株筛选

本试验从四川绵阳银杏叶中分离得到480个内生真菌菌株，按经典系统分类方法分为子囊菌Ascomycota、胶孢炭疽菌Colletotrichum gloeosporioides、球壳孢科Sphaeropsidaceae、炭疽菌属Colletotrichum sp．、毛壳菌属Chaetomium sp．、黑孢霉属Nigrospora sp．、交链孢属Alternaria sp．和拟盘多毛孢属Pestalotiopsis sp．八大类，其中子囊菌为银杏叶内生真菌的优势菌群，占总菌株数的46．3％。对八大类内生真菌进行抑制细菌活性检测，结果得出2株球壳孢科菌和2株胶孢炭疽菌对大肠杆菌、绿脓杆菌和金黄色葡萄球菌都具有较好的抑制作用，尤其是对大肠杆菌的抑制效果最好。     

海巴戟天(诺尼)果内生细菌的初步分离与鉴定

首次对采自我国海南三亚市诺尼植物果实内生细菌进行初步分离与鉴定研究,相关研究为诺尼果内生菌研究奠定基础。采用传统微生物学分离培养方法对28℃培养条件下分离得到的15株细菌进行16S rDNA扩增和系统发育分析。研究表明,分离得到的15株诺尼果内生细菌分属于变形菌门(Proteobacteria)、厚壁菌门(Firmicutes)和放线菌门(Actinobacteria)3个类群,包括甲基杆菌属(Methylobacterium sp.)、鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas sp.)、芽孢杆菌属(Bacillus sp.)、节杆菌属(Arthrobacter sp.)、棒杆菌属(Corynebacterium sp.)、考克氏菌属(Kocuria sp.)和链霉菌属(Streptomyces sp.)7个属的11个已知种。研究结果表明,诺尼果中内生细菌具有较为丰富的多样性,获得了一批应用前景广泛的诺尼果内生细菌资源。     

柽柳核纤孔菌分子鉴定及基于ITS序列的系统发育分析

在对形态特征进行初步鉴定的基础上,对河南省郑州市分离的柽柳核纤孔菌6-27菌株的rDNA ITS区段进行克隆测序,并对ITS序列进行核酸序列数据库GenBank同源性检索比对.将从GenBank检索获得的22个相关分类元真菌的ITS序列连同柽柳核纤孔菌6-27菌株ITS序列一起用于系统发育分析,结果表明:形态鉴定与ITS序列分析结果一致,测定菌株为柽柳核纤孔菌.供试的23份材料被聚为6个类群,其中7个核纤孔菌属菌株和1个纤孔菌属菌株被聚在类群A;另一个来自南半球阿根廷的Inocutis jamaicensis 4508与来自印度的Fomitiporella caryophylli CBS 448.76被聚类在类群B,与类群A为大姊妹类群,与类群C为小姊妹类群;类群C包括2个Fulvifomes真菌;纤孔菌属,木层孔菌属,Mensularia,Fuscoporia等不同属菌株被聚类在类群D,E和F.相关分类元系统发育分析支持核纤孔菌为独立的属分类单元,Fulvifomes属分类地位比较稳定,纤孔菌属与木层孔菌属真菌具有较大的异质性,其分类地位有待于进一步规范和统一.     

蓝莓内生真菌分离纯化及其生物抗性初步研究

从贵州麻江蓝莓种植基地的"粉蓝"蓝莓的健康组织(茎、叶、果实)中分离出41株内生真菌,经分类鉴定为8个菌属,优势属为钉孢属(Passalora sp.);与5株病害菌进行对峙试验发现,内生真菌BB01、BL22、BF27、BF40及BF41可抑制全部5种病害菌生长;使用上述内生真菌次级代谢产物粗提取物进行菌丝生长试验,BB01、BL22、BF27、BF40及BF41次级代谢产物粗提取物含药平板浓度为500μg/mL时对病害真菌生长抑制率均超过90%,表现出显著的抗病害真菌活性;采用PCR扩增内生真菌rDNA-ITS序列构建系统发育树,BF41鉴定为刺盘孢属Colletotrichum sp.,BF40鉴定为苍白尾孢属Pallidocercospora sp.,BL22、BF27、BB01鉴定为枝孢菌属Cladosporium sp.。     

西沙野生诺尼种子内生真菌的群落多样性

采用种子表面灭菌、菌种分离与纯化、ITS rDNA和26S rDNA D1/D2区序列测定和系统发育分析方法,对西沙野生诺尼种子内生真菌群落多样性进行了初步研究。从诺尼种子中共分离到内生真菌48株,其中酵母菌39株,霉菌9株;39株酵母菌分属于4个属内的5个种,其中榛针孢酵母(Eremothecium coryli)、Pseudozyma aphidis和浅黄隐球酵母(Cryptococcus flavescens)为优势种,分别占总菌株数的31.25%、27.08%和16.67%;9株霉菌分属于4个属内的4个种,其中Phaeoacremonium sp.和赤霉属(Gibberella sp.)是霉菌中相对优势的种,分别占总菌株数的8.33%和6.25%。研究结果表明,西沙野生诺尼种子中存在大量内生真菌,且种类丰富,其中酵母菌占绝对优势,部分优势种具有潜在的药用价值。     

烟草种子携带病原真菌的分离与鉴定

采用无菌滤纸培养烟苗的方法对贵州主栽的4个烤烟品种裸种进行了带菌检测,并对种子携带真菌进行了分离与鉴定。结果表明,K326、贵烟4号、韭菜坪2号和南江3号的种子带菌率分别为15%、77.78%、21.67%和61.39%。分离和鉴定发现种子携带的真菌有链格孢菌属（Alternaria sp.）、拟茎点霉属（Phomopsis sp.）、支顶孢属（Acremonium sp.）、柄孢壳属（Zopfiella sp.）、曲霉属（Aspergillus sp.）、镰孢菌属（Fusarium sp.）、青霉菌属（Penicillium sp.）、赤霉菌属（Gibberella sp.）、芽枝孢菌属（Cladosporium sp.）、离蠕孢属（Bipolaris sp.）和Stagonosporopsis cucurbitacearum等。获得40株真菌中共有22种真菌,优势菌群主要为链格孢属、芽枝孢菌属、镰孢菌属和赤霉菌属。链格孢菌属在4个烤烟品种上均有发现。镰孢菌属主要来自于贵烟4号、韭菜坪2号和南江3号,其中南江3号种子上最多。芽枝孢菌属仅来自贵烟4号。贵烟4号和南江3号种子上的真菌种类和数量较多。这些种子携带真菌的发现对烤烟种子的生产与加工具有重要的意义。     

一株丹参种子内生真菌ZJZD-3的分离鉴定及其生物活性

目的:从丹参种子中分离纯化内生菌,筛选具有抑菌、抗氧化、抗凝血活性的菌株进行分子鉴定。方法:采用平板分离法从丹参种子中分离内生菌;采用平板对峙法和滤纸片法筛选具有抑菌效果的内生菌,采用DPPH法测定内生菌抗氧化活性,兔耳缘静脉取血测定内生菌抗凝血活性。结果:从白花丹参种子中分离出11株内生真菌和2株内生细菌,从紫花丹参种子中分离出9株内生真菌和9株内生细菌。其中,一株内生真菌ZJZD-3发酵液对丹参病原菌4和6均有抑制作用,抑制率分别为70.1%和59.6%;内生真菌ZJZD-3具有很好的抗氧化能力,其0.5 mg/mL乙醇粗提液对DPPH清除率为91.44%;内生真菌ZJZD-3对于内源性、外源性凝血途径都具有一定的延长作用,并且内源性凝血途径最为明显,对家兔凝血酶时间(TT)、凝血酶原时间(PT)、活性部分凝血酶时间(APTT)的延长率分别为48.48%、12.38%和34.44%。该菌株经鉴定为篮状菌属(Talaromyces sp.)。结论:内生真菌ZJZD-3具有很好的抗丹参病原菌、抗氧化和抗凝血能力,为丹参药效成分的工业化开发以及丹参的绿色规模化栽培提供新的途径和方法。     

苍耳内生真菌的分离鉴定及抗菌活性研究

从植物苍耳中分离内生真菌,选出8株进行抑菌活性测定,有6株对番茄早疫病菌抑制率大于50%。菌株SC008对5种植物病原菌的抑制率均大于50%。对内生真菌SC008进行形态学观察及ITS序列鉴定,初步判定菌株SC008归属于黑孢霉属(Nigrospora Zim.)。碳氮源实验表明,SC008在以乳糖和蔗糖为碳源及以酵母提取物和牛肉膏为氮源的培养基上生长良好。     

红豆杉内生放线菌的分离及活性菌株的筛选与鉴定

通过组织匀浆法分离红豆杉(Taxus chinensis)根、茎、叶3个部位的内生放线菌,采用滤纸片法初步研究了内生放线菌发酵液的抑菌活性,并对抑菌活性明显的菌株进行了分子鉴定。结果表明,分离纯化得到内生放线菌55株,抑菌活性试验中共有21株表现出了不同程度的拮抗作用,占全部分离菌株的38.2%,其中4株具有明显的抑菌活性。经16SrDNA序列分析,初步鉴定3株为链霉菌属(Streptomyces sp.),1株为小单孢菌属(Micromonosporasp.)。     

杨梅贮藏期真菌的分离鉴定及基于ITS序列的聚类分析

目的 分离并鉴定杨梅贮藏期真菌。方法 通过稀释涂布平板分离法以及划线纯化, 从贮藏期杨梅果实中分离、纯化真菌菌种, 并结合传统形态学与ITS (internal transcribed spacer)全序列分析对其进行准确鉴定。结果 最终鉴定出共14株真菌, 其中1株毛霉(Mucor racemosus)、1株白地霉(Geotrichum candidum)、 1株腐皮壳属霉菌(Diaporthe sp.)、1株好食链孢霉(Neurospora sitophila)、3株出芽短梗霉(Aureobasidium pullulans)、4株酵母菌(Pichia kudriavzevii, Pichia terricola, Hanseniaspora opuntiae, Saccharomycopsis crataegensis)以及3株青霉(Penicillium sp., Penicillium expansum, Penicillium herquei)。从进化关系上看有3类显示较近的亲缘关系, 第1类为青霉属, 第2类为出芽短梗霉, 第3类为毕赤酵母。结论 结合传统形态学与ITS全序列分析可对杨梅贮藏期真菌进行更为准确的鉴定。     

烟用底料变质原因及致香成分变化分析

为探明烟用底料变质的原因,对底料的微生物种群、菌落数量及致香成分进行了分析。利用分离培养基从正常紫云底料、变质紫云底料、正常软珍底料、变质软珍底料中分离、鉴定细菌和真菌,得到28株细菌和1株真菌。真菌仅有酵母菌属(Saccharomyces sp.),细菌分属于12个属,包括芽孢杆菌属(Bacillus sp.)、微杆菌属(Microbacterium sp.)、鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas sp.)、勒克菌属(Leclercia sp.)、不动杆菌属(Acinetobacter sp.)、短波单胞菌属(Brevundimonas sp.)、土壤杆菌属(Agrobacterium sp.)、青枯菌属(Ralstonia sp.)、醋酸杆菌属(Acetobacterium sp.)、燕麦菌属(Acidovorax sp.)、类鼻疽菌属(Burkholderia sp.)、肠杆菌属(Enterobacter sp.)。变质紫云底料中微生物菌落总数是正常紫云底料微生物菌落总数的90倍,变质软珍底料微生物菌落总数是正常软珍底料微生物菌落总数的29倍。对微生物菌落总数的动态变化进行了追踪调查,结果表明,烟用底料在室温条件下6 d即可变质。利用气相色谱-质谱联用仪对正常和变质底料致香成分及含量(质量分数)进行检测,发现变质后的底料致香成分及含量变化较大。在紫云底料中β-二氢大马酮、δ-二氢大马酮含量变化最大,薄荷醇在变质紫云底料中没有检测到;软珍底料中辛酸、癸酸、癸酸乙酯、δ-二氢大马酮、β-二氢大马酮含量变化最大,辛酸乙酯、薄荷醇、烟酮、苯甲醛、α-二氢大马酮在变质软珍底料中没有检测到。     

水-碱连续提取黄皮疣柄牛肝菌粗多糖的理化性质及抗氧化活性研究

以黄皮疣柄牛肝菌Leccinellum crocipodium(Letellier.)Watliag为原料,采用水提醇沉法从黄皮疣柄牛肝菌子实体中提取得到水提粗多糖(LPS),再用碱提醇沉法从菌渣中提取得到碱提粗多糖(LPJ),研究两种黄皮疣柄牛肝菌粗多糖理化性质与抗氧化活性。结果表明:水提粗多糖LPS与碱提粗多糖LPJ得率分别为18.44%±1.30%与5.50%±0.69%。LPS呈海绵状,颜色呈浅咖色;LPJ呈蓬松粉末状,颜色呈黄褐色。LPS多糖含量、糖醛酸含量、硫酸根含量、总酚含量均显著高于LPJ(P<0.05)。LPS与LPJ抗氧化活性随着浓度的增加而逐渐增强。LPS、LPJ浓度为4 mg/mL时,DPPH自由基的清除率(87.55%±0.51%、54.31%±2.72%)、羟基自由基清除率(54.53%±1.61%、46.50%±0.64%)、ABTS阳离子自由基清除率(81.56%±4.43%、68.79%±1.23%)、还原力吸光度值(1.41±0.02、1.16±0.01)均达到最大值,而浓度为3 mg/mL时,超氧阴离子自由基清除率(89.16%±2.42%、85.94%±2.98%)达到最大值。说明LPS与LPJ具有较好的抗氧化能力,且LPS优于LPJ。