木聚糖酶Xyn43A基因在大肠杆菌及毕赤酵母中的表达比较

根据木聚糖酶Xyn43A基因序列,设计特异性引物,以p MD18-T-Xyn43A重组质粒为模板克隆Xyn43A成熟肽基因,将该基因分别克隆到大肠杆菌表达载体p ET-28a和毕赤酵母表达载体p PIC9K中,分别在大肠杆菌BL21及毕赤酵母GS115中表达。重组酶在大肠杆菌中胞内表达,比酶活力可达61.43 U/mg。重组酶在毕赤酵母中分泌表达,比酶活力可达145.24 U/mg。酶学性质显示,BL21-Xyn43A、GS115-Xyn43A重组酶最适温度、p H相同均为45℃、p H 5.0。GS115-Xyn43A温度稳定性、p H稳定性均优于BL21-Xyn43A。     

酿酒酵母孢子作为GLP-1载体的研究

胰高血糖素样肽-1(Glucagon-like peptide-1,GLP-1)的口服给药研究已成为目前抗糖尿病研究领域的热点之一。本文通过对GLP-1进行基因改造和优化,并以酿酒酵母孢子作为保护和运输载体,将GLP-1表达到酿酒酵母孢子内,使GLP-1能在口服给药过程中抵抗胃肠道消化酶的降解以提高其生理活性。结果表明,GLP-1被成功表达到酿酒酵母孢子内,表达GLP-1的孢子经模拟肠胃液处理后与胰岛β细胞MIN6细胞共培养可显著提高MIN6细胞胰岛素分泌量。本研究利用酿酒酵母孢子作为载体,提高了GLP-1的抗酶解能力和促胰岛素活性,为进一步开发治疗糖尿病口服药物奠定了基础。     

产油核桃内生细菌乙酰辅酶A羧化酶acb基因克隆及优化表达北大核心CSCD

为了探究细菌异质性乙酰辅酶A羧化酶β亚基生物活性及其对乙酰辅酶A羧化酶酶活影响,以高产油核桃内生细菌B.subtilis HB1310基因组DNA为模板,利用PCR技术扩增其乙酰辅酶A羧化酶羧基转移酶β亚基(β-CT)基因(acb基因),构建pET-28a-acb载体并在E.coli BL21中表达,进一步对乙酰辅酶A羧化酶acb基因的诱导表达条件进行了优化。结果表明:乙酰辅酶A羧化酶acb基因在E.coli BL21中实现了表达,分子质量在25~35 kDa之间;重组蛋白最佳诱导表达条件为诱导剂异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)浓度1.0 mmol/L、诱导时间6 h、诱导初始pH 8.0,在此条件下工程菌的乙酰辅酶A羧化酶活性可达(4.11±0.03) U/mL,较野生菌提高39.7%。综上,乙酰辅酶A羧化酶β-CT为具有较好生物活性的乙酰辅酶A羧化酶亚基。     

新型GH5家族β-甘露聚糖酶的基因挖掘及表达鉴定

为了获得性能优良的新型β-甘露聚糖酶,本研究采用基因挖掘技术从米曲霉(Aspergillus oryzae)RIB40基因组中挖掘到了2个假定的新型GH5家族β-甘露聚糖酶基因,分别命名为Aoman5A和Aoman5B。对这两条序列做了相关的生物信息学分析,同时借助p PIC9KM质粒将两个酶的成熟肽编码基因在Pichia pastoris GS115中实现了表达,并对表达产物进行了纯化和鉴定。生物信息学分析的结果表明Ao Man5A含有20个氨基酸残基的信号肽,而Ao Man5B含有21个氨基酸残基的信号肽和12个氨基酸残基的前导肽;序列比对的结果显示两个酶与目前已报道的序列最高的同源性分别为68%和79%,且Ao Man5A的N端还携带有一个1家族的CBM;三维结构预测的结果显示,两者均符合(α/β)8的TIM-桶状结构。表达鉴定的结果表明,在同样表达条件下,re Ao Man5A和re Ao Man5B上清液的酶活力分别为2.9、12.5 IU/m L;纯化后它们的酶比活力分别为8.3、104.2 IU/mg,前者的最适温度为35℃,而后者的最适温度为50℃,p H值特性的测定结果表明这两种酶均为酸性酶。硫酸-苯酚法测得re Ao Man5A和re Ao Man5B的糖含量分别为25.4%和12.6%,表明这两种重组酶均经过了糖基化修饰。本研究获得了两种新型的β-甘露聚糖酶,比较分析了它们的序列特征,并实现了它们的异源表达,为β-甘露聚糖酶的进一步研究及应用奠定了坚实的基础,也为其他新型酶的基因挖掘提供了可资借鉴的经验。     

重组牛乳铁蛋白肽衍生肽设计及其在毕赤酵母中的表达

利用抗菌肽数据库和生物信息学分析工具,基于抗菌肽结构和功能的关系,设计了LFcin B衍生肽LFcin B-W4,10。为了验证衍生肽设计的合理性及表达产物功能正确性,将优化设计的基因序列经限制性内切酶酶切后,用T4 DNA连接酶连接到分泌型表达载体p PIC9K中,获得的重组表达载体p PIC9K-LFcinB-W 4,10经线性化后电转入毕赤酵母GS115中,经过G418浓度梯度筛选得到高拷贝转化子。经PCR鉴定,目的基因与酵母基因组稳定整合。阳性转化子经体积分数为2. 5%的甲醇诱导表达,表达产物用Tricine-SDS-PAGE检测到相对分子质量约为3. 2 k Da的衍生肽LFcin B-W4,10。每24 h取样检测发酵上清液抑菌活性,结果表明,抗菌肽LFcin BW4,10对金黄色葡萄球菌具有良好的抑菌活性,诱导表达96 h时其抑菌圈直径最大。实验为探究牛乳铁蛋白肽功能-结构关系奠定了基础。     

牛乳铁蛋白肽衍生物的设计及其在毕赤酵母中表达与活性分析

本文利用抗菌肽数据库以及蛋白质分析软件等工具,根据抗菌肽结构与功能的关系,对牛乳铁蛋白肽衍生肽(LfcinBD)的结构进行优化设计。将设计得到的LfcinBD基因片段与pPIC9K质粒构建重组表达载体,线性化后电转化毕赤酵母细胞GS115,利用甲醇诱导表达。实验对发酵上清液进行了分离纯化和活性测试,SDS-PAGE电泳检测到了目标蛋白的有效表达。实验还对优化设计得到的牛乳铁蛋白肽衍生肽与同等发酵条件下产生的天然牛乳铁蛋白肽的抑菌活性进行了对比分析,结果证明该衍生肽对金黄色葡萄球菌有更强的抑菌活性。研究表明经色氨酸Trp替换的牛乳铁蛋白肽中第10,14位氨基酸获得的牛乳铁蛋白肽衍生肽具有很好的抑菌活性,实验为进一步探究牛乳铁蛋白肽衍生肽生物活性的改进奠定了基础。     

染料木黄酮对星形胶质细胞氧化损伤中Nrf2/ARE通路相关因子表达的调节作用

目的 研究染料木黄酮(Gen)对β淀粉样肽25-35(Aβ25-35)介导的星形胶质细胞氧化损伤中Nrf2/ARE通路相关因子的调节作用.方法 以星形胶质细胞(C6细胞系)作为研究对象,用Aβ25-35染毒制备氧化损伤模型.实验共分4组:对照组、Aβ组(Aβ模型组)、Gen干预组(Gen+ AB组)及Gen组(Gen单独处理组);采用RT-PCR方法和Western Blot方法检测星形胶质细胞核因子E2相关因子2(Nrf2)、血红素加氧酶(HO-1)、γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶催化亚单位(GCLC)及锰超氧化物歧化酶(MnSOD)基因和蛋白的表达.结果 与Aβ组比较,Gen干预组和Gen组星形胶质细胞Nrf2、HO-1、GCLC及MnSOD基因和蛋白表达水平显著上调(P＜0.05).结论 染料木黄酮可能通过调控Nrf2/ARE通路来拮抗Aβ325-35介导的星形胶质细胞氧化损伤作用.     

耐热β-半乳糖酶在乳酸克鲁维酵母及毕赤酵母中的表达研究

将嗜热脂肪芽孢杆菌来源的耐热β-半乳糖酶基因bgaB分别插入穿梭质粒pKLAC1、pPIC9k的α-因子信号肽下游,构建bgaB基因的乳酸克鲁维酵母真核表达载体pKLAC1-bgaB及毕赤酵母真核表达载体pPIC9k-bgaB。载体经酶切线性化后采用电击方法分别转化到乳酸克鲁维酵母K.lactis GG799及毕赤酵母GS115中,并通过同源区各自整合到宿主基因组中。重组酶进行镍柱纯化、Western Blot杂交鉴定及酶学性质分析。结果表明,耐热β-半乳糖苷酶在酵母表达系统中可以实现外源表达且热稳定性保持良好,但不能被酵母系统有效分泌。     

小麦低聚肽对HepG2细胞胆固醇代谢的影响

目的:在对小麦低聚肽的基础理化成分和分子量分布进行分析的基础上,观察不同浓度的小麦低聚肽对人肝癌细胞株HepG2胆固醇代谢的影响。方法:将培养的HepG2细胞随机分为5组:对照组、2、4、6、8g/L小麦低聚肽实验组。经小麦低聚肽作用24h后,进行反转录-聚合酶链反应(RT-PCR),定量分析低密度脂蛋白受体(LDLR)和3-羟基-3-甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶(HMGCR)mRNA的表达。结果:与对照组相比,经小麦低聚肽作用后,各实验组HepG2细胞LDLR mRNA表达明显增加(p0.05或p0.01),其中6g/L小麦低聚肽组的LDLR mRNA表达增加最多;HMGCR mRNA表达均降低,2、4、6g/L小麦低聚肽组的HMGCR mRNA表达极显著降低(均为p0.01),其中2g/L小麦低聚肽组的HMGCR mRNA表达降低最多。结论:不同浓度的小麦低聚肽均能升高HepG2细胞内LDLR mRNA水平和降低HMGCR mRNA水平,从而起到降低胆固醇的作用,为其开发利用提供了一定的实验依据和理论基础。     

血红素氧合酶-1介导海参蛋白肽对脂多糖诱导RAW264.7巨噬细胞炎症反应的抑制作用

为研究海参蛋白肽对脂多糖(LPS)诱导小鼠RAW264.7巨噬细胞炎症反应的抑制作用及作用机制,本研究利用LPS刺激RAW264.7巨噬细胞建立炎症模型,采用Griess法测定细胞一氧化氮(NO)含量,实时荧光定量PCR测定细胞内诱导型一氧化氮合酶(i NOS)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白介素-1β(IL-1β)、白介素-6(IL-6)以及血红素氧合酶-1(HO-1)m RNA表达。结果表明,海参蛋白肽以浓度依赖效应显著抑制LPS诱导RAW264.7巨噬细胞NO生成以及TNF-α、IL-1β、IL-6和i NOS m RNA表达(p0.05),显著提高细胞内HO-1 m RNA表达(p0.05)。HO-1抑制剂锌原卟啉Ⅸ(Zn PP-Ⅸ)部分逆转海参蛋白肽对LPS诱导RAW264.7巨噬细胞炎症反应的抑制作用。具有抗炎活性的海参蛋白肽富含甘氨酸、谷氨酸和天冬氨酸,分子量180~1000 u的组分为72.12%。这些结果说明海参蛋白肽通过上调细胞HO-1 m RNA表达发挥抑制LPS诱导RAW264.7巨噬细胞炎症反应的作用。     

EGFP-Arg7融合蛋白表达及在HeLa细胞中的转导活性

目的 构建pET-28a-EGFP-Arg7重组子,观察表达的融合蛋EGFP-Arg7在细胞内的转导活性.方法 构建EGFP-Arg7(阴性对照为EGFP)序列,与pET-28a连接后,转化Ecoli BL21(DE3),IPTG诱导表达,并经Ni2+.NTA纯化.纯化产物作用于HeLa细胞后用荧光显微镜观察其转导活性.结果 重组pET-28a-EGFP-Arg7经酶切鉴定和序列分析,证明构建正确.转化E.coil BL21(DE3)后,重组蛋白获得可溶性表达.纯化后的融合蛋白纯度达90%以上.重组蛋白EGFP-Arg7作用于HeLa细胞后用荧光显微镜可观察到强绿色荧光.结论 Arg7具有很好的转导活性,能携带与其连接的蛋白质穿过HeLa细胞膜.     

密苏里游动放线菌葡萄糖异构酶基因xylA的克隆及其表达条件的优化

为克隆、表达密苏里游动放线菌葡萄糖异构酶(GI)基因xylA,并对其诱导表达条件进行初步优化。采用Slowdown PCR方法克隆得到密苏里游动放线菌(Actinoplanes missouriensis)CICIM B0118(A)的葡萄糖异构酶基因xylA,构建pET-28a(+)-xylA 表达载体,并转化至E. coli BL21 (DE3),经异丙基-β -D- 硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,并对其表达产物进行SDS-PAGE 电泳。结果表明,融合蛋白分子质量约为45kD。在诱导时间9h、0.6mmol/L IPTG、30℃和OD600nm 值为0.8 的最适培养条件下,酶比活力最高达到62.42U/mL。     

大豆球蛋白A1a酸性多肽的原核表达及纯化

为建立大豆球蛋白免疫检测方法及致敏机理的深入研究提供基础材料,人工合成了大豆球蛋白A1a酸性多肽基因的cDNA序列,通过聚合酶链式反应(PCR)和Bam HI、Kpn I双酶切构建了原核表达载体pET30a-A1a,将重组质粒转化大肠杆菌(E.coli)BL21后用异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导表达。SDS-PAGE分析表明,A1a酸性多肽融合蛋白能以可溶蛋白形式进行分泌表达,并且诱导5h后,A1a酸性多肽融合蛋白表达量达到最高。经His亲和层析纯化,获得纯度达90%的融合A1a蛋白,分子质量大小约为38kD。Western blotting显示,所获得的A1a融合蛋白能与对豆粕过敏的仔猪血清发生免疫反应,表明所获得融合蛋白具有免疫活性。     

圆弧青霉BD26碱性脂肪酶基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

采用反转录聚合酶链式反应(RT-PCR),以圆弧青霉BD26总RNA为模板,扩增出774 bp cDNA片段,将该基因片段克隆到表达载体pET-28a(+)上并转化Escherichia coil BL21(DE3),得到重组菌株BL21/ Lip PD。经IPTG诱导,菌体在固体琼脂显色平板上形成明显透明圈。SDS-PAGE电泳显示该脂肪酶分子质量约为27 ku。表达条件优化结果表明,当工程菌培养至OD_(600)为0.5时,加入IPTG至终浓度为1.0 mmol/L,在32℃诱导培养1 h,比酶活达29.30 U/mg。     

一种新型凋亡素融合蛋白的克隆表达及活性测定

目的克隆表达EC-SOD3-凋亡素融合蛋白,并检测其生物活性。方法PCR扩增出apoptin序列,与表达载体EC-SOD3-pET-28a连接后在大肠杆菌BL21(DE3)中经IPTG诱导,表达产物进行Ni2+-NTA纯化和MTT活性检测。结果表达载体pET-28a-EC-SOD3-apoptin经酶切鉴定和序列分析,证明质粒构建正确,转化E.coliBL21(DE3)后,重组蛋白获得表达,Ni2+-NTA纯化后的凋亡素融合蛋白纯度达到85%以上,经噻唑蓝(MTT)法测定具有活性。结论成功构建了表达载体pET-28a-EC-SOD3-apoptin,并在大肠杆菌中表达了EC-SOD3-凋亡素融合蛋白,纯化的蛋白质具有诱导HeLa细胞凋亡的能力。     

一种新型凋亡素融合蛋白的克隆表达及活性测定

目的 克隆表达EC-SOD3-凋亡素融合蛋白,并检测其生物活性.方法 PCR扩增出apopfin序列,与表达载体EC-SOD3-Pet-28a连接后在大肠杆菌BL21(DE3)中经IPTG诱导,表达产物进行Ni2+-NTA纯化和MIT活性检测.结果 表达载体Pet-28a-EC-SOD3-apoptin经酶切鉴定和序列分析,证明质粒构建正确,转化E. Coli BL21(DE3)后,重组蛋白获得表达,Ni2+-NTA纯化后的凋亡素融合蛋白纯度达到85%以上,经噻唑蓝(MTT)法测定具有活性.结论 成功构建了表达载体Pet-28a-EC-SOD3-apopfin,并在大肠杆菌中表达了EC-SOD3-凋亡素融合蛋白,纯化的蛋白质具有诱导HeLa细胞凋亡的能力.     

马槟榔甜蛋白基因(MabinlinⅡ)的密码子优化及其在大肠杆菌中的表达

本研究根据大肠杆菌密码子的偏好性,对马槟榔甜蛋白基因MabinlinⅡ(A链+B链)的密码子进行优化,并将优化后的马槟榔甜蛋白基因命名为MabinlinⅡ(AB)Plus。将MabinlinⅡ(AB)Plus基因与大肠杆菌表达载体pET-28a(+)片段连接,构建重组表达载体pET-28a(+)-MabinlinⅡ(AB)Plus,进而转化到大肠杆菌宿主表达菌株BL21(DE3),IPTG诱导蛋白表达。结果表明,密码子优化后的基因MabinlinⅡ(AB)Plus在大肠杆菌中最佳表达条件为:最适IPTG浓度1.4 mmol/L,最佳诱导剂温度为37℃,最适菌株起始生长量OD₆₀₀为0.7,最佳诱导时间8 h。在最佳诱导表达条件下,目的蛋白表达量占菌体总蛋白约33.0%,与优化前约有提高7%。目的蛋白的上清液经过亲和纯化,在19 kDa处有单一的目的条带。经过感官评定,目的蛋白的甜度约为2%标准蔗糖溶液的400倍。这为研发以马槟榔甜蛋白为基础的新型甜味剂提供了科学的理论依据。     

单核细胞增多性李斯特菌p60蛋白表达条件的优化

在成功构建重组表达载体pET-28a-p60 和获得重组宿主菌E.coli BL21(DE3)的基础上,对重组宿主菌E.coliBL21(DE3)进行表达p60 蛋白条件的优化研究。结果表明：将重组大肠杆菌培养至OD600nm 达0.7～0.8 左右时,加入浓度为1mmol/L 的异丙基-β-D- 硫代吡喃半乳糖苷(IPTG),在摇床温度为25℃,转速为150r/min 条件下诱导表达6h,可得到重组表达的p60 蛋白占总蛋白的比例为42.32%,其中可溶性蛋白占总p60 蛋白的比例为85.36% 左右,为p60 蛋白诱导表达的最优条件。     

不同质粒表达大肠杆菌碱性磷酸酶的研究

目的比较以pET-30a和pET-22b两个质粒表达碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,AP)的活性差异。方法以质粒pET-30a-AP为模板,克隆大肠杆菌(Escherichia coli,E.coli)ATCC 25922的碱性磷酸酶成熟肽基因,并构建重组表达质粒pET-22b-AP。将这2种表达质粒转化到E.coli BL21(DE3)中,经IPTG诱导表达AP。对温度和甲醇对AP活性的影响进行研究。结果 pET-30a-AP所产AP浓度约为pET-22b-AP 10倍时,才可达到类似催化效果;表达自pET-22b-AP质粒的AP对甲醇的耐受性略好于pET-30a-AP。结论本研究可为AP的生产及基因工程抗体-AP融合蛋白在类似ELISA等免疫检测方法的应用提供重要的参考依据。     

纳豆激酶基因的克隆表达以及活性分析

应用PCR的方法从分泌纳豆激酶的枯草杆菌基因组DNA中扩增得到全长为1056bp的前导肽+成熟肽纳豆激酶原基因(pro-NK),并构建了纳豆激酶的重组表达载体pET-28a-pro-NK;转化E.coliBL21(DE3)后,在IPTG的诱导下实现了纳豆激酶的高效表达,经SDS-PAGE显示在28ku处有一特异带;表达产物经Ni2+亲和层析纯化后,纤维平板法测得的纳豆激酶的比活力为34245.1IU/mg;纯蛋白经透析和冷冻干燥处理后,纳豆激酶的比活力为16271.5IU/mg;在此基础上,对冻干保护剂的添加进行优化,最佳保护效果为甘露醇与纳豆激酶质量比为1:2,可比不加保护剂时比活力提高了30.9%。这可为基因工程方法生产纳豆激酶纯品,稳定其活性便于贮运,并将其开发成为临床药物提供技术参考。